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污水中手性氧氟沙星的分析方法研究 摘要 本文建立了两步固相萃取净化和液相荧光检测分析环境污水中 手性氧氟沙星的分析方法。采用安捷伦t c c 1 8 液相色谱柱，用含有 4m m o l lc u s 0 4 和5m m 0 1 几1 i s o l e u c i n e 的甲醇水溶液作流动相对氧 氟沙星进行手性分离。首先采用弱阳离子交换柱( w c x ) 对氧氟沙 星进行富集，然后采用强阴离子交换柱( m a x ) 对样品做净化处理， 氧氟沙星的回收率在9 5 以上，每种单体的最低定量限为o 0 8 鹏几。 研究结果表明，上述前处理方法可以有效去除样品基质的干扰，环境 样品的定量采用外标法。液相荧光法( l c f l ) 所测实际样品的总浓 度与液相色谱串联四级杆质谱( l c m s m s ) 所测结果相一致。 为了确证所建分析方法的可行性，本文选择了北京市两处污水 处理厂的进、出水为研究目标，测得实际水样中氧氟沙星总浓度为 4 8 8 1 0 6 7n g l ，。在所测实际样品中，左氧氟沙星的浓度为3 9 3 9 1 0 n g l 远大于右氧氟沙星的8 3 1 7 5n g l ，这与实际医疗使用情况相一 致。 关键词：氧氟沙星，手性，固相萃取，高效液相色谱，污水 i i i t h ea n a l y t i c a lm e t h o dr e s e a r c ho nc h i r a l o f l o x a c i ni ns e w a g e a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，ar o b u s ta n a l y t i c a lm e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e da n d v a l i d a t e df o rt h et r a c ea n a l y s i so fo f l o x a c i ne n a n t i o m e r si ns e w a g eu s i n g t w o - s t e ps o l i dp h a s ee x t r a c t i o np u r i f i c a t i o na n dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y w i t hf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n ( l c - f l ) o n o x a c i ne n a n t i o m e r sw e r e s e p a r a t e do na na 9 1 i e n tt c - c 一1 8c o l u m nu s i n gm e 0 h w a t e rc o m a i n i n g 4m m o l lc u s 0 4a n d5m m o l ll i s o l e u c i n ea sm o b i l ep h a s e t h e o n o x a c i ne n a n t i o m e r sw e r ef i r s te x t r a c t e db yaw e a kc a t i o n - _ e x c h a n g e r e s i n ( w c x ) ，t h e nm r t h e rp u r i f i e db ym i x e dm o d eo fa n i o n 乇x c h a n g e r e s i n ( m a x ) ，r e s u l t i n gi no n o x a c i nr e c o v e r i e sg e n e r a l l ya b o v e9 5 t h e l i m i to f q u a n t i f i c a t i o nw a so 0 8 “g lf o re a c he n a n t i o m e r i no r d e rt oc o n f i r mt h eu t i l i t yo ft h el c f lm e t h o d o l o g yf o r a n a l y s i so f e n v i r o n m e n t a ls a m p l e s ，s e w a g es a m p l e st a k e n 仔o mt w os t p s ( s e w a g e t r e a t m e m p l a n t s ) o fb e i j i n g w e r ed e t e m i n e d t o t a l c o n c e n t r a t i o n so fb o t he n a m i o m e r s ，w i t har a n g eo f4 8 8 10 6 7n g l m u c hh i 曲e rc o n c e n t r a t i o n so f ( s ) 一o f l o x a c i n ( 3 9 3 91on g l ) t h a n ( r ) o n o x a c i n ( 8 3 17 5 n g l ) o c c u l l r e di na l lo ft h es a m p l e s ，w h i c hi s i v a c c o r d a n c ew i t ht h e i ru s a g ei nm e d i c a lt r e a t m e n t k e yw o r d s ：o f l o x a c i n ，e n a n t i o m e r s ，s o l i dp h a s ee 灶r a c t i o n ，h i g h p e r f o m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r 印h y ，w a s t e w a t e r v 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：妇= ：生垒= 日期：棚。厂- 珈 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名：。 导师签名： 相、3 。扯， 董莲誊 日期川 日期：二? 8 辱f 日也二! 第一章文献综述 第一章文献综述弟一早义陬琢怂 随着人类对环境问题的日益重视，药物与环境之间的关系也受到了人们越来 越多地关注【1 10 1 。患者使用的药物通常随尿液或粪便排泄出体外，这些药物残留 物可能含有完整的活性成分，具有或不具有生物学效应的分解产物( 代谢产物) 。 在城市社会，随着下水道系统的发展日趋完善，通常这些从患者体内排泄出来的 药物残留物最终会进入污水( 废水) 处理工厂( s t p ) ，过期或废弃的药物同样 也通过厕所最终到达了s t p 。根据s t p 标准的不同，这些药物残留物可能不同 程度地进入工厂的出水口，最终释放到地表水的接受者处。随着全球药物制品消 耗量的不断增加，不难预计，在未来的2 5 年内地表水中药物残留物的含量将会 增加3 倍。因此，环境中的药物残留物，以及其他环境污染物质，对全球可持续 发展战略的现实形成了巨大的挑战。 药品和个人护理用品( p h a n l l a c e u t i c ma 1 1 dp e r s o n a lc a r ep r o d u c t s ，缩写为 p p c p s ) 的概念是c l l r i s t i a i lg d a u g h t o n 在1 9 9 9 年e n v i r o r u i l e n t a jh e a l t h p e r s p e c t i v e s 的一篇综述中首次提出【1 1j ，这类物质包括各种处方药和非处方药， 如抗生素、类固醇、止痛药、降压药、避孕药、催眠药和减肥药等，肥皂、香波、 牙膏、香水、护肤品、防晒霜、发胶、染发剂等【1 2 】。据估计目前正在使用的p p c p s 约3 0 0 0 余种，全世界年生产总量在百万吨以上【l3 1 ，其数量与农药相当。有关药 物对环境及人类的影响已不容忽视，其中对饮用水质量的潜在影响尤为突出【， 目前使用量大危害大且研究较多的一类物质还属抗生素类药物。 1 1 环境中抗生素的主要研究现状 抗生素和人工合成抗菌药物用于人和动物感染性疾病的治疗，但广泛使用所 造成的细菌耐药性已不容忽视。据统计，金葡菌对青霉素g 的耐药率己达9 0 ， 一种耐药性极高、致病力极强的耐甲氧西林金葡菌( m r s a ) 己增至3 9 7 ，成 为医院内严重细菌感染的主要致病菌。另外，导致严重社区感染的耐药菌株耐青 霉素肺炎链球菌( p r s p ) 亦发展迅速，由该耐药菌感染致死的病例逐年增多。 我国大城市医院分离率己达2 2 5 ，美国高达3 3 5 。2 0 世纪8 0 年代，合成喹诺 酮类抗菌药物上市时，临床十分敏感、耐药菌株几乎为零；但经2 0 年的广泛使用， 耐药率迅速上升；卫生部细菌耐药监测网显示2 0 0 6 2 0 0 7 年度大肠杆菌对其耐药 性高达7 0 ，给临床治疗带来新的困难；食用动物广泛使用氟喹诺酮类抗菌药预 防疫病，对氟喹诺酮类抗菌药产生耐药性的问题尤为重要【l4 。f a o w h o o i e 连 续发布了一系列针对细菌抗生素耐药性监测指导性文件供有关成员国使用，并且 北京化工大学硕士学位论文 在国际食品法典委员会( c a c ) 成立细菌抗生素耐药性特别工作组以协调成员国 制定专门的国际控制标准。这些耐药菌不仅在人和动物体内发现，调查表明一些 抗药菌或者抗多种抗生素的病原菌不但存在于畜禽养殖场与城市污水厂、部分土 壤和沉积物中，也存在于一些比较干净的湖泊和饮用水中【1 5 ，1 6 j 。研究抗生素和抗 药菌的污染状况和环境行为己成为许多发达国家目前的重要课题。 在环境水体中研究比较热门的抗生素类药物包括喹喏酮类的氧氟沙星和环 丙沙星，四环素类药物的研究也越来越受到重视。一些文章已经报道了利用液相 色谱连接不同的检测器来对抗生素类药物进行研究，不过目前使用较多的是液相 色谱串联质谱法。图1 2 表述了最近几年利用液相色谱串联质谱法对水中的抗生 素类药物进行研究的成果【j 。 图1 1 过去几年里有关利用液相色谱串联质谱法对水中的抗生素类药物研究的文章 f i g u r el le v o l u t i o no fa r t i c l e sd e a i i n gw i t ht h ed e t e n n i n a t i o no f a j l t i b i o t i c si nw a t e r b yl c m sa n dl c m s 2p u b l i s h e di nt h el a s tf e wy e a r s 在研究的这些药物中，其中有一大部分为手性药物，目前5 0 以上的手性药 物以外消旋体的形式用于动物饲养和临床使用【l 引，也就是说非单一对映体的使用 仍然占有相当的比例，这些药物使用后经过不同的途径进入环境，使得环境介质 中可能存在不同程度的手性药物的对映体。因此，考虑到这些物质生理和药理的 选择性，研究不同手性药物对映体的迁移转化行为和对生态环境的潜在危害具有 一定的现实意义。 手性( c h i r a l i t y ) 是宇宙间的普遍特征，手性化合物虽然原子组成相同，但 是在立体结构上互为镜像。人们已经认识到，两个手性异构体的差别关乎人的生 死【l9 1 。尽管预知不同对映体可能具有完全不同的生物活性，但目前生产和使用的 第一章文献综述 大部分手性化学物质仍为外消旋体【2 0 1 。手性物质进入生态环境被生物摄取后，其 各个对映体在体内的活性、代谢和毒性存在着很大差异，它们在环境中的持久性 通常也存在着差异。长期以来，在研究手性污染物的环境行为、生态效应及潜在 的毒性时，都把外消旋体污染物视为单一化合物。几乎所有的环境法则也把手性 化合物当成单一化合物，这种法规的科学性将会远远低于它的期望值【2 1 1 。因而弄 清单一对映体的环境行为，在对映体水平上研究手性污染物的环境行为是非常重 要的。近1 0 多年来，手性化合物的色谱拆分技术迅速发展，为在对映体水平上 研究手性污染物的环境行为奠定了技术基础。 1 2 手性药物 1 2 1 手性药物的基本概念 含有手性特征的药物称作手性药物，对映体在对称的环境中，物理化学性质 完全相同；但在非对称的环境中，例如在偏振光中，对映体对偏振光面旋转方向 相反；在生物系统中与酶或受体相互作用时，由于蛋白质分子的非对称性，与对 映体的识别方向和结合位点不同，导致生物活性的差异。非对映体之间，彼此属 于不同结构的化合物，所以物理化学和生物学性质均不相同。 对映体之间，除了使偏振光发生偏转的程度相同而方向相反之外，其他理化 性质相同。因此，对映体又称为光学异构体。非对映体则包括了几何异构体和具 有光学活性但没有镜像关系的立体异构体。 最常见的手性中心是碳原子，氮、硫和磷原子若满足手性条件，也可成为手 性中心，因而这些杂原子构成的手性物质也会有两种不同的r 和s 构型，形成 对映体或非对映异构体。 其他的手性因素有手性平面、手性轴等，另外叔胺和取代联苯具有不稳定的 手性因素。 1 2 2 手性药物的表示方法 ( 1 ) 左旋体和右旋体能使偏振光的偏振面按顺时针方向旋转的对映体称 为右旋体( d e x t r o t a t o 巧) ，在药名前用d 一或( + ) 一表示；反之，称为左旋体 ( 1 e v o r o t a t o 巧) ，在药名前加1 一或( 一) 一表示。外消旋体( r a c e m a t e ) 则是由等 量的左旋体和右旋体构成，没有旋光性，在其药名前用d 1 一或( ) 一表示。这种 表示方法，直观地反映了对映体之间光学活性的差别，但是不能提供药物分子三 维空间排列或绝对构型的信息。 北京化工大学硕士学位论文 ( 2 ) d 和l 系统以标准参照物的化学相关性来确定药物的立体化学构型。 标准参照物有糖类如d 一甘油醛，氨基酸如l 丝氨酸。在i 汛x h c 型光学异构 体中，取其主链竖向排列，以氧化态较高或1 号碳原子置于上方，照f i s h e r 投影， 在所得投影式中x 在右边者称为d 型，如d 一( + ) 一甘油醛；x 在左边者称为l 型，如l 一( 一) 一甘油醛；外消旋体表示为d l 一甘油醛。 ( 3 ) r 和s 系统将手性中心的取代基按原子序数依次排列，a b c d ，把 d 作为手性碳原子的顶端，a 、b 、c 为四面体底部的3 个角，从底部向顶端方向 看，若保持从大到小基团按顺时针方向排列者，称为r 型，若为逆时针方向排 列者，称为s 型。 a b c d s | ，- 饥a n t i o m e rj 譬e n a n t i o m e r 1 3 手性药物的常见分离方法 用于手性分离分析的方法有很多，从分离技术上看主要分为间接分离法和直 接分离法。间接分离法是利用外消旋化合物与一个手性试剂反应生成一对非对映 体，而后利用它们之间物理、化学性质的差异将其分离；直接分离法的理论依据 一个是英国科学家d a l g i e s h 于1 9 5 2 年提出三点作用原理，并被普遍接受及扩展； 另一个是手性包容色谱理论【2 2 1 。手性分离与分析技术近年来发展迅速，主要手段 有气相色谱、高效液相色谱和毛细管电泳等。 1 3 1 气相色谱法( g c ) 用于对映体混合物分析最受青睐的方法之一是手性气相色谱，它是最早用于 手性分离的方法，这种灵敏的方法不受痕量杂质影响，快捷而又便于操作，它的 原理是基于分子缔合可能导致充分的手性识别，因而产生对映体拆分，它使用含 有高纯对映体拆分辅助剂的手性固定相，要分析的对映体与固定相发生快速和可 逆的相互作用，其分离度取决于分析样品与固定相的相互作用强弱。 与其他研究立体化学的方法相比，手性分离g c 有以下优点：可以确定复 杂混合物中少量组分的绝对构型；绝对灵敏度高，而且与官能团无关；对 手性杂质的检测限较底( 低于l ) ；可以使用线性范围宽的通用检测器； c s p s 可以分离所有挥发性化合物；g c 柱寿命长，可达数年之久。当然，这种 4 第一章文献综述 手性g c 也有其不足之处，不宜分离低挥发性、强极性或分子量大的化合物。虽 然c d 衍生物本身具有较高的热稳定性，但在高温下( 大于2 4 0 ) 还是会失去手 性分离的功能。 1 3 2 高效液相色谱法( h p l c ) 利用h p l c 来研究对映体拆分始于2 0 世纪7 0 年代后期，现己成为对映体拆分 强有力的手段之一。h p l c 拆分对映体有直接和间接两种方法。对映体以手性试 剂衍生，形成非对映异构体，再以常规方法分离，称为间接法；对映体不加处理， 直接用手性流动相( c m p ) 或手性固定相( c s p ) 分离，称直接法，使用时应根 据具体情况进行选择。手性固定相法的研究发展异常迅速，大量的各种固定相继 研制成功，并开展了有关作用机理的研究。c s p 可分为以下几类： ( 1 ) 配体交换色谱c s p l 2 3 ld a v a n k o v 等首次用配体交换色谱拆分d l 脯氨 酸；还将l 脯氨酸键合到树脂上，经吸附c u ( i i ) 、n i ( i i ) 或z n ( i i ) 后，拆分了氨 基酸对映体；后来，他们还以交联聚苯乙烯为载体，以l 一氨基酸为固定配体， 合成了多种手性固定相。上述固定相虽然对对映体选择性强，但疏水性太高，使 氨基酸在色谱过程中传质困难，因此，人们又选用了亲水性聚合物如交联聚丙烯 酰胺、交联聚甲基丙烯酸酯和交联聚乙烯胺，虽然实现了d l 一氨基酸的快速拆 分，但机械强度较差。直到g u b i t z 等人使手性配体与硅胶结合，终于将亲水性、 高选择性和高强度的优点集于一体。 ( 2 ) “刷型c s pm i k e s 等首先报道了一电荷转移接受体四硝基一9 一亚 芴基氨基氧化丙酸( t a p a ) 键合到氨丙基硅烷化硅胶上制得的手性“刷型 c s p ， 并分离了螺烯对映体。p i r k l e 在这方面又做了大量指导性的工作，提出了“互为 相反作用原则”、“插入和非插入过程”、“直接目标设计等思想；并且制备了 许多c s p ，如第一个丌一碱性的“刷型c s p 、一酸型的n 一( 3 ，5 一d n b ) 甘氨 酸衍生物c s p 、亮氨酸衍生物c s p 、乙内酰脲类兀一碱型c s p 和脲链型固定相等。 此外，仅靠形成氢键的作用而拆分的固定相也有不少报道，它们能拆分各种含有 可形成氢键位置的外消旋体。含多个手性中心的“刷型 c s p 已经商品化并被普 遍使用，如o i 等【2 4 】报道的酰基化的氨基酸和菊酸为手性选择剂的c s p 等。w e l c h l 2 5 j 还报道了一个可模印的刷型c s p 。 ( 3 ) 大环c s p 包括经修饰的环糊精、手性冠醚和大环类抗生素作为手性选 择剂的c s p 。a n i l s t r o n g 等人对c d 键合固定相的发展作出了杰出的贡献，基于含 氮原子c d 键合相的缺点，他们【2 6 】发展了一种不含氮的c d 键合相，将0 一c d 的 2 一位羟基用甲基或乙酰基官能团化，一些在b c d 键合相中不能得到完全分离 的化合物在衍生化的b c d 柱上得到了很好的分离；还成功地开发了q c d 的 北京化工大学硕士学位论文 键合相、制备了一系列酰基和异氰酸酯衍生化的b c d 、合成了( r ，s ) 一2 和( s ) 一2 一羟基丙基的b c d 固定相等。 ( 4 ) 蛋白质c s ps t e w a n 和d o h e r t y 首次将牛血清白蛋白( b s a ) 键合到琼 脂糖上并在其上成功地拆分了d l 一色氨酸；其后有人将q 一酸性糖蛋白【2 7 j ( q a g p ) 和b s a 化学键合到硅胶载体粒子上用于h p l c 手性拆分。目前已经报道 的被用作h p l c 手性分离的蛋白质有b s a 、h a s 、伴清蛋白( c o n ) 、黄素蛋白、 q a g p 、胰蛋白酶、卵类粘蛋白( o v m ) 、抗生物素蛋白( a v i ) 、溶菌酶、 q 一胰凝乳蛋白酶( q c h t ) 、纤维素水解酶一i ( c b h i ) 和鸡蛋白抗生物 素结合蛋白( i 讧b p ) 等。 此外，还有聚合物c s p ( 包括天然的多糖衍生物如纤维素、淀粉及合成的手 性聚合物制备的c s p ) 和分子印模c s p 等。 手性流动相添加剂法( c m p a ) 按其添加剂类型或分离原理可分为以下几种 类型： ( 1 ) 手性包含复合手性包含复合经常采用的添加剂是环糊精和手性冠醚。 该方法己用于分离氨基酸及其衍生物、巴比妥类等。采用的固定相常为o d s 、 c n 、c 8 、苯基、硅胶等，检测手段主要是u v 检测器。 ( 2 ) 手性配合交换手性配合交换主要是将手性金属配合剂加入到h p l c 流 动相中，形成的三元非对映体配合物，由于结构稳定性和能量的差异，与固定相 发生立体选择性吸引或排斥反应，从而使两对映体得以分离。常用的手性配合试 剂多为氨基酸及其衍生物，如l 一脯氨酸、l 一苯丙氨酸等。配位金属有c u 2 + 、z n 2 + 、 n i 2 + 、c d 2 + 等。该法已用于分离氧氟沙星、氨基酸及其衍生物、苯妥类代谢物等。 ( 3 ) 手性离子对正相离子对色谱广泛用于药物对映体的拆分，其基本原理 是在低极性的有机流动相中，对映体分子与手性离子对试剂之间产生静电，氢键 或疏水性反应生成非对映体离子对。常用的手性反离子有奎宁、奎尼丁、1 0 一樟 脑磺酸、n 一苯甲酰氧基羰基一甘氨酰一l 一脯氨酸。使用的固定相有硅胶、c n 、 d i o l 等。 ( 4 ) 动态手性固定相将少量甲基化环糊精、( 2 r ，3 r ) 一双一正丁基酒石酸 吸附于固体填充剂表面，使固定相表面手性化；还有将表面活性剂如胆酸盐加到 流动相中，在色谱过程中形成由非胶束胆酸盐溶剂化的o d s 和胆酸盐胶束吸附于 o d s 组成的非均态手性固定相。 此外，还有手性氢键试剂、蛋白质复合物、手性诱导吸附等。 1 3 3 毛细管电泳法( c e ) 毛细管电泳是2 0 世纪8 0 年代以来新兴的一种分离分析技术，由于其高效、简 6 第一章文献综述 便、快速等特点而得到广泛应用。由于其不同的分离模式 如毛细管凝胶色谱 ( c g e ) 、胶束电动毛细管色谱( e k c ) 、等速电泳( i t p ) 、毛细管区带电泳 ( c z e ) 、毛细管电色谱( c e c ) 和许多手性选择剂而使c e 技术成为手性分离 分析的一个非常重要的工具。与色谱法相似，c e 法是基于对映体混合物与手性 移动相形成非对映体络合物而实现分离，其驱动力是电渗和电泳作用。与g c 和 h p l c 相比，c e 最大的优点是极高的分离效率，即使在分离因子极低的情况下， 也能达到很好的分离。已有许多手性选择剂成功地用于毛细管电泳进行手性分 离，主要包括： ( 1 ) 环糊精及其衍生物傅若农【2 8 】就此做了综述，捷克的s m o l k o v a k e u l e m a n s o v a 早期把c d 用于g c ，2 0 世纪8 0 年代中期从g c 转向c e ，她们主要 是把c d 用于i t p ，把c d 及其衍生物用作i t p 的前导电解质，c d 起着移动固定相 的作用。t e r a b e 用羧甲基一b c d ( b c m c d ) 作胶束，以m e c c 方法分离了许 多芳香族化合物异构体。意大利的f a l l a l i 将以c d s 为添加剂的等速电泳用于化妆 品的分析、毛细管区带电泳用于手性药物的分离，还采用m e c c 的电泳，以c d s 作胶束分离麻黄素等5 种手性药物，取得了优于捷克人的结果【29 。1 9 9 1 年t a l l a k a 等系统地比较了各种环糊精及其衍生物对7 种氨基酸对映异构体的分离能力。林 炳承等对1 2 3 种手性药物进行了拆分筛选工作，发现b 类c d 的分离能力最强，以 h p b c d 最为出色。s t a l c u p 等用c d 硫酸盐分离了约5 0 种手性化合物。t a i t 等 用丁磺酸基b c d 分离了胺类手性化合物。j i r a 等用硼酸盐一环糊精体系拆分二 醇对映体。g 僦m a l l 等用d m b c d 为手性选择剂分离了m e t a p r o t e r e n o l 对映体。 ( 2 ) 修饰型冠醚k u l l i l 首次将十八一冠一6 一四羧酸( 1 8 c 6 h 4 ) 作为手性选 择剂引入c e 中，冠醚拆分的主要对象是胺类化合物，其优点在于对无紫外吸收 的伯胺类对映体可采用间接紫外检测方法直接进行分离而无须衍生。此外，冠醚 和c d 的混合物在分离胺类化合物时存在着协同效应。 ( 3 ) 蛋白质用于毛细管手性分离的白蛋白有人血清白蛋白、牛血清白蛋 白、抗生物素蛋白、卵类粘蛋白、0 【。一酸性糖蛋白、纤维素二糖水解酶、粘多糖、 菌质纤维素酶、伴清蛋白、酪蛋白等。h a g i n a k a 等用胃蛋白酶键合柱分离了碱性 和电中性手性化合物。l i 等还用0 【。一酸性糖蛋白微粒填充毛细管电色谱分离了 一些手性药物。f e r e n c 用血清铁传递蛋白分离了4 种手性药物。t a n a k a 和t e r a b e 利用不连续灌注技术克服了一些手性药物分离中的检测问题。 ( 4 ) 抗生素类大环化合物这是一类相对新型的手性选择剂，主要有利托菌 素a 、t e i c o p l a n i n 、万古霉素、a 8 2 8 4 6 b 、利福霉素b 和利福霉素s v a 咖s t r o n g ， w a r d 等在这方面做了大量工作。 ( 5 ) 糖苷类d h u l s t 和v e r b e k c 最早将线性低聚糖麦芽糖糊精和玉米糖浆 北京化工大学硕上学位论文 作为手性选择剂对某些酸性手性药物进行了分离，s t a l c u p 和a g y e r i 用肝素和酸性 粘多糖作为手性选择剂进行研究。 ( 6 ) 金属离子配合物通常用c u ( i i ) 金属离子和l 型氨基酸或缩二氨酸的 络合物作为手性添加剂。 此外，还有手性杯环芳烃类化合物、微乳体系、麦角生物碱等。 1 3 4 其它分离分析方法 除上述几种最普遍的分离分析方法外，超临界流体色谱( s f c ) 法和薄层色 谱法也有不少报道。超临界流体色谱法在手性分析中的优势表现为【3 0 】：超临 界流体的粘度近于气体，比液体低得多，可减少过程阻力，采用细长色谱柱可以 增加柱效；超临界流体的密度与液体相似，因此它有强的溶解能力，适于分 离难挥发和热稳定性差的物质；s f c 系统既可使用h p l c 检测器，也可使用g c 检测器，如质谱、氢火焰离子化检测器；可作流动相的超临界流体物质较多、 易得，与h p l c 相比，对环境的污染及操作人员的毒害较小。因此可以有效地弥 补h p l c 和g c 在分离手性物质方面的不足，m o 嘶e r 等人于1 9 8 5 年首次用s f c 实现 手性分离。s f c 分离手性化合物可分为直接法和间接法两种，直接法包括使用手 性固定相和手性流动相。目前，手性固定相直接分离法是发展最快的领域。按手 性选择器的类型，c s p s 可分为氨基酸型、酰胺型、环糊精型、p i r k l e 型和多糖型 等。由于s f c 结合了g c 和h p l c 两者的长处，因而在食品、药物、农药、香料和 聚合物等的手性分离方面有良好的应用前景和巨大潜力。关于薄层色谱法的报道 不是很多，舢m s t r o n g 【3 l 】等把环糊精作为手性键合相用于薄层色谱；他们【3 2 】还在 聚酰胺薄膜上用c 【。一c d 分离了苯甲酸及其取代的位置异构体；黄慕斌等在聚酰 胺薄膜上，用b c d 分离了d n p t 印对映体和辛可宁、辛可尼丁以及硝基苯胺 的位置异构体。p e t t e r s s o n 等人以d 一1 0 一樟脑磺酸铵作为手性离子对试剂添加到 流动相中，用来分离芳香醇胺类药物对映体。d u n c a n 报道了在二醇板及高效硅胶 板上，以n 一苯甲酸羰基一2 一氨基乙酰基一脯氨酸及d 1 0 一樟脑磺酸铵为手性 离子对试剂添加到流动相中，共分离了苯丙醇胺等8 种药物对映体。李高兰、黄 慕斌等采用普通硅胶板，在低温下，以不同配比的二氯甲烷一甲醇混合液为流动 相，以d 一1 0 一樟脑磺铵为手性离子对试剂，有效地分离了芳香醇胺类药物对映 体拉贝乐尔及贝他乐克。 1 4 手性分离的意义 手性异构体的物理和化学性质相同，但是，在生理、药理活性以及与生物分 子相互作用方面可能有很大的区别。许多药物分子是手性分子，两个手性异构体 8 第一章文献综述 在药理活性上的差别甚至关系人的生与死。现在使用的杀虫剂2 5 是手性的，并 且呈渐增趋势【3 3 】，针对不同的手性对映体，对其进行相应的手性拆分并对其单一 体进行研究是非常重要的。 1 4 。1 手性分离在药效学上的意义 药物的手性对药效的影响只是程度上的差异，对映异构体在质和量上几乎相 等的情况极为少见，活性不等的现象较为普遍。如非甾体抗炎药2 一芳基丙酸 s 一构型强于r 一构型【3 4 】，b 一阻滞剂普萘洛尔( p r o p m o l 0 1 ) 阻滞动物的异丙肾 上腺素的心肌收缩力和频率反应，s 一构型比r 一构型强约1 0 0 倍；布洛芬 ( i b u p r o f e n ) 其镇痛作用s 一构型是r 一构型的2 8 倍；萘普生( n a p r o x e n ) 、噻吗 洛尔( f i m o l 0 1 ) 和吲哚洛尔( p i n d o l 0 1 ) 的s 一构型与r 一构型活性相差数倍【 j ， 但此类药物因一种对映体具有有效的药理活性，而另一种没有毒副作用，在临床 药理学特别是药动学研究中，不能忽视它们在药理作用上的差异。 两个对映体药理性质不同，或者其一有较大的毒副作用，在手性拆分中，这 类手性药物的拆分将是最为活跃的部分，在临床用药和新药开发中意义最大。反 应停造成了数千例短肢畸胎的药物灾难，后来发现其致畸作用是由s 一对映体所 致，s 一对映体的二酰亚胺环可因酶促水解而生成邻苯二甲腺谷氨酸，可渗透到 胎盘，干扰叶酸的合成，而r 一对映体不易与酶结合并不致畸，因而是安全有效 的【3 6 】。氯胺酮( k e t 锄i n e ) 是一种巴比妥类静脉麻醉药，其右旋体具有麻醉作用， 而左旋体可引起患者产生幻觉、情绪不稳定、心理失调等副作用【37 1 ，手性药物这 种药理作用上的差异，给医生在开处方上带来极大的困难和风险，也给患者带来 了巨大的痛苦，目前还有大量的此类药物以外消旋体给药。加强此类药物的拆分 研究，不但可以最大限度地减少副作用，还可以开发可靠的新药，同时也是进行 药物合理配伍的有力保证。 1 4 2 手性分离在环境行为研究方面的意义 目前国际上手性污染物对映体水平上的研究正处在：确认手性化合物，注意 不同对映体的分配，观察对映体被微生物、鱼类、鸟类和哺乳动物等选择性降解 的阶段。国内在这一领域的研究仅仅停留在分离和分析阶段。而目前这一领域有 待解决的问题包括环境中对映体降解的动力学，对映体变化的生物机理和污染物 对映体的选择性累积的毒性意义。 b u s e r 等人【3 8 】利用气质联用技术对污水处理厂中布洛芬药物的手性环境问题 进行了研究。对其在污水处理厂中的浓度以及代谢产物进行了测定，讨论了其降 解情况以及在活性污泥中的主要降解物，还进一步研究了布洛芬在湖泊水中的降 9 北京化工大学硕士学位论文 解，在地表水中的浓度调查情况。 f o n o 等人【3 9 】利用气质联用衍生法对普萘洛尔的手性环境存在形式和环境行 为进行了研究。普萘洛尔是美国使用量最大的处方药之一，它属于p 类阻断剂， 在欧洲地表水中检测出其浓度己达5 9 0n g l ，在欧洲和美国的废水中其浓度为 2 9 0 1 9 0 0n g l ，文章中主要以e f 值作为研究基础，通过e f 值的关系，研究其在 环境中的行为。该文研究的7 个污水处理厂中普萘洛尔的e f 值都明显低于o 5 ，在 活性污泥系统里检测到了普萘洛尔，通过对比，发现在地表水的微生物实验中( 2 0 天内) e f 值没有发生明显变化。当实验测得的e f 值为0 5 左右时，表明所测水样 没有经过任何处理；如果e f 值0 4 2 ，表明该水样已经经过了处理，不是原始水。 e f 值的计算公式为： 肛面而等鬻裂面 l e n a n t l o m e f 重i 十i e n a n t l o l n 爨rz i n i k o l a i 【4 0 】和m a c l e o d 等人【4 l 】对多种b 类阻断剂的手性拆分及其环境效应做 了非常详细的研究工作，这些表明了目前手性药物的分离及其环境效应研究是很 热门的课题。 1 5 环境中氧氟沙星的研究现状 大量的文章已经报导了抗生素类药物【1 1 ，4 2 埘】和耐药性基斟4 5 4 8 】在环境中的 水平。氧氟沙星是全球人类以及兽医使用非常广泛的一种抗生素，它被用来预防 和治疗一些细菌感染疾病。据估计2 0 0 2 年氧氟沙星在中国的生产量约为1 2 0 0 吨 【4 9 1 ，使用后有超过7 0 的氧氟沙星以原型排放【5 0 ，5 1 1 ，是环境中产生耐药基因的 主要物质之一。针对氧氟沙星的使用量大，对环境带来的风险大，所以在研究的 环境药物中，氧氟沙星自然成为了热门问题。 氧氟沙星在环境中的含量很高，不管是在河流水、地表水还是污水处理厂中， 可以说是无处不在，而且由于污水处理厂对氧氟沙星的去除效果不是很理想，直 接威胁着人类的饮用水源。污水中针对氧氟沙星的研究已经很多，表1 1 中详细 概括了最近几年污水中氧氟沙星的研究方法。 l o 第一章文献综述 表1 1 环境样品中测定氧氟沙星所采用的方法 1 r a b l e1 1s e l e c t e dm e t h o d st 0d e t e r m i n eo n o x a c i ni ne n v i r o 啪e n ts a m p l e s 化合物研究基质 前处理方法 分离方法检测手段 参考文献 w w t p ss p e o a s i sh l b ， l ccl8 l c m s m s i n f l u e n t s ，e 用u e n t se n v + ，c l8 ，m c x ( 12 5 m m 2 o m m ， ( q q q ) ，m i 蝴 【5 2 】 a n dr i v e rw a c e rc a r t r i d g e s5 p m ) g r o u n d ，s u r f a c e ，a n d s e w a g ei n f l u e n ta 1 1 d s p e - o 雒i 5h l b e m u e n tw a t e r s l c l c m s m s z o r b a x x d b c 1 8 ( q q q ) ，m r m 5 3 】 ( 5 0 2 1m m ，5 p m ) d i g e s t e dd ：w 警d 叭烹：篇， l cl c - m s m s 【5 4 】 s l u d g ea n dp e l l e t s l l q u l c i s o i l d l e x t r a c t i o n s e w a g et r e a t m e n t p l a m s ( s t p s ) s p e o a s i sh l b ， l c l c m s ，m s f e l u t i o n ：4 m l z 。r b a x x d b c 1 8 e s i + m i 。m ； 【5 5 】 m e t h a n o l ( 5 0 2 1m m ，5 邮1 ) s e w a g et r e a t m e n t s p e - o a s i s p l 肌t s ( s t p s ) h l b ( 6 0 m g ) a n d 氧氟en(merck 2 0 0 m g ) 沙星 s e w a g ei n f l u e n t 锄d e f l l u e mw a c c r s s p e o a s i s w c x ( 15 0 m g ) s e w a g et r e a t m e m s p e o 弱i sh l b p l a l l t s ( s t p s ) l cc 8 ( l u 地l c m s 惝 【5 6 】 5 0 2 0 m m ，3 p m ) ( q q q ) ，m r m 。 l cz o r b a x - s b c 8 ( 1 2 5 2 1 m m ， 5 岬) l c z o r b a x s b - c 1 8 ( 2 5 0 m m 3 o m m ， 5 岬) 三= ；即，e s i 十m r m l 。 l c - m s m s ( e s i + ，m r m ) 【5 8 】 l c - e s i t o f s e w 曩g et r e a t m e n t s p e - o a s i sm c x l cl c m s m s 【5 9 】 p l a n t s ( s t p s ) l i c h r o l u te n ( 2 0 0 m 曲 r i v e rw a t e r w w t p s w w t p s s p e - o a s i sh l b ( 6 0 m g3 m 1 ) s p e m p c ( s t p a u l ，m n ) u p l c ( 5 0 2 1 m m ，1 7 扯m ，a c q u 时c 1 8 ) l c y m c o d s - a q s - 3 ( 4 0 5 0 m m ) 呻l 挈 【6 0 】 f 。 l c - m s 【6 1 】 l c f l d 。 北京化工大学硕士学位论文 迄今为止的大部分环境行为研究都是将手性药物作为单一物质进行解析，氧 氟沙星的研究也不例外，这样做的结果可能会在某种程度上掩盖了对映体在生物 可利用性、毒性等方面的区别，从而导致相应物质生态风险的误判。因此，为了 更准确更细致地了解手性药物的迁移转化规律，有必要对环境中该类物质的归趋 和毒性差异进行研究。 1 6 选题的目的和意义 针对环境中氧氟沙星的研究已经很多【5 2 6 1 1 ，相关的研究主要集中在消旋化合 物的研究，有关的手性分离主要集中在药物的分析方面，由于分析样品前处理方 法的限制，目前还未有针对环境中氧氟沙星手性分离的分析方法的报道。氧氟沙 星是使用非常广泛的一种手性抗生素，有两个具有不同的抗菌活性光学异构体， 左氧氟沙星的活性是右氧氟沙星的8 1 2 8 倍【6 2 捌】。手性消旋体对环境动植物的影 响也不一样，所以，通过对手性药物的环境单一消旋体的测定，人们才能更好的 了解不同单体的作用机理以及它们对环境中动植物所带来的风险，因而建立一套 环境水体中手性氧氟沙星对映体的分析方法是很必要的，也是很有意义的。 本文研究并开发了一套全新的针对环境水体中氧氟沙星的前处理方法，利用 液相荧光发对单一消旋体进行浓度调查，所得结论为环境污染物的风险评估提供 了依据。 1 7 本课题研究的主要思路 药物对环境的危害已经引起了人们的高度重视，但是环境中手性污染物对映 体选择性行为的研究历史不长，由于手性异构体在生理、毒性与生化等方面的不 同，该类物质的对映体选择性行为已愈来愈成为国际环境科学界研究的焦点。 本课题研究的总体思路为：建立氧氟沙星分子的手性分离方法。采用 h p l c 对氧氟沙星分子进行手性分离，用荧光检测器进行检测。通过条件优化， 使手性氧氟沙星分子得到基线分离。建立氧氟沙星分子的前处理方法。环境 样品基质的复杂性对本文前处理方法的建立带来了很大的考验，通过对氧氟沙星 分子性质的研究，利用固相萃取前处理技术，建立一套有效的氧氟沙星分子前处 理方法，采用液相色谱串联四级杆质谱对该前处理方法进行评价。利用所建 前处理方法对实际水样进行富集净化，并用所建分离分析方法对净化后的水样进 行检测。最后用所建的整套方法对环境水体中氧氟沙星的浓度进行调查，并对其 环境行为进行研究。研究结果具有一定的理论意义和实际应用价值。 1 2 第二章氧氟沙星手性分离液相色谱法的建立 第二章氧氟沙星手性分离液相色谱法的建立 氧氟沙星手性分离的方法已有很多，液相色谱法【6 5 螂】、毛细管电泳法等， 最常用的还是液相色谱法。本文采用液相色谱进行分离，荧光检测器进行检测， 相比以前的紫外检测器灵敏度有了很大的提