（农业昆虫与害虫防治专业论文）afmnpv诱导的sl1凋亡细胞中凋亡体的检测.pdf

： ： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) ，是一种自主的、有序的，并按照某种预定程序发生的生 理性自然死亡过程，是当前生命科学研究中的热门领域之一。凋亡体( a p o p t o s o m e ) ， 是在线粒体介导的凋亡途径中，由细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ，c y tc ) 、a t p d a t p 、 凋亡酶激活因子1 ( a p o p t o t i cp r o t e a s ea c t i v a t i n gf a c t o r - 1 ，a p a f - 1 ) 以及p r o c a s p a s e 9 ( c a s p a s e 一9 的前体) 构成的约7 0 0k d a 、具有很强的c a s p a s e 酶激活活性的大分子 蛋白复合物，它能使p r o c a s p a s e 一9 自剪切成两段而被活化为c a s p a s e 9 ，进而切 割和活化下游的效应c a s p a s e 3 ，启动c a s p a s e 级联反应，导致不可逆的细胞凋 亡。研究表明，哺乳动物细胞发生的线粒体凋亡途径中有凋亡体的存在，并在胚 胎发育中起至关重要的作用。本文即对昆虫的凋亡细胞中凋亡体的存在与否进行 了初步的研究。 病毒感染是一种常见的引起细胞凋亡的因素，本实验以杆状病毒a f m n p v 诱 导昆虫细胞s 1 1 发生凋亡，分别采用d a p i 染色法、琼脂糖凝胶电泳法、荧光分 光光度法、w e s t e r nb l o t t i n g 等方法检测了凋亡细胞的形态学与生物化学特性、 c a s p a s e 9 活性及凋亡体复合物的存在与否。 用a f m n p v 感染s 1 一l 细胞不同时间，d a p i 染色与琼脂糖凝胶电泳结果均显 示，杆状病毒感染s l 一1 细胞8h 后，能诱导发生细胞凋亡。由于凋亡体形成后， 首先激活c a s p a s e 9 ，因此我们采用荧光分光光度法，使用c a s p a s e 一9 的特异性荧光 底物a c l e h d a f c 和c a s p a s e 9 特异性抑制剂z l e h d f m k 检测凋亡细胞的 c a s p a s e 一9 的活性，结果表明，在a t m n p v 诱导s 1 1 细胞8h 后即可检测出 c a s p 2 u s e 一9 的活性，并在a 压n p v 诱导s 1 1 细胞2 4h 时c a s p a u s e 一9 的活性达到最 高值。为了进一步检测凋亡细胞是否有凋亡体的产生，我们又用w e s t e mb l o t t i n g 分 析了凋亡体复合物的蛋白质组分，结果显示，以a 伍。口v 诱导s 1 1 细胞6h 后能 检测到组成凋亡体的蛋白质，但1 2h 后相应的蛋白质组分消失。以上这些研究结 果表明，a f m n p v 能诱导s 1 1 细胞凋亡，并初步认定昆虫细胞凋亡与哺乳动物细 胞一样也有凋亡体的存在。 关键词：细胞凋亡；凋亡体；凋亡酶激活因子一l ；细胞色素c ；c a s p a s e 9 a b s t r a c t a p o p t o s i si s ak i n do fi n d e p e n d e n t ，o r d e r l ya n da c c o r d i n gt os o m es c h e d u l e d p r o g r a mo fn a t u r a ld e a t hp r o c e s s a p o p t o s i s i so n eo ft h em o s tp o p u l a rf i e l di nl i f e s c i e n c e m a n yr e l a t e ds t i m u l ic o m i n gf r o mi n t r a c e l l u l a ro re x t r a c e l l u l a rr e s u l ti nt h e r e l e a s i n go fc y t o c h r o m ec t h e nt h ec ”o c h r o m ecq u i c k l yc o m b i n e sw i t ht h ea p o p t o t i c p r o t e a s ea c t i v a t i n gf a c t o r - l ( a p a f - 1 ) 。芦& p | a p a n dp r o c a s p a s e 一9 ，w h i c hf o r m s a m u l t i m e r i cp r o t e i nc o m p l e x ( - 7 0 0k d 曲c a l l e da p o p t o s o m e t h ea c t i v a t i o no fc a s p a s e - 9 s u b s e q u e n t l yt r i g g e r sac a s c a d eo fe f f e c t o rca s _ p a s ea c t i v a t i o n ，l e a d i n gt oa p o p t o t i cc e l l d e a t h i t sv e r yi m p r o t a n tf o rm i t o c h o n d r i a ls i g n a lp a t h w a ya n de m b r y o n i cd e v e l o p m e n t i nm a m m a l i nt h i sp a p e r , t h ee x i s t e n c eo fa p o p t o s o m eo fi n s e c t sh a sb e e np r e l i m i n a r y r e s e a r c h e d v i r u si sac o m m o ni n d u c t i o nf a c o ro fa p o p t o s i s i nt h i ss t u d y , s i - 1c e l l sw e r e i n d u c e db ya f m n p vw h i c hi sak i n do fb a c u l o v i r u s d a p is t a i n ，a g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v e ，a n dw e s t e mb l o t t i n gh a v eu s e dt od e t e c tt h e c h a r a c t e r i s t i c so fm o r p h o l o g ya n db i o c h e m i s t r y , t h ea c t i v i t yo fc a s p a s e 一9 ，a n dt h e e x i s t e n c eo fa p o p t o s o m er e s p e c t i v e l y t h ed a p is t a i na n da g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i si n d i c a t e dt h a tc e l la p o p t o s i sh a v e h a p p e n e da f e r8hw h i c hi n d u c e db ya 心心口vc a s p 舔e - 9w i l lb ea c t i v a t ef i r s t ，o n c et h e a p o p t o s o m eh a sf o r m e d t h e r e f o r e ，w e u s et h e s p e c i f i c f l u o r e s c e n c es u b s t r a t e ( a c l e h d - a f c ) a n ds p e c i f i ci n h i b i t o r s ( z l e h d f m k ) o fc a s p a s e 一9t od e t e c t t h e a c t i v i t yo fc a s d a s e 9 t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ea c t i v i t yo fc a s p a s e 一9w a s m e a s u r e da f e r 8hw h i c hi n d u c e db ya f m n p v , a n dt h ea c t i v i t yi n e a s e dt ot h em a xa t2 4h i no r d e r t o d e t e c tt h ee x i s t e n c eo fa p o p t o s o m e ，w eu s ew e s t e r nb l o t t i n gt oa n a l y z et h ep r o t e i n c o m p o n e n to fa p o p t o s o m e t h ep r o t e i n st h a tc o m p o s et h ec o m p l e xc a n b ed e t e c t e da f e r 6hw h i c hi n d u c e db ya f m n p v , a n dt h e nt h e yd i s a p p e a r e da t12h t h e s ea b o v er e s u l t s p r e l i m i n a r ys h o wt h a t ，a sm a m m a l i a nc e l la p o p t o s i s ，i n s e c tc e l la p o p t o s i sa l o sh a v et h e a p o p t o s o m ef o r m a t i o n k e yw o r d s ：a p o p t o s i s ；a p o p t o s o m e ；a p a f - 1 ：c y tc ；c a s p a s e 一9 u ，f 、 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：彳锰移移 、 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意华中 师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的 作者签名：? 甚7 豫 导师签名 容。 允许北京万方数据电子出版社出版的中国学位论文全文数据库将本人论文 以电子、网络、镜像及其他数字媒体形式公开出版。 作者签名：格弗穆 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a m s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程 中的 规定享受相关权益。园童途塞握童卮进蜃! 垦垒生；旦二生；旦三生筮查! 作者签名：z 压节绝 日期：护f 年月7 日 导师签名： 日期：刁c 日 ： 硕士学位论文 m a s t e r s 丁h e s i s 1 1 细胞凋亡概述 上- - l 刖看 1 1 1 细胞凋亡 人体内细胞的死亡分为生理性和病理性的两种，有关细胞死亡过程的研究， 已成为生物学与医学的热点问题。至今为止，人们已经知道细胞的死亡至少有 两种方式，即细胞坏死( n e c r o s i s ) 与细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 。细胞坏死是早已被 认识的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年才逐渐被认识的一种细胞死亡 方式。 早在1 9 6 5 年澳大利亚科学家k e r r 等【1 】科学家就发现，结扎鼠门静脉后，通 过电镜观察发现，肝实质组织中有一些散在的死亡细胞的溶酶体并未遭到破坏， 而是出现细胞体积收缩、染色质凝集，并从其周围的组织中脱落，而后被吞噬， 机体无炎症反应，这显然不同于细胞坏死。1 9 7 2 年k e r r 等【1 , 2 1 _ - - 位科学家首次 提出了细胞凋亡的概念，宣告对细胞凋亡的真正探索的开始。 细胞凋亡是指为了维持内环境的稳定和正常的生理活动，由基因控制的、 细胞自主的、高度有序的死亡过程【l 】。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡是 一个主动的过程，它涉及到一系列基因的激活、表达以及调控等作用，并不是 病理条件下的被动自体损伤，而是为了更好地适应生存环境而主动争取的一种 死亡过程。 1 1 2 细胞凋亡与细胞坏死的区别 虽然细胞凋亡与细胞坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有极大 的差异。表1 列举了其主要区别。 ： ： 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s l s 性质 诱导因素 死亡范围 细胞体积 细胞膜 染色质 溶酶体 细胞器 凋亡小体 能量 基因组d n a 新蛋白合成 基因调控 炎症反应 意义 生理性或病理性，特异性 较弱刺激，并非随机发生 多为散在的单个细胞 变圆，缩小 完整 凝聚成半月形 相对完整 无明显变化 有 耗能的主动过程 有控降解 有 有 无 生理性死亡 病理性，非特异性 外界强烈刺激，随即发生 多为成群的大片细胞 增大 破碎 稀疏成网状 破损，内含物外溢 破损外溢 无 不耗能的被动过程 随机降解 无 无 引起局部炎症反应 病理性死亡 1 1 3 细胞凋亡的生物学特征 形态学方面【3 刁】，电镜下观察，初始阶段，胞浆浓缩，细胞器聚集，细胞体积缩 小，从周围细胞脱离开；紧接着，染色质凝集成月牙状，依附于核膜周边，细胞核 固缩，核膜核仁破碎；之后，细胞膜不断出芽，形成泡状突起，而细胞膜仍然完整， 最终将凋亡细胞包裹成凋亡小体，无内含物外溢，因此不引起周围炎症反应，凋亡 小体可迅速被周围吞噬细胞吞噬。 生化方面【8 ，9 】，染色体的d n a 降解是凋亡细胞的一个显著特征，降解产生的 d n a 片段长度为1 8 0 2 0 0b p 的倍数。有实验表明，凋亡细胞d n a 的降解是一种 内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接处切断染色体d n a ，从而产生 不同长度的寡聚核小体片段，琼脂糖凝胶电泳中呈梯状图谱，而坏死则呈弥漫状连 续分布图谱。 1 1 4 诱导细胞凋亡的因子 诱导细胞凋亡的因素分内源性与外源性因素。内源性因素包括细胞凋亡诱发机 制( 如f a s 配体、肿瘤坏死因子等) 的激活和抑制机制( 生长因子、激素、受体因 子等增殖性因子) 的失活。而外源性因素则包括放射线、热休克等物理性因素，药 物、毒物等化学性因素以及病毒、细菌等生物学因素。近年来还发现活性氧以及一 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s is 氧化氮在神经系统疾病、心血管疾病、免疫性疾病及老化等方面的作用都不同程度 地与细胞凋亡有关。 1 1 5 细胞凋亡的意义 细胞凋亡普遍存在于生物界，既存在与生理状态下，也发生于病理状态下。由 于它对胚胎发育及形态发生、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、 肿瘤的发生等都起着重要作用，并具有潜在的治疗意义，至今仍是生物学与医学的 研究热点。 细胞凋亡受多基因严格控制，这些基因在种属之间非常保守，如b c l 一2 家族、 c a s p a s e 家族、抑癌基因p 5 3 等，随着分子生物学技术的发展，对细胞凋亡的过程 有了相当的认识，但迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而许多疾病的发生 与凋亡过程的紊乱有着直接或间接的关系，如肿瘤的发生与细胞凋亡的抑制有关， 而老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关。 1 2 细胞凋亡机制 目前发现细胞凋亡主要通过三条信号转导通路，一条是外源性信号通路，又称 死亡受体信号通路；另一条称为内源性信号通路，即线粒体信号通路；还有一条为 内质网信号通路。其中，线粒体信号通路是最主要的途径。 1 2 1 死亡受体信号通路 死亡受体( d e a t hr e c e p t o r ，d r ) 是一类能与相应配体结合，传递细胞凋亡信号 而诱导细胞凋亡的跨膜蛋白。目前所知的死亡受体主要有t n f r 、f a s 、d r 3 、d r 4 、 d r 5 等。死亡受体由胞外、胞内两部分组成。胞外部分n 端含有2 4 个具有相似 的、富含半胱氨酸的结构域( c y s t e i n er i c hd o m a i n ，c r d ) ，胞内部分是由6 0 8 0 个 氨基酸组成的死亡结构域( d e a t hd o m a i n ，d d ) ，后者能与胞浆死亡结构域蛋白( d d p r o t e i n ，d d p ) 中的d d 同源序列结合，传递一系列细胞凋亡信号，尤其是c a s p a s e s 的活化【l o j 。 以目前研究得最为清楚的f a s f a s l 为例，当f a s l 以三聚体的形式与f a s 结合 后，诱导后者三聚体化，并在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，该复合物含有f a d d ( f a s a s s o c i a t i o np r o t e i nw i t hd e a t h ) 。f a d d ! 1 2 】是一种带有死亡结构域的f a s 相关 蛋白，是死亡信号转录中的一个接头蛋白，由c 端的死亡结构域( d d ) 和n 端的 死亡效应结构域( d e a t he f f e c t o rd o m a i n ，d e d ) 两部分组成。f a s 通过死亡结构域 ，f 7 、 ： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 与f a d dc 端的d d 结合，激活f a d d ，f a d d 又通过d e d 与p r o c a s p a s 8 前导 区的d e d 相互作用，使p r o c a s p a s e 8 寡聚化，进而通过自身切割而自活化，再激 活下游的c a s p a s e 3 及其他效应c a s p a s e s ，引起细胞凋亡。 1 2 2 线粒体信号通路 线粒体是真核生物能量与代谢的中心，在细胞的凋亡、生物的衰老、癌症的发 生、信号的转导等过程中均起着非常重要的作用。近些年，随着对细胞凋亡的深入 研究，越来越认识到细胞内线粒体跨膜电位( 皿m ) 、线粒体通透性转运孔 ( p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ，p t p ) 等的重要生物功能。许多因素例如生长因子抑 制剂、抗癌药物等，都可以使线粒体功能损伤，使各种凋亡因子从线粒体释放至细 胞质中，从而引发细胞凋亡i l 引。 当细胞内或细胞外某些信号引起促凋亡的b c l 2 家族成员发生蛋白水解、脱磷 酸化等修饰，由非活性状态变为活性状态，从而由细胞质移位到线粒体膜，导致p t p 开放。p t p 又称细胞生死开关，是线粒体内、外膜相连处的种复合蛋白，是线粒 体内外信息交流的枢纽，其功能的发挥依赖于它的开放状态。在应激状态下，p t p 开 放并允许分子量 硕士学位论文 m a s t e r st i i e s i s a p o p t o s i s j j b i 0 1 c h e m ，2 0 01 ，2 7 6 ( 3 2 ) ：2 9 7 7 2 - 2 9 7 81 2 8 f uw n ，s t e m p h e nm k ，a d r i a nc n ，e ta 1 a p a g lx li sa ni n a c t i v e i s o f o r mc o m p a r e dw i t ha p a g ll j 】b i o c b i o p r ，2 0 0 1 ，2 8 2 ( 1 ) ：2 6 8 2 7 2 2 9 h uy ，b e n e d i c tm a ，d i n gl ，e ta 1 r o l eo fc y t o c h r o m eca n da r p d a t p h y d r o l y s i s i n a p a f - 1 m e d i a t e dc a s p a s e 9 a c t i v a t i o na n da p o p t o s i s 【j 】 e m b o j ，19 9 9 ，18 ( 13 ) ：3 5 8 6 3 5 9 5 3 0 k a t s u y ao ，a l e x a n d e rg y ，a s a k oi ，e t a 1 a l t e r a t i o no fa p o p t o t i c p r o t e a s a - a c t i v a t i n gf a c t o r ( a p a f - 1 ) d e p e n d e n ta p o p t o t i cp a t h w a yd u r i n g d e v e l o p m e n to f r a t b r a i na n dl i v e r j 】j b i o c h e m ，2 0 0 2 ，1 3 1 ( 1 ) ：1 3 1 - 1 3 9 31 y o s h i d ah ，k o n gy y ，y o s h i d ar a p a f - 1i s r e q u r i e df o rm i t o c h o n d r i a l p a t h w a y so fa p o p t o s i sa n d b r a i nd e v e l o p m e n t 【j c e l l ，19 9 8 ，9 4 ( 6 ) ：7 3 9 7 5 0 3 2 c e c o n ie ，a l v a r e zv g ，m e y e rb i a p a f o lr e g u l a t e sp r o g a r a m m e dc e l ld e a t h i nm a m m a l i a n d e v e l o p m e n t 【j c e l l ，19 9 8 ，9 4 ( 6 ) ：7 2 7 - 7 3 7 3 3 c a m p i o n im ，s a n t i n id ，t o n i n ig ，e ta 1 r o l eo fa p a f - 1 ，ak e yr e g u l a t o ro f a p o p t o s i s ，i nm e l a n o m ap r o g r e s s i o na n dc h e m o r e s i s t a n c e j 】e x p d e r m a t o ， 2 0 0 5 ，1 4 ( 1 1 ) ：8 1 1 - 8 1 8 3 4 k r e p e l ae ，p r o c h a z k aj ，f i a l ap ，e ta 1 e x p r e s s i o no fa p o p t o s o m e p a t h w a y - r e l a t e dt r a n s c r i p t si nn o n - s m a l lc e l ll u n gc a n c e r 叨j c a n c r e s ， 2 0 0 6 ，1 3 2 ( 1 ) ：5 7 6 8 3 5 黄带发，富伟能，尚超喉鳞癌a p a f - 1 基因表达及启动子区甲基化研究状 【j 】遗传学报，2 0 0 4 ，3 1 ( 1 2 ) ：1 3 2 7 1 3 3 1 3 6 k a r p fa r ，j o n e sp a r e a c t i v i t i n gt h ee x p r e s s i o no fm e t h y l a t i o ns i l e n c e d g e n e si nh u m a nc a n c e r j 】o n c o g e n e ，2 0 0 2 ，2 1 ( 3 5 ) ：5 4 9 6 5 5 0 3 3 7 i m a iy ，k i m u r at ，m u r a k a m ia ，e ta 1 t h ec e d 一4h o m o l o g o u sp r o t e i n f l a s hi si n v o l v e di nf a s - m e d i a t e da c t i v a t i o no fc a s p a s e 8d u r i n ga p o p t o s i s 【j 】n a t u r e ，1 9 9 9 ，3 9 8 ( 6 7 3 0 ) ：7 7 7 - 7 8 5 3 8 b e n i nj ，全mw ，f i s c h e rc m ，e ta 1 h u m a nc a r d 4 p r o t e i ni san o v e l c e d 一4 a p a f - 1c e l ld e a t hf a m i l ym e m b e rt h a ta c t i v e s j 】b i 0 1 c h e m ，19 9 9 ， 2 7 4 ( 1 9 ) ：1 2 9 5 5 1 2 9 5 8 3 9 r e e dj c c y t o c h r o m ec ：c a n tl i v ew i t hi t - c a l l tl i v ew i t h o u ti t j 】c e l l ，1 9 9 7 ， 9 1 ( 5 ) ：5 5 9 - 5 6 2 4 0 z a m z a m a in ，m a r c h e t t ip ，c a s t e d om ，e ta 1 r e d u c t i o ni nm i t o c h o n d r i a l p o t e n t i a lc o n s t i t u t e sa ne a r l yi r r e v e r s i b l es t e po fp r o g r a m m e dl y m p h o c y t e d e a t hi nv i v o j 】j e x p m e d ，1 9 9 5 ，1 8 1 ( 5 ) ：1 6 6 1 1 6 7 2 41 s a t i om ，k o r s m e y e rs j ，s c h l e s i n g e rp h b a x - d e p e n d e n tt r a n s p o r to f 2 7 ： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s c ”o c l l r o m ecr e c o n s t i t u t e di np u r el i p o s o m e s j n a t c e l l b i 0 1 ，2 0 0 0 ，2 ( 8 ) ： 5 5 3 5 5 5 4 2 l e e 、m k ，u l r i c hb ，f r a n kt m i t o c h o n d r i aa sat a r g e to fc a d m i u m n e p h r o t o x i c i t y ：i n d u c t i o n o f s w e l l i n g a n d c ”o c h r o m e cr e l e a s e 【j t o x i c o l o g ym e c h a n i s m sa n dm e t h o d s ，2 0 0 4 ，14 ( 1 - 2 ) ：6 7 71 4 3 g r e e nd r ，r e e dj c m i t o c h o n d r i aa n da p o p t o s i s 【j 】s c i e n c e ，19 9 8 ， 2 8 1 ( 5 3 8 1 ) ：1 3 0 9 - 1 3 1 2 4 4 3 c a i nk ，b r o w nd g ，l a n g l a i sc ，e ta 1 c a s p a s ea c t i v a t i o ni n v o l v e st h e f o r m a t i o no ft h e a p o p t o s o m e ，al a r g e ( a p p r o x i m a t e l y 7 0 0 k d a ) c a s p a s e a c t i v a t i n gc o m p l e x j 】j b i 0 1 c h e m ，1 9 9 9 ，2 7 4 ( 3 2 ) ：2 2 6 8 6 2 2 6 9 2 4 5 q i nh ，s f i m v a s u l as m ，w ug ，e ta 1 s t r u c t u r a lb a s i so fp r o c a s p a s e - 9 r e c r u i t m e n tb yt h ea p o p t o t i cp r o t e a s e a c t i v a t i n gf a c t o r1 j 】n a t u r e ，19 9 9 ， 3 9 9 ( 6 7 3 6 ) ：5 4 9 - 5 5 7 4 6 “p ，n i j h a w a nd ，b u d i h a r d j oi ，e ta 1 c y t o c h r o m eca n dd a t p - d e p e n d e n t f o r m a t i o no f a p a f - 1 c a s p a s e 一9c o m p l e x i n i t i a t e sa l l a p o p t o t i cp r o t e a s e c a s c a d e j 】c e l l ，1 9 9 7 ，9 1 ( 4 ) ：4 7 9 4 8 9 4 7 k e r m e re ，a n k e r h o l dr ，k l o c k e rn ，e ta 1 c a s p a s e 一9 ：i n v o l v e m e n ti n s e c o n d a r yd e a t ho fa x o t o m i z e dr a tr e t i n a lg a n g l i o nc e l l si nv i v o j 】b r a i n r e s m 0 1 b r a i n r e s ，2 0 0 0 ，8 5 ( 1 - 2 ) ：1 4 4 15 0 4 8 k n o b l a c hs m ，n i k o l a e v am ，h u a n gx ，e la 1 m u l t i p l e c a u s p a s e s a r e a c t i v a t e da f t e rt r a u m a t i cb r a i ni n j u r y ：e v i d e n c ef o ri n v o l v e m e n ti nf u n c t i o n a l o u t c o m e 【j 】j n e u r o t r a u m a ，2 0 0 2 ，1 9 ( 1 0 ) ：1 1 5 5 1 1 7 0 4 9 j i a n gx ，w a n gx c y t o c h r o m ecp r o m o t e sc a s p a s e 一9a c t i v a t i o nb yi n d u c i n g n u c l e o t i d eb i n d i n gt oa p a f - 1 j 】j b i 0 1 c h e m ，2 0 0 0 ，2 7 5 ( 4 0 ) ：3119 9 31 2 0 3 5 0 f u j i t ae ，e g a s h i r aj ，u r a s ek ，e ta 1 c a s p a s e 一9p r o c e s s i n gb yc a s p a s e 一3v i a a f e e d b a c ka m p l i f i c a t i o nl o o pi nv i v o j c e l l d e a t d ，2 0 0 1 ，8 ( 4 ) ：3 3 5 - 3 4 4 51 a c e h a nd ，j i a n gx j ，m o r g a nd g ，e ta 1 t h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo ft h e a p o p t o s o m e ：i m p l i c a t i o n sf o ra s s e m b l y , p r o c a s p a s e 9b i n d i n g ，a n da c t i v a t i o n j 】m o lc e l l ，2 0 0 2 ，9 ( 2 ) ：4 2 3 - 4 3 2 5 2 h uy ，d i n gl ，s p e n c e rd m ，e ta 1 w d - 4 0r e p e a tr e g i o nr e g u l a t e sa p a f - 1 s e l f - a s s o c i a t i o na np r o c a s p a s e 一9a c t i v a t i o n 【j 】jb i o lc h e m ，1 9 9 8 ，2 7 3 ( 5 0 ) ： 3 3 4 8 9 3 3 4 9 4 5 3 3 g a u d e tr ，b o h ma ，s i g l e rp b c r y s t a ls t r u c t u r ea t2 4 ar e s o l u t i o no ft h e c o m p l e xo f t r a n s d u c i n 邵a n di t sr e g u l a t o r j 】c e l l ，1 9 9 6 ，8 7 ( 1 ) ：5 7 7 5 8 8 5 4 3h uy m ，b e n e d i c tm a ，w ud y ，e ta 1 b c l x li n t e r a c t sw i t ha p a f - 1a n d i n h i b i t sa p a f - 1 一d e p e n d e n tc a s p a s e 一9a c t i v a t i o n j 】e n a s u s ，19 9 8 ，9 5 ( 8 ) ： 2 8 ：= ： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 5 5 5 6 5 7 5 8 5 9 6 0 6 1 6 2 4 3 8 6 - 4 3 9 l p a n d e yp ，s a l e ha ，n a k a z a w aa ，e ta 1 n e g a t i v er e g u l a t i o no fc y t o c h r o m e c - m e d i a t e do l i g o m e r i z a t i o no f a p a f - ia n da c t i v a t i o no fp r o c a s p a s e 一9b yh e a t s h o c kp r o t e i n9 0 j e m b o j ，2 0 0 0 ，1 9 ( 1 6 ) ：4 3 1 0 4 3 2 2 李振光，彭旭线粒体与细胞凋亡 j 】基础医学与临床，2 0 0 1 ，2 1 ( 5 ) ： 4 0 0 4 0 3 j i a n gx 。jw a n gx d c y t o c h r o m ec - m e d i a t e da p o p t o s i s j 】a n n r b i o c h ， 2 0 0 4 ，7 3 ：8 7 1 0 6 a r a m ae ，b a d e rm ，s r i v a s t a v am ，e ta 1 t h et w od r o s o p h i l ac y t o c h r o m ec p r o t e i n sc a r lf u n c t i o ni nb o t hr e s p i r a t i o na n dc a s p a s ea c t i v a t i o n j e m b o j 2 0 0 6