（植物病理学专业论文）实时荧光PCR技术检测中草药青蒿及马铃薯丛枝植原体的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导f 进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除厂文中特别加以标汴和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 与越的研究成粜，也小包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：参叫 时间：厕年舌月3 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位沦文的内容。 研究生签名 导师签名 参硐 勖翟 时间：) 名年6 月3 r ：l 趵阃：卯6 年6 目b 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 中草药青蒿( 爿r 细以，胁n m “口l ) ，是我国独有的抗疟药用植物资源。马铃薯丛枝 植原体( p o t a i o w i t c h e s 出r o o mp h y t o p l a s m a ，p w b ) ，为我国出入境有害生物检疫对象。 在出入境检验检疫中，应对这两种生物进行严格检疫。 本研究分别根据蒿属植物r d n ai t s 序列及植原体1 6 sr d n a 序列多态性设计特 异性t 如m a i l 探针及引物，通过实时荧光p c r 方法对黄花蔫及马铃薯丛枝植原体进行 检测，取得了以下研究进展。 1 本文对9 种蒿属植物的i t s 序列和1 3 种植原体的1 6 sr d n a 序列进行了测定及 比对，分别根据特异性位点设计探针引物组，对爿口h ”“口及p w b 进行实时荧 光p c r 检测。两组试验结果表明，两组探针一引物分别对黄花蒿和马铃薯丛枝植 原体有很强的特异性，除黄花蒿和马铃薯丛枝植原体外，作为对照的其余8 种蒿 属材料和1 9 种病原物均未检测到荧光信号。 2 对实时荧光p c r 检测体系的优化试验结果表明，检测效果在镁离子浓度为3 m m ， 探针浓度为o 5 m ，引物浓度为0 ，4 “m 时为最佳。 3 通过对不同浓度马铃薯丛枝植原体质粒的实时荧光p c r 和常规p c r 扩增，发现 实时荧光p c r 检测灵敏度比常规p c r 高约1 0 0 倍，能很好地避免假阴性结果。 本研究在国内首次建立了对中草药青蒿和马铃薯丛枝植原体的t a q m a n 实时荧光 p c r 检测体系，并获得很好的检测结果。该方法快速、灵敏、特异、安全，为农业生 产部门及检疫部门提供了有力的技术支持和科学保障。 关键词：中草药青蓠，马铃薯丛枝植原体，实时荧光p c r ，r d n ai t s ，1 6 sr d n a a b s t r a c t s w e e t 、v o r m w o o d ( 爿，p ， 缸f 盘( ”t 聍“口，l ) ，o n 】yg r o w ni nc h i n a ，i sak j n do fo m c i n a lp l a n t r e s o u r c ew h i c hc a nc 1 1 r ei m p a l u d i s m t h ep o t a t o 丽t c h e s - b r o o mp h y t o p l a s m a ( p w b ) i sa i l i m p o n a i 】tq u 籼t i n ep l a n tp h n o p l a s m a i ti ss i g n i f i c a l l tt or e i 刖o r c em eq u a r a n t i n eo f t h e m t w os e r i e so fp r i m e r sa i l dt a q m a l lp r o b c sw e r ed e s i g l l e db a s e do nt h er e g i o no fr d n ai t s a n dl6 sr 【) n at od e t e c t 爿口 n “aa n dt h ep o t a t ow i t c h e s b r o o mp h ”o p l a s m aw i t h i 沁a 1 t i m ef l u o r e s c e n tp c r ( i u 下p c r ) i i lt l l i se x p e r i m e n t t h er e s m t sa sf 0 1 l o w ： 1 t 1 1 ei t sr e g i o n so f9 爿，耙m 妇抽l - p l a l l t sa n d 也e1 6 sr d n ar e g i o n so f1 3p h ”o p l a s m a s w e r es e q u e n c e da n dc o m p a r e d t w os e r i e so fp r i m e r sa i l dt a q m a np r o b e sw e r ed e s i g i l e d b a s e do nt h es p e c i 6 cs i t e st od e t e c ta 硎胛“口a i l dp w bw i t hr t fp c r t h es p e c i f i c p m e r sa n dp r o b e sw e r ef o u n dt h a tt h e yw e r es p e c i f i c f o r 爿口玎珂“盘a n dt h ep o t a t o w i t c h e s _ b r o o mp h ”o p l a s m aa n dc o u l db eu s e di nm e i rd e t e c t i o n 2 t h ec o n c e n t r a t i o n so fm g 什，p r o b ea n dp r i m e r sw e r eo p t i m i z e d t h eh i g h e s tr c p o r t e r n u o r e s c e n c e ( r j l ) v a l u ew a so b t a i n e df o rm + a t3 m m ，p r o b e a to 5 p ma n dp r i m e r sa t 0 4 u m 3 t h ep l a s m i do fp w b w e r ed i l u t e dt od i 髓r c n tc o n c e n _ 【r a t i o n st od e t e c tm es e n s i t i v i t yo f t h er t fp c r t h em d t o c 0 1w a sa p p m x i m a t e l y1 0 0t i m e sm o r es e n s i t i v e t h a n c o n v e n t i o n a lp c r 1 1 1 i sm e 血o dc a i lp r o v i d eas p e c i f i c ，s e n s i 虹v e ，r a p i dd e t e c t i o no f 彳翩胛口a n dm ep o t a t o 、v i t c h e s 山m o mp h y t o p l a s m af o ra g r i c u l 嘁a i l dq u a r a n t i n eo 唱a n i z a t i o n k e yw o r d s ： 爿，地肌捃胁d 胛胛“口l ， p o t a t ow i t c h e s 南r o o mp h ”o p l a s m a ， r e a l - 丁i m ef l u o r e s c e n tp c r ，r n ai t s ，1 6 sr d n a 2 沈阳农业大学硕十学位论文 11中草药青蒿的概述 第一章文献综述 学名：黄花蔫( 4 ，把m 拈妇彻”“日l ) 中药习称：青蒿 英文名：s w e e tw o m w o o d 分类地位：菊科( c b m 口d j f 缸p ) ，春黄菊族“n 脯e m 瑚n a p ) ，蓠属臼r 耙m 西i d ) ，蒿亚 属( 彳，阳小括胁) ，艾蒿组( 爿咖胁h 删) 。 分布：原产于中国，全国各地均有分布，现广布于欧洲、亚洲的温带、寒温带及亚 热带地区，向南延伸分布到地中海及非湘北部，另外还从亚洲北部迁入北美洲，并广布 于加拿大及美国。 生物学特性：为年生革本植物，植株具浓烈的挥发性香气。根单牛，垂直，狭纺 锤形。茎单生，高1 0 0 一2 0 0 厘米，有纵棱，幼时绿色，后变褐色或红褐色，多分枝。 叶纸质，绿色，茎下部叶宽卵形或三角状卵形，三至四回栉齿状羽状深裂，每侧有裂片 五至八牧，裂片长椭圆形，再次分裂，小裂片边缘具多枚栉齿状三角形或长三角形的深 裂齿，裂齿长i2 毫米，宽0 5 1 毫米，中肋明显，在叶面上稍隆起，叶柄长l2 厘米；中部叶二至三回栉齿状羽状深裂，近无柄，稀少为细短狭线形，具短柄；上部叶 与苞片叶一至二回栉齿状羽状深裂，近无柄。头状花序球形，直径l i5 2 5 毫米，有短 梗，下垂或倾斜，基部有线形的小苞叶，在分枝上排成总状或复总状花序，并在茎上排 成开展、尖塔形的匮锥花序。总苞片3 4 层，花深黄色，雌花l o 一1 8 朵，花冠狭管状， 花柱线形，两性花1 0 3 0 朵，花药线形。瘦果小，椭圆状卵形，略扁。花果期8 1 1 月( 石铸，等，1 9 8 3 ) 。 药用价值：该种含有一种倍半萜内脂化台物“青蒿素”( a r t e m ls i n i n ) ，分子式为 c 。h 2 。o s ，为治疗疟疾的有效成分。疟疾是全球贫困国家的头号杀手疾病，每年在全球造 成数亿人感病，至少2 0 0 万人死亡。由于疟原虫对氯喹等传统抗疟药的耐受性口益增强， 青蒿素成为了治疗疟疾的线用药，并且，因其具有独特的结构及药理作用，至今未发 牛抗药性的病例。青蒿素已被w t o 列入国际药典，这是我国第一个被国际公认的具有自 主知识产权的独宅q 新药。近年来的研究表明，青蒿紊对乳腺癌细胞有明显的选择性和杀 伤性，青蔫有可能成为无毒的抗癌药，人们特别希望青蒿素及其衍生物能在治疗艾滋病 及相关疾病方面取得进展( 王宗德，等，1 9 9 9 ) 。 1 2 马铃薯丛枝植原体的概述 1 2 马铃薯丛枝植原体的概述 第一章文献综述 学名：马铃薯丛枝植原体p o t a t ow i t c h e s b r o o mp h ”o p l a s m a 分类地位：三叶草丛生组( c l o v e r p r o l i f e r a t i o ng r o u p ) ，1 6 s r a 亚组。 分布：亚洲、欧洲、北美许多国家。我国目前尚无发生，为我国出入境有害生物检 疫对象。 寄主：番茄，马铃薯，烟草。 症状：马铃薯病株的症状主要是丛生，形成发状新芽，与其感染翠菊黄化病时的表 现的症状不同。番茄病株的症状则是黄萎、丛枝，与感染翠菊黄化病时的症状无区别。 传播媒介：叶蝉p e 懈谢妇j m “口m 和昆，0 ，叩“s 加v o p f c ，驸。 防治方法：在症状刚出现最初病害迹象时，用四环素处理可不致发生过早死亡，但 不能根治，一般在处理后5 0 天左右，仍可复发。主要的防治措施为加强检验检疫，采 用无病的马铃薯种子繁殖( 刘仲健，等，1 9 9 9 ) 。 1 3 中草药青蒿的鉴别方法 1 3 1 形态鉴别 传统的形态鉴别方法只能依据成株期及花期的叶片及花序形态对黄花蒿加以鉴定， 对种子和幼苗的鉴别尚存困难。 1 3 2 超微结构鉴别 利用电子显徼镜对细微结构进行观察，主要包括孢粉学和各种表皮的微形态学。该 方法费时、费力，且需要特殊的仪器，无法进行快速准确的鉴别。 13 3 细胞学标记 主要是指染色体的核型，包括染色体的数目、大小、随体、着丝点等。 1 3 4 同工酶标记 同工酶是基因的直接表达产物，是指催化相同的化学反应，但其蛋白质结构、理化 性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。同工酶是分子水平的指标，按照一个 基因编码一个同工酶亚基的理论，可从同工酶的表现型变异直接推测其基因型的变异。 1 3 5 分子标记 指d n a 或r n a 标记。1 9 8 0 年b o s t e i n 将生物个体之间d n a 序列的差异作为标记用于 遗传作图，从此开创了在b n a 水平上研究遗传变异的新阶段。近1 0 年来，在人类基因 组研究计划的推动下，分子标记的研究得到了迅速的发展。当前分予标记已广泛应用于 作物遗传资源研究，被称为分子种质资源鉴定。 13 6 常用的分子标记技术 1 3 6 1r f l p 标记( r e s t r jc t i o nf r a g m e n tl e n g t hp 0 1 y m o r p h i s m ，限制性片段长度 多态性) 4 沈阳农业大学硕士学位论文 其原理是检测d n a 在限制性内切酶酶切后形成的特定d n a 片段的大小。这种方法重 复性好，结果稳定可靠。但是它所需样品的d n a 量较大，灵敏度不高，费时、费力、周 期较长，而且费用昂贵。 1 3 6 2r a p d 标记( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y i n o r p h i cd n a ，随机引物扩增d n a 多态性) 其原理是采用l o 个碱基的寡聚核苷酸作为引物，对所研究的品种基因组d 进行 p c r 随机扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳、溴乙锭染色后，用紫外光检测。这种方法技术 简单，只需少量d n a 样品，成本较低，安全性好。其最大的缺点是结果受条件影响大， 重复性不好。 1 3 6 3a f l p 标记( a 【i l p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y 皿0 r p h i s s ，扩增片段长度多态 性) 其原理是应用限制性内切酶将d n a 进行限制性酶切，得到的d n a 片段连上通用的接 头形成一个带接头的特异片段，经p e r 法扩增、电泳而显示多态性的d n a 片段。可获得 在某一品种出现而在另一品种不出现的特定的d n a 谱带，从而分离鉴定出不同品种。这 种方法d n a 用量少，灵敏度高，稳定性和重复性均较高，其缺点是技术难度较大，同时 成本也较高。 1 3 6 4s s l p 标记( s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简单序列重复长度多态 性) 通过特异性引物对s s r ( 简单重复序列) 进行p c r 扩增，可以检测到在s s r 中由于 重复单位数不同而造成的d n a 区域的多态性。目前，这种方法己被广泛应用于资源鉴定 的研究中。s s l p 有两大优点：一是多态性频率高；二是具有p c r 方法所具有的优点，通 过p c r 扩增植物基因组中所含有的重复序列区域。但是要克隆足够多的s s r 进行测序， 需要投入足够的资金、人力和时间。 1 4 植原体的检测方法 1 4 1 传统检测手段 根据引起的病害的独特症状初步推断，再用四环素喷洒叶面或浸泡根部，若症状受 到抑制，则进一步说明病因来自植原体，最后通过超薄切片法直接观察病原体的形态加 以确定。但仅凭形态观察难以鉴定植原体的种类。 1 4 2 组织化学技术检测 如迪纳氏染色法，苯胺蓝染色法，及d a p i 染色法。上述三种方法中，d a p i 染色法 较为可靠，但这些组织化学检测法都是对植原体的间接检测，而不是对植原体本身的特 异性染色，容易造成假阳性。 1 43 血清学检测 第一章文献综述 对植原体的检测是在借鉴植物病毒检测技术的基础上，对方法加以改进而得到的， 主要有酶联免疫吸附分析法和免疫荧光染色法，其特异性和灵敏度均高于以上两种方 法。目前，已研制出多种抗来源于植物和来源于介体昆虫的部分纯化的植原体抗原的多 克隆抗血清。但多数抗植原体富集抽提物的多克隆抗血清与健康植物寄主抗原具有强烈 的交叉反应。虽然这一问题可通过制备植原体抗原的单克隆抗体得到克服，但正因为这 些单克隆抗体的高度特异性( 甚至只与植原体单一的部位反应) ，使单克隆抗体在植原 体种级的检测中受到限制。 1 ，4 4 核酸杂交检测 植原体基因组中一系列随机克隆d n a 片段，可根据其能与感病植物或介体虫媒的 d n a 杂交进行筛选，植原体特异性的d n a 序列可进行标记用作d n a d n a 杂交分析中的探 针。1 9 8 7 年首次报道对植原体d n a 成功的分离和克隆，并创立灵敏的杂交分析法用于病 植物和虫媒植原体的检测。迄今为止，核酸杂交检测己成功地用于对许多种植原体的检 测，也成功地应用于植原体的区分及其分布和生态学的控制。该方法具有较高的特异性 和准确性，但技术难度较大。 14 5p c r 检测 p c r ( p 0 1 y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 即聚合酶链式反应，自9 0 年代起，p c r 技术已 广泛地应用于生物学各领域，解决了许多传统技术难以解决的问题，同样，p c r 技术也 被应用于植原体的检测。s u j u nd e n g 等用核酸探针杂交技术结合p c r 技术证明三叶草串 生病植原体与马铃薯丛枝植原体遗传关系较近而不同于其它4 种植原体。随着p c r 技术 越来越多地应用在植原体的检测中，大量的核酸序列得到公布，可以很容易地在基因库 中找到相应的基因序列用于植原体的检测。p c r 技术具有快速、敏感、简便、特异等优 点，但其强大的扩增能力和极高的检测灵敏度，使极微量的污染即可导致假阳性的结果， 并且在实际的检测工作中，要通过对p c r 扩增产物的测序结果分析来确定植原体的种类， 所需的时间较长，不能满足快速检测的需要。 1 5 用于检验检疫领域的实时荧光p c r 技术 传统的p c r 技术以及在此基础上发展起来的各种分子标记技术主要是用于科学研 究，作为检验检疫技术特别是具有法律效力的检验检疫技术，一直存在着争议和技术上 的困难。主要原因是所需的步骤多、时间长、污染机会较高，因此常规p c r 不适用于商 业性的检验检疫工作。 近年来分子诊断检验技术有了重大的革新，个热点领域就是提高常规p c r 方法的 自动化程度、降低污染的可能性、提高检测准确性，使一些新的p c r 技本不断出现。在 所有以p c r 为基础的改进检测方法和以信号或探针放大为基础的检测新方法中，实时荧 6 沈阳农业大学硕士学位论文 光p c r 技术( r e a 卜t i m ep c r ) 是目前最理想的办法。 实时荧光p c r 技术于1 9 9 6 年由美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司推出，该技术不仅实 现了p c r 从定性到定量的飞跃，而且采用完全闭管检测，不需p c r 后处理，避免了交 叉污染。定量p c r 仪采用激光器光源进行实时监测，保证高能稳定无干扰的荧光激发， 由一系列透镜、滤镜和一个双色镜组成的光学系统将激发的荧光聚焦到光谱仪上光谱 仪以间隔的方式将荧光按照波长的不同分开，进入c c d 相机，序列检测应用软件从c c d 相机中收集这些荧光信号，对数据进行分析。从检测开始到定量结束，整个过程耗时短， 操作方便。这种方法采用一个双标记荧光探针来检测p c r 产物的积累，可非常精确、 重复地定量基因拷贝数，并且比一般的定量方法劳动强度要小得多。 实时荧光p c r 所用的荧光探针主要是基于荧光共振能量转移现象( n u o r e s c e n c e r e s o n a i l c ee n e 唱yt r a n s f e r ，f r e t ) 设计的。当个荧光分子( 又称为供体分子) 的荧光 光谱与另一个荧光分子( 又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子自身的 荧光强度衰减，这种现象即是f r e t 。n t 现象发生程度与供、受体分子的空间距离 紧密相关，一般为7 1 0 m 时即可发生n 也t ；随着距离延长，f r e t 呈1 0 6 显著减弱。 f r e t 现象已广泛应用于生物大分子内和分子间相互作用等生物学研究。 1 5 1t a q m a n 探针 t a q m a l l 技术是在普通p c r 原有的一对特异性引物基础上，增加了一条特异性的荧 光双标记探针。t a q m a n 探针是一段5 端标记报告荧光基团，3 端标记淬灭荧光基团的 寡核苷酸。报告荧光基团如f a m 共价结合到寡核苷酸的5 端，t e t 、v i c 、j o e 及h e x 也常用作报告荧光基团。所有这些报告荧光基团通常都被位于37 端的t a m r a 所淬灭。 当探针完整时，由于报告基团与淬灭基团在位置上很接近。导致其报告荧光的发射主要 由于f o r s t e r 型能量传递而受到抑制( 图1 1 a ) 。当p c r 反应进行到延伸阶段时，t a q 酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链 ( 图1 1 b ) ；当链延伸到探针结合部位时，t a qd n a 聚合酶的5 一3 7 外切活性将t a q m a n 探针水解成单核苷酸，报告荧光基团和淬灭荧光基团由于探针水解而相互分开，与此同 时标记在探针上的报告基团游离出来( 图1 1 c ) ，随后t a q 酶的5 一3 聚合酶活性使 新链继续延伸，聚合结束合成完整的新链( 图1 1 一d ) 。t a q m 粗探针的3 端则经过化 学修饰，以防止其在p c r 过程中被延伸。探针与p c r 产物的结合发生于p c r 的每一循 环，但并不影响p c r 产物的指数积累。报告荧光基团与淬灭荧光基团的分离导致报告 荧光信号的增加，而荧光信号的增加可被系统检测到，它是模板被p c r 扩增的直接标 志。t a q m 锄探针水解有两个前提：第一，引物和探针都必须与模板结合( 杂交) ；第 二，与探针特异结合的d n a 模板得到扩增。基于这两点要求，即使发生非特异性扩增， 也不会影响检测结果。 第一章文献综述 聚自 ，至苎! i 塑 鹭一型：l 一舅：要芸妻翌 4 ”“ a c 傩畲培聚 b ：簌一j 曼， 图1 1 t a q m 荧光探针工作原理 f 嘻1 一1 t h ei n e c h a l l i s mo ft a q m 卸p r o b e d 如上所述，p c r 进行n 个循环，合成了n 条新链的同时，就水解了n 条探针，亦 释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与p c r 反应产物的量呈对 应关系。随着p c r 反应的循环往复，p c r 产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。 如果以每一个p c r 循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以p c r 循环数为横坐标作图， 即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线一称为扩增曲线。当检测标本中含有所要 检测的靶核酸序列时，所得到的曲线呈“s ”型；而当标本中不含靶核酸序列时，则p c r 过程不发生，探针不被水解，也就检测不到荧光信号，此时扩增曲线为一水平线( 图1 2 ) 。 图中的c t 值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。c 代表 循环( c y c l e ) ，t 代表闽值( t l 鹏s h o l d ) ，在荧光定量p c r 技术中，c t 值是一个很重要的 概念。p c r 反应的前1 5 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光闽值的缺省设置是 3 一1 5 个循环的荧光信号的标准偏差的1 0 倍。研究表明，每个模板的c t 值与该模板的起 始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，c t 值越小。 沈阳农业大学硕士学位论文 n g 1 2 ih ec u r v eo t 跚p 1 i 西c a t i o ni nr e a l 。1 1 m ep o l y m e r a s ec h a i nr c a c t i o n t a q m a n 探针的纯度在很大程度上决定了检测结果的真实性和可靠性。探针的纯度 直接影响探针荧光本底的高低，任何标记报告基团而无淬灭基团的分子都是污染源，未 淬灭的报告荧光使探针的荧光本底增高，导致难以辨认由于探针裂解而产生的报告荧光 的变化。同时由于探针标记不完全。即只标记了报告荧光素或只标记了淬灭荧光素或二 者均未标记上，这样，即使荧光探针与扩增产物结合，也不能检测到荧光信号的增长， 很容易造成假阴性。另外，镁离子浓度的高低也直接影响了检测的灵敏度。 1 5 2 a i l p f is e n s o r 探针 a m p l i s e n s o r 也是一种复合探针技术，一个探针上连接一荧光物，另一探针连接一 淬灭物( 图1 3 ) 。两探针长度不同，其中淬灭物标记掇针57 端多出7 个碱基( g c g t c c c ) 。 p c r 扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式p c r 引物连接，p c r 引物的5 末端应有 一段与长探针互补的序列，以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针一引物复 合物作为半套式引物掺入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏了f 黜玎，而产生荧 光。荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法的主要特点：由于采用了半套式 p c r 扩增可提高灵敏度，但无法区分引物二聚体形成产生的非特异扩增信号，这样定量 准确度受影晌；每次p c r 反应前，要先进行a m p l i s e n s o r 的标记，增加了操作步骤和检 验成本；中间需加入半套式引物，但同时增加了污染机会。 qa 线 曲 增 却 扩 q m ， 图 4口 第一章文献综述 通用a m d l i s e n s o r 特异a m d l i s e n s o r qq 半套式p c r 引物 + 斗 r 0 连接反应 qq 1上 。+ r 半套式p c r 扩增 r 外 i 物一 1 1 一 外引物 图卜3 a m p l i s e r i s o r 引物荧光定量p c r 原理 f 皓1 - 3 t h em e c h a n i s mo f a m p l i s e n s o rp m b e s r ：报告基团，0 ：漳灭基团 r ：r e p o r cg m u p q ：q u e n c hg r o u p 1 5 3 分子信标 t y a g i 和斯a m m e r ( 1 9 9 6 ) 首次建立了分子信标( m o l e c u l a rb e a c o n ) 探针。分子信 标长约2 5 n t ，在空间结构上呈茎环结构( 图1 - 4 ) 。分子信标一般包括三部分：环序列、 茎杆部分和连接于茎杆两端的荧光分子。环序列是与靶核酸互补的探针，这一部分长度 为1 8 2 0 n t ，环序列应与靶标分子完全互补：茎杆部分长约5 7 n t ，由与靶序列无关的互 补序列构成，往往由g c 含量较高的核苷酸组成以提高结合能并减少长度，茎杆部分结 合能的选择要与杂交结合能相匹配，此部分的存在使信标分子的杂交特异性明显高于相 应的线性探针；茎杆的两端连接两种荧光素，一端连接荧光分子，另一端连接淬灭分子， 荧光分子一般连接在信标分子的5 端。当无靶序列存在时，分子信标呈发卡结构，茎部 沈阳农业大学硕士学位论文 的荧光分子与淬灭分子非常接近( 7 1 0 n l l l ) ，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以 热的形式散发，此时检测不到荧光信号，即发生了f r e t ；当有靶序列存在时，分子信标 的环序列与靶序列特异性结合，探针自发进行构型变化，形成的双链体比分子信标的茎 环结构更稳定，荧光分子与淬灭分子分开，此时荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸 收，可检测到荧光。 + 荧光分子 靶标 分子信标 杂交物 猝灭分子 图1 1 4 分子信标工作原理 f i g 1 - 4 t h em e c h a n i s mo f m 0 1 e c u l a rb e a c o n 常用的荧光淬灭分子对是5 ( 2 氨乙基氨基奈1 磺酸) ( e d a n s ) 和4 ( 4 一二甲基 氨基叠氮苯) 苯甲酸( d a b c y l ) ，采用d a b s y l 作淬灭剂是由于它对多种荧光素都有 很强的淬灭效率。当受到3 3 6 n m 紫外光激发时，e d a n s 发出波长为4 9 0 啪的亮蓝荧光； d a b c y l 是非荧光分子，但其吸收光谱与e d a n s 的发射荧光光谱重叠。只有分子信标 时，e d a n s 和d a b c y l 距离非常接近足以发生f r e t ，e d a n s 受激发产生的荧光转 移给d a c y l 并以热的形式散发，不能检测到荧光：相反，当有靶核酸存在时即可检测 到荧光。 与r r 硇m a i l 探针类似，分子信标也可加入核酸扩增系统中，对核酸扩增过程随时进 行监测，同时也可对扩增产物直接进行定量捡测。由于采用闭管检测，有效消除了核酸 的交叉污染。此外可选择不同的荧光分子。淬灭分子对，设计产生不同荧光的多个分子 信标( 又称为多色分子信标，m u l t i c o l o r m o l e c u l a r b e a c o n s ) 用于对多个靶核酸或核酸的 不同位点同时进行检测。常用的荧光淬灭分子对有：香豆素( c o 衄a r i n ) ( 蓝荧光) - d a b c y l ：e a d n s ( 蓝绿) - d a b c y l ；荧光素( f l u o r e s c c i n ) ( 绿色) d a b c y l ；荧 光黄( i u c i f e r y e l l o w ) - d a b c y l ；四甲基罗丹明( t e h 狮甜l y h h o d 锄i n ) ( 橙色) d a b c y l ； 德克萨斯红( t e x a sr e d ) 一d a b c y l 等，以上荧光淬灭分子对的淬灭效率均超过9 5 ， 即检测的荧光背景很低。 影响分子信标探针构型变化的参数主要有：臂长、两臂g c 含量、环序列长度和溶 第一章文献综述 液盐浓度，尤其是二价阳离子如m 9 2 + 对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用，在m g ”存 在条件下，4 一1 2 个核苷酸可形成稳定的杂交茎。环序列长度至少应是臂长的2 倍，才能 保证探针与目标d n a 杂交及荧光素与淬灭剂分开。 1 5 4 杂交双探针 该技术就是在普通p c r 基础上增加了一对荧光单标记的探针，两条探针均与引物 结合区之间的病原体核酸发生特异性结合，且结合后的两条探针之间只相隔1 2 个碱基 ( 见图l 一5 ) 。结合于靶序列5 端上的探针在其自身的37 端标记了一种荧光素( 荧光素 a ，图中以绿色表示) ；结合于靶序列3 端上的探针在其自身的57 端标记了另一种荧光 素( 荧光素b ，图中以红色表示) 。当两条探针均呈游离状态时b 不发荧光( 图1 5 a ) ； 而在p c r 的退火阶段，两条探针均与模板相结合，a 和b 之间发生了称之为f r e t 的能 量转移，a 所发出的荧光信号可以被b 所吸收而发出荧光，此时用一种特殊的检测仪器 便可以接收到b 发出的光( 图1 5 b ) ；随着引物介导的新链形成，两条探针被逐一从 模板上取代下来( 图1 5 c ) ；当两条探针由模板上被取代下来重新成为游离状态，仪 器就检测不到b 所发出的荧光( 图1 5 d ) 。 荧光素b 所发出的光强度与模板量成正比，随着p c r 的进行，模板量呈指数增长， 探针与模板结合的量同时增长，能量转移也同时增长。检测每一个p c r 循环退火阶段荧 光素b 的荧光强度，以所检测到的荧光量为纵坐标，以p c r 循环数为横坐标，便可到扩 增曲线，从而实现了对未知标本进行定性及定量检测。 图卜5 杂交双探针的工作原理 f i g 1 5 t h em e c h a n i s mo f t h ed o u b l eh y b r i d i z a t i o np r o b e s 1 ，6 本研究的目的和意义 1 2 中草药青蒿，学名黄花蒿( 爿，p 卅如蛔册n “dl ) ，是我国第一个被国际公认的具有自 沈阳农业大学硕士学位论文 主知识产权的独创新药，其含有的抗疟成分青蒿素，可治疗各类疟挨，并具有低毒、高 效、无副作用的特点。至今尚未发生抗药性。虽然黄花蒿在世界范围内广泛种植，但青 蒿素的含量随产地不同而差异极大。现有调查结果显示，除我国川、桂等地区之外，国 外及国内绝大多数地区生长的黄花蒿中青蒿素的含量都很低( 不足o 1 ) ，使得青蒿素 的天然资源相对匮乏( 陈有根，等，2 0 0 1 ) 。目前，各国科学家均致力于化学合成青蒿 素的研究，虽已取得一些明显的进展，但目前尚未显示出商业的可行性，从植物原料中 提取分离仍是青蒿素的唯一来源。青蒿素的短缺己引起世界卫生组织的担忧。作为我国 特有的抗疟植物资源，黄花蒿应该得到合理开发利用以及有力保护，专家建议严禁黄花 蒿种子和种苗出口，以保护我国这一重要植物资源的天然垄断权。 目前，对黄花蒿的鉴别主要依靠传统的形态鉴别方法，传统的形态鉴别方法只能依 据成株期及花期的叶片及花序形态或超微结构特征对黄花蒿加以鉴定，对种子和幼苗的 鉴别尚存困难，近年发展起来的各类分子标记技术虽然准确性高，但所需的时间长、技 术难度大，不适用于出入境检验，因此，建立一种快速准确、适于海关查验的鉴别方法 势在必行。 马铃薯丛枝植原体( p o t a t o 、v i t c h e s b r o o mp h y t o p l a s m a ) ，是我国法定的检疫对象。 在亚洲、欧洲、北美许多国家均有发生，一旦发生无法根治，唯一有效的防治措施是加 强检验检疫，种植无病的种苗。 目前，国内外对马铃薯丛枝植原体的研究较少，我国尚未建立起一套针对马铃薯丛 技植贩体的有效检测体系。传统的检测方法如生物学测定、电镜观察及组织化学技术测 定等都比较耗时费力，而且经验性强、准确性差，不能满足口岸检疫快速验放的要求， 更难以标准化和大规模推广应用。随着生命科学和基础科学的迅猛发展，血清学、核酸 杂交及聚合酶链式反应( p c r ) 等方法、技术逐步应用到植物病原细菌的检测和鉴定工 作中，这些方法特异性好，灵敏度高，但易出现假阳性或假阴性结果，容易对实验室造 成污染，也容易对实验人员的身体造成伤窖。因此，迫切需要建立套更为先进、快速、 准确、灵敏的检测方法，能够为检验检疫系统，技术监督部门和马铃薯种苗健康捡测领 域提供快捷、准确的实用技术。 实时荧光p c r 技术是近几年发展起来的新的检测方法，该技术是在常规p c r 的反应 体系中加入一条荧光标记探针，通过荧光信号的累积实现p c r 反应的实时监控，目前已 广泛应用于临床病原体、遗传病的诊断及转基因产品的检测等领域。应用实时荧光p c r 技术，可以较好地避免传统检测方法和各类分子检测方法所存在的问题( 朱水芳，等， 2 0 0 3 ) 。本文主要应用t a q m a n 实时荧光p c r 技术，研究对黄花蒿和马铃薯丛枝植原体的 特异基因序列进行检测，以达到对黄花蒿和马铃薯丛枝植原体快速准确检测的目的。 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1供试材料 2 1 1 供试植物材料 试验中所用3 种黄花蒿材料分别采自辽宁、北京、湖南三地，其余8 种蒿属材料均 采自辽宁沈阳。 表l植物样本来源 i 抽l el o r i g i no fp l a n ts a m p i 髂 2 12 供试植原体及细菌材料 试验中所用1 2 个植原体1 6 sr d n a 质粒以及7 个细菌菌株均由中国检验检疫科学 研究院动植物检疫实验所植物检疫实验室提供。马铃薯丛枝植原体病株为中国检验检疫 科学研究院动植物检疫研究所植物检疫实验室保存提供。 表2 植原体及细菌名单 i h b i e2t h el i s to f p h y t o p l a s m aa n db a c t e r i a 沈阳农业大学硕士学位论文 s p w b甘薯从枝病原 植原体花生丛枝组 s w e c tp o t a t ow i t c h e s ，_ b r o o mp h y 【o p l 船m ap h y t o p l 嬲m ap c 删tw i t c h e s b r o o mg r o u p c p三叶草丛生病原植原体三叶草丛生组 c i o v c rp r o l i f e r a t i o np h ”o p l a s m ap h ”o p l 螂ac l o v e 7p r o l i f b r a t i o ng r o u p c y 椰f 致死黄化病原植原体椰子致死黄化组 ( 二o n u tl 甜试y e l l o wp h 计印l 嘲a p 啦p 1 鹪m ac o c o n u ti 酣my e l l o w s 鲫邮 c m l o 樱桃致死黄化病原 植原体榆树黄化组 c h e yl e t h a iy e l i o w sp h y o p i a s m ap h ”o p l 嚣m aa s hy e l l o w sg m u p a s y白腊树黄化病原植原体白腊树黄化组 a s h ”l l o w 8p h ”0 p l a s m a p h y t o p i a 锄aa s hy e l l o w s 掣o u p l w 丝瓜丛枝病原植原体丝瓜丛枝组 l o o 劬w i t c h e s - b r o o mp h ”o p l 鹪l n a p h y t 叩1 a 锄a 1 0 0 f 曲w i t c h c s _ b m o m g m u p p p w木豆丛枝病原植原体木豆丛枝组 p i g e 叩p e aw i t c h e s b r o o mp h y t o p l a s m ap h y f 叩l 跏ap i g e o np e 8 、v i t c h c s - b r o o m 缈“p p w b马铃薯丛枝病原三叶草丛生纽 p o t 8 i ow i t c h c s b r 0 0 mp h y t o p l a s 眦c l o v c rp m l i f b 刚鲫“p p d 梨衰退病原植原体苹果丛簇组 p e 盯d e c l i n ep h y t o p l 衄m a p h y i o p l 越m a 印p l ep m i i f c m t i o n x c 甘蓝黑腐病菌细菌黄单胞菌属 m h o m o 煳c 口”q 弛s 妒拓p y c 讲”p e s 打妇x n 柚o m o n o s p s 丁香假单胞菌 细菌假单胞属 p s e 砌o m o 嘲掣r i h g 口e 印毋i 他a e p 3 8 l d o m 。啪s r s 香蕉细菌性枯萎病菌 拉尔氏菌属 舶，雕o n i 口0 0 肠，嘏c p 珊“埘勘细d h j d e c胡萝h 软腐病菌细菌欧氏杆菌属 e n i n i oc甜口mvon口erwin证 p s s玉米细菌性枯萎病菌泛菌属 p 口m o s t 删n 1 i i 目砖s t e w n r i i p n m o e d a t 根癌土壤杆菌属细菌土壤杆菌属 a g m b a c l e r 沁mm m e 轴c i e m 臣f 田b d c t e r 沁m c f 菜豆枯萎病菌短小杆菌属 c k d 如c 阳，m m 酗c c “咖地，玎p v c 甜f 0 6 口c 把，衄州 o m 晌c 把m 第二章材料与方法 2 2 仪器和试剂 仪器：超净工作台，实时荧光p c r 仪( a b i7 7 0 0 ) ，p t c2 0 0p c r 扩增仪( m jr e s e a r s h ) ， 核酸蛋白质分析仪( b e c k m a nd u 6 4 0 ) ，凝胶扫描仪( a l p i a5 5 0 0 ) ，台式冷冻离 心机( a i l e g r a2 1 r ) ，电泳仪( d y y 一6 c ) ，双蒸水器( 上海s z 一9 3 ) ，恒温摇床。 试剂：f a s t s t a nt a qd n a 聚合酶、m g c l2 和d n ar e a c t i o nb u 腩r 购自p r o m e g a 公司； d n t p 、】p t g 、氨苄青霉素、x - g a l 、e d l t a 、s d s 、c t a b 、t r i s 等购自s i 肿a 公司；分 子量标准d l 一2 0 0 0 、p m d l 8 一t 载体试剂盒和p c r 产物凝胶纯化试剂盒等购自大连宝 生物生物工程公司。 2 3 培养基及溶液配制 c t a b 抽提液：2 ( w ，v ) c t a b ，1 0 0 m m o l lt r i s c l ，2 0 m m o l le d t a ，1 4 m o 班。n a c l p h8 o 。 c t a b 沉淀液：1 ( w v ) c t a b ，5 0 m m o l