（病原生物学专业论文）具有aav25包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制.pdf

具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制硕士学位论文中文摘要 摘要 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制 硕士研究生：连忠辉 导师：吴小兵研究员 ( 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，病毒基因工程国家重点实验室) 腺相关病毒载体( a d e n o a s s o c i a t e dv i r u sv e c t o r ，vv e c t o r ) 因其无致病性、 免疫原性低、能介导外源基因的长期表达以及转导的宿主细胞范围广等特性而受 到重视，成为很有应用前景的基因导入系统。通常的a a v 载体是以血清型2 型 ( a a v 2 ) 为基础的，其应用也最为广泛。近年来，其它血清型的a a v 载体包 括从v l 一8 的研究和应用成为热点，因为它们对机体的某些组织有比a a v 2 更 高的转导效率，而且可以有效的避开体内针对a a v 2 的中和抗体。其中a a v 5 由于和其它血清型的同源性相对较低而受到关注。与a a v 2 相比，a a v 5 能更高 效地转导呼吸道上皮细胞、肌肉、神经元、胶质细胞和视网膜组织。 由于a a v 是复制缺陷型病毒，需要腺病毒或单纯疱疹病毒的辅助才可以完 成复制周期，因而其包装系统一般需要以下四个元件：含外源基因和i t r 的载 体质粒、含复制酶基因( r e p ) 和外壳蛋白基因( c a p ) 的辅助质粒、辅助病毒和 包装细胞。其中i t r 是儿w 病毒复制、整合、拯救和包装所必需的元件，是 从v 载体中唯一的顺式作用元件( c i sa c t i n ge l e m e n t ) 。由于对a a v 2i t r 的特 性和安全性研究比较多，在构建其它血清型的a a v 载体时，往往仍采用a a v 2 的i t r ，而仅仅将a a v 2 的外壳蛋白( c a p 2 ) 基因置换成其它血清型a a v 的外 壳蛋白基因( c a p l 、c a p 3 、c a p 4 、c a p 5 、c a p 6 、c a p 7 、c a p 8 ) ，构建成杂合型的 a a v 载体a a v 2 1 、a a v 2 3 、a a v 2 4 、a a v 2 5 、a a v 2 6 、a a v 2 7 、a a v 2 8 ， 这种包装策略也叫做假型包装策略。 然而，多个研究小组发现，由于u 5 和a a v 2 的同源性较低，这种假型 包装策略用于a a v 2 5 载体制备时还需要对r e p 2 基因进行改造。另外，国际上 常用的三质粒共转染方法制备a a v 2 5 载体，由于需要大量提取质粒和反复转染 细胞而不利于大规模制备。本研究的目的是研制一种具有包装a a v 2 5 载体功能 的全功能辅助病毒，用于a a v 2 5 载体的高效、快速制备，为a a v 2 5 应用研究 打下基础。 首先，用p c r 方法和重组d n a 技术获得一个r e p 2 s c a p 5 杂合基因。将a 州5 基因组中的r e p 基因5 端7 1 3 b p 序列替换为a a v 2r e p 基因5 端的7 2 5 b p 序列， 而得到一个杂合的r e p 2 5 基因，以期这个杂合基因编码得到的r e p 蛋白可以识 别来自于a a v 2 的i t r 2 而支持a a v 2 5 的假型包装。然后，用三质粒 p u c l 8 r e p 2 5 c a p 5 、p s n a v e g f p 、p h e l p e r 共转染h e k - 2 9 3 细胞，所得到的细 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制 硕士学位论文中文摘要 胞裂解液上清再感染b h k - 2 1 细胞，发现有很多b h k - 2 1 细胞有绿色荧光蛋白的 表达，结果表明所构建的杂合r e p 2 s c a p 5 基因可以支持a a v 2 5 的包装。 为了获得携带r e p 2 5 c a p 5 杂合基因的重组单纯疱疹病毒，利用一套包含 h s v l 全基因组的5 个粘性质粒( c o s 6 、c o s 2 8 、c o s l 4 、c o s 5 6 、c o s 4 8 ) ，通过将 r e p 2 5 c a p 5 杂合基因插入h s v l 基因组的观2 基因( c o s 6 ) 中，同时将e g f p 的 表达单位插入观私基因( c o s 5 6 ) 中，经过5 个粘粒共转染b h k - 2 1 细胞，同源重 组获得同时携带r e p 2 5 c a p 5 和e g f p 的表达单位的重组h s v l r 2 5 c 5 e g f p 。 用p c r 方法和s o u t h e r n 杂交方法对重组单纯疱疹病毒h s v l r 2 5 c 5 e g f p 的结构进行鉴定，结果表明杂合基因r e p 2 5 c a p 5 已经插入h s v l r 2 5 c 5 一e g f p 的基因组中，荧光显微镜下观察病毒感染的b h k - 2 1 细胞，发现细胞呈现绿色， 表明插入的e g f p 表达单位可以正常表达绿色荧光蛋白。 为了研究h s v l 一r 2 5 c 5 一e g f p 的传代稳定性，对这个辅助病毒进行了的6 次连续传代实验，然后对传代病毒的滴度进行检测、对杂合基因r e p 2 5 c a p 5 进行 了定量p c r 分析，结果表明所得到的h s v l r 2 5 c 5 e g f p 可以稳定传代。 最后对h s v l r 2 5 c 5 e g f p 对a a v 2 5 载体的包装功能进行了研究。以携 带报告基因的a a v 载体质粒p s n a v l u c 和p s n a v l a c z 为包装对象，用 h s v l r 2 5 c 5 e g f p 感染携带载体质粒p s n a v l u c 和p s n a v l a c z 的b h k 2 1 细胞，得到的细胞裂解液上清再感染b h k 2 1 细胞，然后分别进行l u c 和l a c z 的表达检测，结果发现b h k - 2 1 细胞有明显的l u c 或l a c z 表达，表明所得到的 病毒h s v l r 2 5 c 5 e g f p 可以包装出a a v 2 5 l u e 和a a v 2 5 l a c z ，具有了支 持a a v 2 5 载体包装的全部辅助功能。 通过本论文的工作，我们构建了一个杂合的r e p 2 5 基因，并和e g f p 表达单 位一起插入单纯疱疹病毒基因组，得到了一株命名为h s v l r 2 5 c 5 e g f p 的重 组单纯疱疹病毒，这个病毒有预期支持a a v 2 5 载体包装的全部辅助功能，成为 一种简便、高效制备重组a a v 2 5 病毒的通用性辅助病毒，同时，辅毒所携带的 e g f p 表达盒可以非常方便辅毒的监测。 关键词：腺相关病毒；单纯疱疹病毒；辅助病毒 2 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制 硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t g e n e r a t i o no fr e c o m b i n a n th e r p e ss i m p l e xv i r u st y p e1 f o ra a v 2 5p a c k a g i n g m a s t e rc a n d i d a t e l i a nz h o n g h u i s u p e r v i s o r w u x i a o b i n g s t a t ek e yl a b o r a t o r yf o rm o l e c u l a rv i r o l o g ya n dg e n e t i ce n g i n e e r i n g ， i n s t i t u t eo f v i r o l o g y , c d c ，b e i j i n g ，c h i n a a d e n o a s s o c i a t e dv i r u s2 ( a a v 2 ) v e c t o r sp o s s e s sm a n yp r o p e r t i e sm a k i n gt h e m v e r y a t t r a c t i v ef o r t h e r a p e u t i cg e n ed e l i v e r y t oh u m a n s ，s u c ha sal a c ko f p a t h o g e n i c i t yo rt o x i c i t y , a n dt h ea b i l i t yt oc o n f e rl o n g t e r mg e n ee x p r e s s i o n i n r e c e n t y e a r s ，a ni n c r e a s i n gn u m b e ro fr e s e a r c h e r sa l en o wf o c u s i n go nt h es e v e no t h e r n a t u r a l l yo c c u r r i n gs e r o t y p e so fa a v ( a a v 1a n da a v 3t o8 ) ，w h i c ha r es t r u c t u r a l l y a n df u n c t i o n a l l yd i f f e r e n tf r o ma a v 2 nv i t r oa n di nv i v o ，t h e s en o v e lv e c t o r sw e r e s h o w nt oh a v eah o s tr a n g ed i f f e r e n tf r o ma a v 2 ，a n dt oe s c a p et h ea n t i a a v 2 i m m u n er e s p o n s e a m o n gt h e m ，a a v 5i sc l a s s i f i e da st h em o s td i v e r g e n tm e m b e ro f t h ea a vf a m i l yb e c a u s et h eo v e r a l lh o m o l o g yt ot h eo t h e rs e r o t y p e si so n l ya b o u t 5 5 f o rb o t ho r f sa n di t r s a a v 5r e pp r o t e i n sc a n n o tn i c ka a v 2i t r s ，w h i c hi sr e q u i r e df o re x c i s i o na n d r e p l i c a t i o no ft h ev i r a lg e n o m e i ti st h e r e f o r en o tf e a s i b l et oe x p r e s sr e pa n dc a p s i d p r o t e i n so fa a v 5f o rp a c k a g i n go fa a v 2v e c t o rd n a i n t oa a v 5c a p s i d s o nt h e o t h e rh a n d ，t r a n s i e n tp l a s m i dt r a n s f e c t i o ni sn o ts u i t a b l ef o ral a r g es c a l ep r o d u c t i o no f a a vv e c t o r s h e r ew eh o p e dt oe n g i n e e rar e c o m b i n a n th e r p e s v i r u st op a c k a g e a a v 2 5e f f i c i e n t l ya n dq u i c k l y f i r s t w eg o tah y b r i dr e p 2 5 c a p 5g e n eb yr e p l a c i n gt h ef i r s t7 13 b pr e pg e n ef r o m a a v 5w i t hr e l e v a n t7 2 5 b pr e pg e n ef r o ma a v 2 t h e np u c 18 r e p 2 5 c a p 5 、 p s n a v e g f p 、p h e l p e rw a sc o t a n s f e c t e di n t oh e k - 2 9 3 a n dt h ec e l ll y s a t ew eg o t w a sa d d e dt ot h eb h k - 21 t h eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ne x p r e s s e di nt h eb h k - 21 c e l l si n d i c a t e dt h eh y b i dr e p 2 5 c a p 5g e n ec a n h e l pt op a c k a g e a a v 2 5 t h e nt h er e p 2 5 c a p 5g e n ew a sc l o n e di n t ot h eu l 2g e n eo fh s v1 ，w h i c h g e n o m ew a sd i s p e r s e di nf i v ec o s m i d s ( c o s 6 、c o s 2 8 、c o s l 4 、c o s 5 6 、c o s 4 8 ) ，w h i l et h e u l 2g e n ew a sp a r to ft h ec o s 6 a n o t h e rg e n ee g f pw a sc l o n e di n t ot h eu l 4 4g e n eo f c o s 5 6 b o t ho ft h e mw e r ec o t r a n s f e c t e di n t ot h eb h k 21c e l l sw i t ho t h e rt h r e e 3 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制硕士学位论文英文摘要 c o s m i d st og e n e r a t er e c o m b i n a n th e l p e rv i r u sh s vl - r 2 5 c 5 e g f p t h er e p 2 5 c a p 5g e n ew a sp r o o f e dt oe x i s ti nt h eh s v l - r 2 5 c 5 一e g f pg e n o m e b yp c r a n ds o u t h e r nb l o t t i n gi d e n t i f i c a t i o n t h ee x p e r i m e n to fc o n t i n u o u s l ya m p l i f y h s v l r 2 5 c 5 e g f pf o r6g e n e r a t i o n sa l s os h o wt h es t a b i l i t yo fv i r o u sg e n o m e t o t h ee n d t w oc e l ll i n e so fb h k aa v 2 l a c za n db h k a a v 2 l u ew e r ei n f e c t e dw i t l l h s v l 一r 2 5 c 5 一e g f e t h eb h k 一2lc e l l sw a sf o u n dt o e x p r e s s l u c i f e r a s eo r b e t a - g a l a c t o s i d a s ea f t e ri tw e r ei n f e c t e dw i t ht h ec e l ll y s a t ef o r g o i n gw h i c hi n d i c a t e d h s v l 一r 2 5 c 5 一e g f pc a nh e l pt op a c k a g ea a v 2 5 一l u ca n da a v 2 5 一l a c z i nt h i ss t u d y , w ec o n s t r u c t e dah y b r i dr e p 2 5 c a p 5g e n e t h e ni tw a si n s e r t e di n t o h s v lg e n o m et o g e t h e rw i t ha ne g f pe x p r e s s i n gc a s s e t t et og e n e r a t er e c o m b i n a n t v i r u sh s v l 一r 2 5 c 5 - e g f ea n dt h ee n c a p s i d a t i o no fa a v 2 5v e c t o rc o u l db er e a d i l y a c h i e v e dw i t ht h i sr e c o m b i n a n tv i r u sh s v l r 2 5 c 5 e g f p k e yw o r d s ：a d e n o a s s o c i a t e dv i r u s ，h e r p e ss i m p l ev i r u s ，h e l p e rv t r u s 4 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制硕士学位论文缩略语 缩略语 h s v l h e r p e ss i m p l e xv i r u s ，t y p e1单纯疱疹病毒 删a d e n o a s s o c i a t e dv i r u s腺相关病毒 v g v l n l sg e n o m e 病毒基因组 e g f p e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 绿色荧光蛋白 l u c l u c i f e r a s e荧光素酶 f b sf e t a lb o v i n es c l u l i l 胎牛血清 i t ri n v e r t e dt e r m i n a lr e p e a t 反转末端重复 t r st e r m i n a lr e s o l u t i o ns i t e 末端拆分位点 h s p g h e p a r a ns u l f a t ep r o t e o g l y c a n s 硫酸肝素糖蛋白 b p b a s ep a i r碱基对 c l d h 2 0 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e l 双蒸水 k bk i l o b a s ep a i r 千碱基对 n tn u c l e a t i d e 核苷酸 m o i m u t i p l i c i t yo fi n f e c t i o n ( t c i d s 0o rp f u c e l l ) ( 每细胞病毒) 感染单位 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 q - p c rq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n定量p c r p b s p h o s p h a t e b u f f e rs a l i n e 磷酸盐缓冲液 d m e md u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m d u l b c c c o s 的改良e a g l e s 培养基 x - g a l5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l - p d - g a l a c t o s i d e5 一溴- 4 氯- 3 一吲哚一p 一右旋- 半乳糖苷 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制硕十学位论文前言 前言 在所有用于构建人类基因治疗的哺乳动物和非哺乳动物病毒载体中，a a v 病毒载体是很有前景的一个。a a v 2 的天然宿主是人类，自从在上世纪6 0 年代 中期被发现以来，人们对它进行了深入的研究，并将其改造成了载体。到目前为 止的临床前和临床研究数据均表明，由这个病毒所改造的载体非常适合于人类基 因治疗，因为它包含了很多特性【l 】，这些特性包括：无致病性、免疫原性低、能 感染来源于不同组织器官的分裂和静止期细胞、有位点特异性整合入宿主染色体 或形成稳定d n a 连环体的潜能，这种潜能可使重组a a v 2 载体所携带的外源基 因长期表达，而且，载体的生产和纯化技术也逐步得到优化，目前已经可以在较 短的时间内生产出高滴度、高纯度的a a v 2 载体【2 j 。 研究发现，对某些细胞而言，a a v 2 载体的感染效率比较低，如临床上常用 的细胞造血细胞和肝细胞，从而要达到治疗性的基因转导水平就需要很高的载体 剂量。另一个限制a a v 2 应用的因素就是人体存在的a a v 2 抗体，人群中估计 超过8 0 都是a a v 2 抗体阳性。大多数人的抗体均可在体外中和病毒对细胞的 感染，虽然没有证明，但是大家均认为体内的情况应该和体外实验类似，从而这 些个体就会抵制a a v 2 的转染而使a a v 2 无法在他们身上得到有效的使用，除 了天然的获得性免疫外，a a v 2 载体的曾经使用都会使人体对相同载体的再次使 用产生免疫，进而需要增加转基因细胞的数量。 为了改进a a v 2 的这些不足，科学家们进行了大量的动物实验研究。例如， 在a a v 2 外壳上偶联双特异抗体以加强载体的靶向性，从而减少载体的用量p 】， 或短暂抑制宿主的免疫系统以便载体的重复摄入【4 】。在还不清楚这些方法能否应 用到到病人身上时，自然界不同血清型的a a v 给了我们另外一个选择。到目前 为止，除了从v 2 以外，还有多个以灵长类为宿主的a a v 已经被分离、克隆和 测序，如a a v l ，a a v 3 8 【5 6 ，7 ，8 ，9 ，1 0 1 。相对于a a v 2 而言，习惯上把后来发现 的不同血清型a a v 都统称为新型从v ，而构建的载体也相应的称为新型a a v 载体。这些a a v 均能在培养基中转染人体细胞，从而具有了改造成基因治疗载 体的潜力。另外它们可以很容易的被改造为载体，因为，所有的a a v 基因组都 和质粒一样易于操作，而且a a v 2 载体的生产技术也可直接转用于新型a a v 载 体，从目前的实验结果来看，无论在体内还是体外，可以通过对不同血清型a a v 载体的选择，来分别感染那些a a v 2 载体难于转导的细胞，并且有效逃避机体 针对a a v 2 的免疫反应。 在这些新型a a v 当中，a a v 5 由于和其它血清型的同源性很低而成为人们 关注的对象。除了a a v 5 以外，其它血清型a a v 的i t r 一般由1 4 3 1 4 6 个核苷 酸组成，而a a v 5 的i t r 长达1 6 7 个核苷酸，和其它a a v 的i t r 只有6 0 左 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制硕士学位论文前言 右的同源性【1 7 1 。a a v l 4 和a a v 6 的i t r s 有9 5 的d n a 序列同源，基因的同 源性也很高，从而这些新型丸w 载体可以使用和a a v 2 相同的包装策略，即用 c a p 基因替换a a v 2 载体包装系统中的c a p 2 基因就可以包装出相应的新型a a v 载体，这就是所谓的假型包装策略，因为这些载体内部的i t r 来源于a a v 2 ，而 外壳则是不同的血清型从v 的外壳。人们倾向于构建这种假型包装的载体，是 因为人们对它在宿主细胞中的染色体的整合效率和特异性均有研究，有大量的动 物实验表明来源于a a v 2 的i t r 是安全的，而对其它血清型a a vi t r 的相关研 究则很少。不过，多个研究小组都发现，这种假型包装的方法用于包装a a v 5 时，只可以得到极少量的a a v 5 病毒。虽然我们课题组也尝试过建立非假型的 a a v 5 的包装系统，就是使用野生型a a v 5 的r e p 5 c a p 5 基因和i t r 5 来包装 a a v 5 ，不过得到病毒量也很少。由于假型包装的策略在其它的新型a a v 载体 中都取得了成功，而且这种假型包装系统的效率，相较于a a v 2 而言并没有明 显的降低。所以我们希望通过对载体的改造，能够将假型包装的策略应用于 a a v 5 的包装。 研究表明，a a v 2 和a a v 5 编码的r e p 蛋白和来源于a a v 2 和a a v 5 的i t r 的结合能力都类似，但是二者在末端拆分位点的内切酶活性却很不相同，而这个 活性就和起始于p 5 启动子的r e p 7 8 6 8 蛋白相关，其中包括第1 5 2 位的t y r ，它 对末端拆分酶的活性非常重要，a a v 2 所编码的r e p 蛋白和其基因组的57 末端 共价结合就是发生在r e p 蛋白上面这个t y r 残基和a a v 基因组的一个胸苷基团 的5 磷酸之间，而且只有启动子p 5 起始编码的r e p 6 8 可以发生这种结合【1 1 1 ， 而r e p 7 8 6 8c 末端的氨基酸则和a a v 的有效包装有关。所以，我们将a a v 5 基因组中编码r e p 5 蛋白n 端约五分之二的氨基酸序列替换为a a v 2 的相应序 列，而得到一个杂合的r e p 2 基因，以期这个基因编码得到的杂合的r e p 2 蛋白可 以识别来自于a a v 2 的i t r 2 ，从而可以得到假型包装的a a v 5 。 我们课题组先前建立了一种“一种辅助病毒感染一个载体细胞株”的策略，能 有效避免转染法中需要大量提取质粒和反复转染细胞而不利于大规模制备的缺 点，是一种简便、高效、规模化制备重组a a v 2 病毒的方法，本研究将构建一个 杂合的r e p 2 5 基因以支持a a v 2 5 的假型包装，然后把这个杂合基因和e g f p 表 达单位同时插入单纯疱疹病毒基因组，来获得一株重组单纯疱疹病毒 h s v l r 2 5 c 5 e g f p ，利用我们课题组的包装策略以解决a a v 2 5 载体的大量制 备问题，从而使这个极具特色的a a v 能更快的应用到基因治疗中。 6 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制 硕士学位论文 实验设计 实验设计 7 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制 硕士学位论文 材料方法 材料方法 1 主要试剂和材料 各种工具酶购自n e we n g l a n db i o l a b 公司和宝生物( t a k a r a ) 公司；d n a 分子 量标准d l 2 0 0 0 和d l l 5 0 0 0 购自t a k a r a 公司；m a r k e r 随机引物标记试剂盒、 s o u t h e r n 转移用尼龙膜、地高辛d n a 标记和检测试剂盒均购自r o c h e 公司；琼 脂糖、r p m i1 6 4 0 和d m e m 购自g i b c o 公司；标准胎牛血清购自h y c l o n e 公司； 真核细胞转染试剂l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 购自i n v i t r o g e n 公司；1 0 0 k5 m l 离心超滤 膜包购自p a l l 公司；荧光素酶分析系统购自p r o m e g a 公司；定量p c r 检测试剂 盒q u a n t i t e c ts y b rg r e e n p c rk i t ( # 2 0 4 1 4 3 ) 购自q i a g e n 公司；蛋白分子量标 准购自上海升正生物技术公司。 2 质粒、粘粒及宿主菌 p g e m 3 z f m 、p u c l8 购自i n v i t r o g e n 公司，携带a a v 2 基因组的质粒p s s v 9 和携带a a v 5 基因组的质粒p a v 5 一t r a n s 由舒跃龙博士惠赠。a a v 2 载体质粒 p s n a v 1 2 1 和p s n a v - e g f p t l 3 】由伍志坚等构建。 p h e l p e r 质粒来自a a vh e l p e r - f r e es y s t e m 试剂盒( s t r a t a g e n e 公司) ，包含了 a a v 包装中所必需的腺病毒的e 2 a 、e 4 和v ar n a 基因， 含有h s v i 病毒( 1 7 株) 全基因组的s e tc 粘粒由d a v i s i o naj 【1 4 】惠赠。该 套粘粒由c o s 6 、c o s 2 8 、e o s l 4 、c o s 5 6 、c o s 4 8 组成。c o s 5 6 e g f p 由袁振华博 士构建和惠赠，它是通过在c o s 5 6 的u l 4 4 基因内插入了e g f p 基因表达盒而成。 以上质粒和粘粒的宿主菌均为大肠杆菌m a xe f f i c i e n c yd h 5 a 株( g i b c o ) 。 3 细胞培养 金黄地鼠胚胎肾细胞b h k - 2 1 购自美国a t c c ，携带有报告基因l a c z 的 a a v 2 载体细胞b h k a a v 2 l a c z 是将p s n a v - l a c z 质粒转染b h k - 2 1 细胞，然 后加g 4 1 8 选择培养而获得的【屹】，用同样的方法得到了携带报告基因荧光素酶 ( l u c i f e r a s e ，简称l u c ) 的a a v 2 的载体细胞b h k a a v 2 l u c ，它们均在含1 0 标准胎牛血清的r p m i1 6 4 0 培养液中培养，h e k 2 9 3 细胞来自病毒基因工程国 家重点实验室，在含1 0 标准胎牛血清的d m e m 培养液中培养。上述所有细胞 均在含5 c 0 2 ，温度为3 7 。c 的孵箱中培养。 4 质粒和粘粒的构建 4 1p u c l 8 r e p 2 5 c a p 5 的构建 质粒的酶切、d n a 片段的电泳、回收、连接、连接反应液的转化、重组子 的筛选等操作按分子克隆实验指南【1 5 】方法进行。 首先是将p a v 5 t r a m 质粒用x b ai 和c l ai 双酶切，回收4 6 k b 的2 个x b ai 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制硕士学位论文 材料方法 位点之间的r e p 5 c a p 5 片段i 然后将此片段用a a ti i 酶切，回收其中的1 6 k b 大小 的r e p 5 ( 5 端) 片段；用x b ai 和a a ti i 双酶切p g e m 3 z f m 质粒，回收其中 2 2 k b 的载体骨架片段；将此片段和上面1 6 k b 的g e p 5 片段连接，得到一个4 k b 大小的质粒，命名为3 z f - r e p 5 。 把携带a a v 2 全基因组的s s v 9 质粒用x b ai 和b a mh i 双酶切回收8 6 0 b p 的r e p 2 ( 5 端) 片段，用x b ai 和b a mh i 双酶切3 z f - r e p 5 质粒，回收2 8 k b 含 载体骨架的片段，将两个回收的片段相连，得到质粒3 z f - r e p 2 1 ，这个质粒携带 了来自a a v 2 的部分r e p 片段( 上游) 和a a v 5 的部分r e p 片段( 下游) 。之间 尚缺2 0 0 b p 的r e p 5 片段。 把p a v 5 t r a n s 和3 z f - r e p 2 1 都用b a r nh i 进行酶切，分别回收2 0 0 b p 和3 7 k b 片段，把两个片段连接，并用p c r 方法进行方向筛选，选择正向插入的克隆， 得到3 z f - r e p 2 2 ，并测序验证。自此，a a v 5 基因组5 端x b ai 位点和第一个b a m h i 位点间的片段，已经被替换为s s v 9 质粒上a a v 2r e p 2 基因的相应片段。 最后把p a v 5 t r a n s 和3 z f - r e p 2 2 都用a a ti i 和x b ai 双酶切，分别回收2 8 k b 和1 6 k b 大小的片段，把p u c l8 用x b ai 单切后作为载体，三片段连接而得到所 需要的质粒p u c l 8 - r e p 2 5 c a p 5 。 4 2c o s 6 r 2 5 c 5 的构建 将p u c l 8 r e p 2 5 c a p 5 用x b ai 切下自身启动子控制下的r e p 2 5 c a p 5 基因，然 后插入c o s 6 上h s v l 的u l 2 基因内( 该基因内有一个x b ai 单位点) ，得到重组 粘粒c o s 6 i 也5 c 5 。 在c o s 6 载体上x b ai 位点两侧设计引物c o sf r ，c o sf 的序列为5 c g a g t ct t cg g aa t gt c tt g 37 ，c o sr 的序列为5 g g tg c g a a aa c tt g a g g ac 37 ，用这对引物和c a pf r ( 见8 2 ) 进行组合鉴定，可以知道c o s 6 中 r e p 2 5 c a p 5 基因片段的插入方向，p c r 反应条件为：变性9 4 3 0 s ，退火5 6 3 0 s ， 延伸7 2 1 8 0 s ，共3 0 个循环，最后一个循环完成后继续延伸5 m i n 。p c r 扩增 产物在2 琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。 9 a 有a a v 2 5 包装助组4 * m 癌镕毒研制 ，、 、。 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制硕士学位论文 材料方法 图1 p u c l 8 - r e p 2 5 c a p 5 质粒的构建草图 f i g u r e1 s k e t c hm a po ft h ec o n s t r u c t i o no f p l a s m i dp u c18 - r e p 2 5 c a p 5 5 三质粒共转染包装a a v 参考丸wh e l p e r - f r e es y s t e m 说明书【l6 1 ，在1 5c m 2 平皿中接种h e k - 2 9 3 细 胞，培养2 4 h 后，用d m e m 将细胞洗两遍，用磷酸钙转染法将p s n a v - e g f p 、 p u c l8 r e p 2 5 c a p 5 和p h e l p e r 三个质粒按1 ：l ：1 的摩尔比例共转染h e k 2 9 3 细胞 1 7 】，然后置3 7 ，5 c 0 2 细胞孵箱中培养，6 h 后将培养液更换为含5 血 清的d m e m ，继续培养直至细胞大部分变圆( 7 2 h 左右) ，将上清和细胞混合液 在7 0 和3 7 下反复冻融三次，1 2 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，得到上清约1 0 m l ，将混合 液用1 0 0 k 膜包超滤浓缩至5 0 0 肛i ，命名为a a v 2 5 粗提物。 6 重组出毒 把c o s 6 一r 2 5 c 5 、c o s 2 8 、c o s l 4 、c o s 5 6 e g f p 和c o s 4 8 五个粘粒( 对照组为 c o s 6 、c o s 2 8 、c o s l 4 、c o s 5 6 e g f p c o s 4 8 ) 等量混合在一个e p 管中、每种粘粒2 1 x g ， 用p a ci 酶3 7 酶切过夜，加入三倍体积的无水乙醇沉淀d n a 后，加入2 0 i _ t l 无 菌去离子水溶解，然后用l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 按照产品说明书中的操作方法加入6 孔板中接种1 6 h 的b h k - 2 1 细胞中；1 2 h 后换成含2 胎牛血清的1 6 4 0 培养液， 3 7 、5 c 0 2 培养，每3 4 天换液一次，直至细胞病变，把细胞和上清混合液 在7 0 c 和3 7 下反复冻融三次，1 2 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，收获离心上清而得到重组 辅助病毒h s v l r 2 5 c 5 一e g f p 粗提物，也就是a a v 2 5 包装中所要使用的辅助病 毒。 7 空斑纯化 在六孔板中铺上b h k 2 1 细胞，每孔3 x 1 0 5 个细胞，过夜培养，把得到的辅 助病毒h s v l r 2 5 c 5 e g f p 用1 6 4 0 培养基进行1 0 倍倍比稀释，加入六孔板中， 置3 7 ，5 c 0 2 孵箱中培养2 h ，弃掉培养液，用含1 低溶点琼脂糖和2 血 清的培养基铺板，待凝固后置3 7 。c ，5 c o z 孵箱中继续培养，待出现明显的细 胞病毒以后，选择噬斑彼此分离良好的孔，用移液枪随机挑取噬斑6 个到已接种 b h k - 2 1 细胞的2 4 孔板中，3 7 c ，5 c 0 2 孵箱中培养3 d ，保留上清作p c r 检 测用( 方法同8 2 ) 。 8p c r 方法鉴定重组辅助病毒 取5 0 1 x l 辅助病毒粗提物，加入2 i l l 蛋白酶k ，5 6 水浴l h ，1 0 0 煮l o m i n ， 将上述处理好的毒液用去离子水进行1 0 倍梯度稀释，作为模板进行p c r 鉴定。 8 1 h s v lt k 基因鉴定 上游引物为57 g c gt c tg c gt t cg a c c a gg c 3 ，下游引物为5 g g a g c ca g a a c gg c gt c gg 37 ，扩增片段长度为3 9 5 b p 。p c r 反应条件为：变 性9 4 3 0 s ，退火5 6 c3 0 s ，延伸7 2 4 5 s ，共3 0 个循环，最后个循环完成 具有a a v 2 5 包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制硕士学位论文材料方法 后继续延伸5 m i n 。p c r 扩增产物在2 琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。 8 2c a p 5 基因鉴定 上游引物为5 g a ga t ac g c c a ac a cc t ac 3 ，下游引物为5 t c c t g g a g g t t gt a cg t gc 3 ，扩增片段长4 0 2 b p 。p c r 反应条件为：变性9 4 3 0 s ，退火5 6 3 0 s ，延伸7 2 4 5 s ，共3 0 个循环，最后一个循环完成后继续延 伸5 r a i n 。p c r 扩增产物在2 琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。 8 3q p c r 检测 用c o s 6 一r 2 5 c 5 粘粒作为标准对照，用c a pf r 作为引物，参照q i a g e n 公司 定量p c r 试剂盒q u a n t i t e c ts y b rg r e e np c rk i t ( # 2 0 4 1 4 3 ) 的方法进行定量 p c r 反应。将粘粒用d d h 2 0 做l o 倍的梯度稀释，每个梯度取2 9 l 作为模板进行 q p c r 反应以绘制标准曲线，同时，取2 0 , 1 病毒作为模板进行q p c r 反应，用 去离子水作为阴性对照，反应条件为：9 5 ，1 5m i r a9 5 ，3 0s 、5 7 ，2 0s 、 7 2 ，3 0s ，维持4 0 个循环，反应设备为c o r b e t t 公司的r g 3 0 0 0 a ，反应过程 中数据的采集和结束后数据的分析均采用机器自带的软件r o t o r - g e n er e a l t i m e a n a l y s i ss o t t w a r e6 0 ( b u i l d2 7 ) 进行。 9s o u t h e r i l 杂交鉴定h s v l r 2 5 c 5 e g f p 9 1 重组病毒d n a 的提取 参见文献【1 8 】，具体步骤为：在7 5 c r n 2 的培养瓶中培养b h k 一2 1 细胞，待细 胞生长至8 0