（凝聚态物理专业论文）纳米晶上转换发光和zno纳米复合物及其耦联蛋白质的研究.pdf

中荚文摘要 纳米晶上转换发光和z n o 纳米复合物及其 耦联蛋白质的研究 王新( 凝聚态物理) 导师：孔祥贵研究员 摘要 荧光免疫分析已成为生物学研究的一种重要技术，其在生物分子识别、免疫 检测、细胞成像、d n a 测序、临床诊断等领域得到了广泛的应用。由于荧光纳 米晶比有机染料分子具有更优越的光学性质：光学性质稳定、没有光漂白现象、 s t o k e s 频移大、窄带发射，荧光寿命长，因此荧光纳米晶用于荧光生物探针将具 有更高的特异性和更高的灵敏度。本论文基于上转换发光的纳米晶和荧光纳米复 合物作为研究对象，研究了铒离子掺杂氧化钇和氧化锌纳米晶的上转换发光的光 学性质；制各和表征了水溶性的z n o ，a u 纳米复合物，实现了z n o a u 纳米复合 物和蛋白质的生物耦联。取得了如下实验结果： 1 燃烧法制备了立方相的y 2 0 3 ：e r 3 + 纳米晶。在4 8 8n m 光激发下观察到了上 转换紫光和蓝光的发射；而在9 8 0n m 光激发下观察到上转换红光、绿光以及紫 光的荧光发射；通过分析上转换紫光的荧光光谱和其荧光强度随激发功率变化的 规律确认9 8 0 和4 8 8m n 光辐照样品观察到的上转换紫光发射分别是三光子和双 光子的吸收过程。 2 溶胶一凝胶法制备了尺寸约5 0n m 的z n o ：e r 3 + 纳米晶。经退火处理后，在 9 8 0n m 的红外光激发下观察到样品的上转换绿光和红光发射。讨论了退火温度 对样品上转换发光性质的影响，发现退火温度升高导致上转换荧光的增强及其荧 光光谱呈现更多的精细结构，主要是由于退火温度升高减少了样品表面高振动能 量的有机基团数量从而减低了其产生的多声子弛豫率以及铒离子周围的晶体场 作用增强。利用铒离子的结构探针特性，分析了退火温度为5 0 0 和7 0 0 两个 样品的上转换绿光光谱随激发密度交化的规律，发现铒离子在这两个样品中的能 王新博士论文蚋米晶上转挟发光和7 _ ：a o 纳米复合物爰其耦联蛋白质的研究 级结构不同，这是由于铒离子在样品中所处的化学( 微) 环境发生了改变的结果， 并且进一步通过变化测试温度实验验证了这个结果。利用上转换荧光强度随激发 功率的变化关系确认样品的上转换发光是一个双光子的吸收过程。 3 制备了水溶性稳定的z n o - a u 纳米复合物。比较z n o - a u 纳米复合物和纯胶 体a u 的吸收光谱发现纳米复合物的等离子体吸收带相对于纯胶体a u 发生了8 n m 的红移现象，这是由于半导体z n o 和金属a u 接触发生了电荷转移从而改变 了a u 表面的电荷分布所致。观察到了z n o a u 纳米复合物的荧光发射，其来源 于z i l o 的激子发射和表面氧空位缺陷态的发射。此外，在3 2 5s l n 激光激发下观 察到了z n o - a u 纳米复合物的共振拉曼散射增强效应。 4 利用缩合反应实现了z n o - a u 纳米复合物和b s a 的生物耦联，并且通过凝 胶电泳技术验证了这个结果。 关键词：铒掺杂纳米晶，上转换发光，纳米复合物，生物耦联 玎 中英文摘要 o p t i c a lp r o p e r t i e so fu p c o n v e r s i o nn a n o c r y s t a l s z n o n a n o c o m p o s i t e sa n db i o c o n j u g a t i o no fz n o n a n o c o m p o s i t e sw i t hp r o t e i n x i nw a n g d i r e c t e db yp r o f x i a n g g u ik o n g a b s t r a e t f l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a yi sas t a n d a r da n ds i g n i f i c a n tt e c h n i q u ei nb i o l o g y w h i c hh a sb e e nw i d e l yb ee m p l o y e di nb i o m o l e c u l a rr e c o g n i t i o n , i m m u n o a s s a y ， c e l l u l a ri m a g i n g ，d n as e q u e n c i n ga n dc l i n i c a ld i a g n o s t i c se t c a sb i o p m b e s ， f l u o r e s c e n tn a n o c r y s t a l sh a v ea b i l i t i e st op r o v i d eh i g h e rs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yi n b i o m o l e c u l a xd e t e c t i o nt h a no r g a n i cd y es m a l l m o l e c u l e sd u et os e v e r a la d v a n t a g e si n o p t i c a lp r o p e r t i e so fh i g hp h o t o s t a b i l i t y ；w i t h o u tp h o t o b l e a c h i n g ；l a r g es t o k e ss h i f t ； n a r r o wb a n de m i s s i o n s ；l o n gf l u o r e s c e n tl i f e t i m e i nc o n t r a s t 、i mc o n v e n t i o n a l o r g a n i cd y es m a l l - m o l e c u l e s i nt h i st h e s i s ，t h eu p c o n v e r t e dl u m i n e s c e n t ( u c l ) n a n o c r y s t a l s a n df l u o r e s c e n tn a n o c o m p o s i t e sw e r ec h o s e n 笛t h es u b j e c to f i n v e s t i g a t i o n , w h i c hw a sf o c u s e do nt h eu p c o n v e r s i o np r o p e r t i e so fe r b i u m d o p e d y t t r i aa n dz i n co x i d en a n o c r y s t a l s ，s y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no fw a t e r s o l u b l e z n o - a un a n o c o m p o s i t e s ，a n db i o e o n j u g a t i o no fz n o - a un a n o c o m p o s i t e sw i t h p r o t e i n t h em a i nr e s u l t sa r c a sf o l l o w s ： 1 t h ec u b i cn a n o c r y s t a l l i n ey 2 0 3 ：e r 3 + p a r t i c l e sw a so b t a i n e du s i n gas o l u t i o n c o m b u s t i o n ( p r o p e l l a n t ) s y n t h e s i sp r o c e d u r e u p o n4 8 8n n lw a v e l e n g t hl i g h t e x c i t a t i o n , b o t hv i o l e ta n db l u eu p c o n v e r t c de m i s s i o n sw e r eo b s e r v e di nt h es a m p l e s u p o n9 8 0n l nw a v e l e n g t hl i g h te x c i t a t i o n , h o w e v e r , t h ev i o l e tu p e o n v e r t c de m i s s i o n s a l ea l s oo b s e r v e dw i t ht h eo c d 【l 玎珊o fg r e e na n dr e du p c o n v e r t e de m i s s i o n s t h e v i o l e tu p c o n v e r t e de n f i s s o ns p e c t r at o g e t h e rw i t l lt h ed e p e n d e n c eo fi n t e g r a t e d m 王新博士论文 纳米矗上转抉发光和z n o 蚋米复合物友其耦联蛋白质的研究 l u m i n e s c e n ti n t e n s i t i e so np u m p i n gp o w e rr e v e a lt h eu p c o n v e r s i o nm e c h a n i s m sa r e 廿1 r c ea n dt w o p h o t o np r o c e s s e sc o r r e s p o n d i n gt o9 8 0a n d4 8 8m l i g h te x c i t a t i o n , r e s p e c t i v e l y 2 e r b i u m - d o p e dz n on a n o c r y s t a l sw i t ht h ed i a m e t e ro fa b o u t5 0n mw e r e p r e p a r e du s i n gas o l - g e lm e t h o d w i t h9 8 0 姗l i g h te x c i t a t i o nt h eg r e e na n dr e d u p c o n v e r t e de m i s s i o nw e r eo b s e r v e di nt h ez n o ：e n a n o c r y s t a l sf o l l o w i n ga l l a n n e a l i n gp r o c e s s i tw a so c c u r r e dt h a tt h eu c li n t e n s i t i e sa n di n c r e a s eo ff i n e s t r u c t u r ei nt h ee m i s s i o ns p e c t r ao ft h es a m p l e sw e r ee n h a n c e dw i t ht h ei n c r e a s eo f a n n e a l i n gt e m p e r a t u r e w h i c h 、) i 眦a s c r i b e dt ot h ed e c r e a s eo fm o u n to fo r g a n i c g r o u p s ( - c o o ha n d - 0 h ) w i t hh i 曲v i b r a t i o ne n e r g yo nt h es a m p l es u r f a c ea n dt h e e n h a n c e m e n to fc r y s t a lf i e l de f f e c t sa r o u n dt h ee r b i u mi o n s a c c o r d i n gt ot h e p r o p e r t i e so fe ri o n sa ss t r u c t u r ep r o b e ，w eo b s e r v e dt h a tt h ei n c r e a s eo fe x c i t a t i o n d e n s i t yw i t ht h e $ a l n ev a r i a t i o nr a t er e s u l t e d i nt h ed i f f e r e n tu p c o n v e r t e dg r e e n e m i s s i o ns p e c t r af r o mt h et w os a m p l ea n n e a l e da t5 0 0a n d7 0 0 ，r e s p e c t i v e l y ， w h i c hw a sa t t r i b u t e dt ov a r i a t i o no fe r b i u me n e r g ys l x u c b l r ef r o mt h ed i f f e r e n t c h e m i c a le n v i r o n m e n to f e ri o n si nt h ez n o n a n o c r y s t a l sa n n e a l e d 砒5 0 0a n d7 0 0 r e s p e c t i v e l y t h ef l u o r e s c e n ts p e c t r at o g e t h e r 、析mt h ed e p e n d e n c eo fi n t e g r a t e d i n t e n s i t i e so np u m p i n gp o w e rr e v e a lt h ev i s i b l eu p c o n v e r s i o nm e c h a n i s mo f t w o - p h o t o np r o c e s sw h e nf o l l o w i n gf r o m9 8 0 s l nl i g h te x c i t a t i o n 3 t h ew a t e r - s o l u b l ea n ds t a b l ez n o - a un a n o c o m p o s i t e sw e r es y n t h e s i z e db yt h e g r o w t h o fa uo nt h es u r f a c eo fz n on a n o c r y s t a l s t h es t r u c t u r eo ft h e n a n o c o m p o s i t e sw a sc h a r a c t e r i z e di nv i r b l eo ft h eh i 曲- r e s o l u t i o nt e ma n dx r d t h ea b s o r p t i o n s p e c t r a o fn a n o c o m p o s i t e sw e r ec o m p a r e dt o ；h a tp u r ea u n a n o c o l l o i d s ，a n dt h er e d s h i f lb y8n ma tt h es u r f a c ep l a s m ab a n do fa ui nt h e n a n o c o m p o s i t e sw a so b s e r v e dc o r r e s p o n d i n gt ot h a to fp u r ea un a n o c o l l o i d s t h i s r e d s h i f li sa s s i g n e dt ot h ec h a r g ev a r i a t i o na r o u n da u n a n o p a r t i c l e sd u et ot h ec h a r g e t r a n s f e rb e t w e e na na n dz n ow h e nm e t a lc o n t a c t sw i 血s e m i c o n d u c t o r t h e p h o t o l u m i n e s c e n c eo ft h en a n o c o m p o s i t e sw a so b s e r v e d , w h i c hc o n c l a i n s 臼0 e m i s s i o nb a n d so ft h ea l t o wu ve m i s s i o nb a n da r o u n d3 6 8n n l i sa s c r i b e dt o b a n d - e d g er e c o m b i n a t i o n , a n dt h eb r o a dv i s i b l ee m i s s i o no r i g i n a t e sm a i n l yf r o mt h e i v 中荚支摘要 r e c o m b i n a t i o no fh o l e sw i t ht h ee l e c t r o n so c c u p y i n gt h es i n g l yi o n i z e do x y g e n v a c a n c y i na d d i t i o n , t h ee n h a n c e m e n to fl 七s o n a q c er a m a ns c a t t e r i n go ft h e n a n o c o m p o s i t c sw a so b s e r v e dw i t he x c i t a t i o no f3 2 5n n ll i g h tf r o mh e c dl a s e r , r e s u l t i n gf r o mt h ee n h a n c e m e n to f l o e a lp o l a r i z a t i o nf i e l di nt h ez n o 4 t h eb i o c o n j u g a t i o no fz n o - a un a n o c o m p o s i t c sw i t hb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w a sa c h i e v e db yt h ec o v a l e n tb i n d i n ga n dw a si d e n t i f i e db yg e l e l e c t r o p h o r e s i s t e c h n o l o g y t h ec o m p a r i s o no fb s ac o n j u g a t e d 埘mt h en a n o e o m p o s i t e s 试mt h e p r i s t i n eb s aw a sc a r r i e do mb yt h ee l e e t r o p h o r e t i cm o b i l i t y , w h i c hr e s u l ts h o w st h e a c h i e v e m e n to f b s a c o n j u g a t e dw i 也t h en a n o c o m p o s i t c s k e yw o r d s ：e r b i u m d o p e dn a n o e r y s t a l s ；u p c o n v e r t e dl u m i n e s c e n c e ； n a n o c o m p o s i t e s ；b i o e o n j u g a t i o n v 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书 面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全 部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改 编等有碍作者著作权的商业性使用( 但纯使用不在此限) 。否 则，应承担侵权的法律责任。 学位论文知识产权权属声明 本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。知识产权归属中国科学院长春光学 精密机械与物理研究所。长春光学精密机械与物理研究所享有以任何 方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离所后 发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为长春光学精密机械与物理研究所。本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 日期：年月日 导师签名： 日期：年月日 王新博士论文 蚋米矗上转换发光和7 , n o 纳米复合抽度其耦联蛋白质的研究 第一章弓l 言 r i c h a r df e y n m a n 是上个世纪美国最富有传奇色彩的物理学家，他因为对量 子电动力学的贡献而获得了1 9 6 5 年的诺贝尔物理学奖。然而，今天有关纳米科 学的灵感，却来自于r i c h a r d f e y n e m a n 于1 9 5 9 年所作的在底部还有很大空间 的演讲。他以“由下而上的方法”( b o t t o mu p ) 出发，提出从单个分子甚至原子 开始进行组装，以达到设计要求。他说道：“至少依我看来，物理学的规律不排 除一个原予一个原子地制造物品的可能性。”并预言“当我们对细微尺寸的物体 加以控制的话，将极大得扩充我们获得物性的范围。”正如f e y n m a n 的预言，纳 米科学技术在几十年后兴起并迅速得到发展。纳米科学与技术主要包括“3 ：纳米 体系物理学、纳米化学、纳米材料学、纳米生物学等，而纳米材料的制备和研究 则作为整个纳米科技的基础显得尤为重要。 1 1 纳米材料性质和制备 1 1 1 纳米材料的性质 纳米材料的尺度处于原子簇和宏观物体交界的过渡域，是介于宏观物质与微 观原子和分子问的过渡亚稳态物质，它有着不同于传统固体材料的显著的表面与 介面效应，小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，并且表现奇异的力 学、电学、磁学、光学、热学和化学特性。目前描述纳米材料中的基本物理效应 主要是从金属纳米微粒研究基础上发展和建立起来的，要准确把握纳米科技中现 象的本质，必须要在理论上实现从经典物理学向量子物理学的转变。 小尺寸效应：当纳米粒子的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及超导态的相 干长度等物理特征尺寸相当或更小，使得晶体周期性的边界条件被破坏，非晶态 纳米颗粒表面层附近原子密度减少，声光电磁热力学等物质特性呈现显著变化， 如光吸收显著增加，吸收峰的等离子共振产生频移，磁有序态变磁无序态，超导 相向正常相的转变，声子谱发生改变等。表面效应：纳米粒子表面原子与总原子 数之比随粒径的变小而急剧增大后引起的性质变化。研究表明，固体表面原子与 内部原子所处环境不同，前者的周围缺少相邻的原子，有许多悬空键，具有不饱 第一幸引言 和性质，易与其他原子结合而稳定下来。当粒子直径非常小时，表面原子占总原 子的百分数急剧增加其作用就显得异常明显，故使其具有很大的化学活性。纳米 粒子表面积、表面能及表面结合能都显著增大。量子尺寸效应：当粒子尺寸大小 下降到很小时，金属费米能级附近的电子能级由准连续变为离散能级的现象以及 纳米半导体微粒中存在不连续的价带和导带，而能隙也变宽的现象称为量子尺寸 效应。由于晶体尺寸很小，载流予的运动被局域在一个小的体积范围内，类似于 盒子中的粒子，这是一种新的物质状态。它有别于块状大晶体内电子，这种局域 运动的状态下，电子的动能增加，原本连续的导带和价带发生了能级的劈裂，久 保f 3 1 等采用单电子模型求得金属超微粒子的能级间距为艿= 4 e ，3 n ，其中e f 为 费米能级，n 为微粒中的原子数。显然，当n 0 0 时，万一o ，即对大粒子或宏 观物体能级连续，而n 较小时能级则发生了分裂。当能级间距大于热能、磁能、 静电能、光子能量和超导态的凝聚能时，就导致了纳米微粒的磁、光、声、热、 电以及超导电性与宏观存在显著的不同。例如，半导体纳米粒子的粒径小于一定 值时，其吸收光谱和发光光谱会发生“蓝移”现象，即吸收和发光光谱向短波 方向移动，这是由于粒子尺寸下降导致能隙变宽。宏观量子隧道效应：量子相干 器件中的磁通量以及电荷等也具有隧道效应。它们可以穿越宏观系统的势垒而发 生变化，故称为宏观量子隧道效应。 以上简单介绍了纳米材料的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应以及宏观 量子隧道效应，这是纳米微粒与纳米固体的基本特性，使得纳米微粒和纳米固体 呈现许多奇异的物理和化学性质。 1 1 2 纳米材料的制各 纳米材料的制备是纳米科技发展和应用的基础，在纳米材料科学研究中占据 极为重要的地位。其关键是控制纳米粒子的大小以及粒子尺寸分布，所需的设备 也尽可能的简单，方法易操作且重复性好，制备一般要达到表面洁净，粒子的形 状及粒径、粒度分布可控( 防止粒子团聚) ，易于收集，有较好的热稳定性，产 率高等几方面的性质。目前纳米材料化学方法有化学气相沉积、化学沉淀法、水 热合成法、溶胶凝胶法、微乳液法、电化学法，燃烧法等1 4 1 下面对常用的几种 化学方法简单作介绍： l 、化学沉积法 2 王新博士论文蚋米晶上转换发光和z n o 纳米复合物置其耦联蛋白质的研究 化学沉积法是在金属盐类的水溶液中，控制适当条件使沉积剂与金属离子反 应，产生水合氧化物或难溶化合物，然后由于不溶于水或其他溶胶而沉积下来， 再进行分离、干燥或热分解得到纳米粒子。该法又可分为直接沉淀法、均匀沉淀 法、共沉淀法和醇盐水解法。 2 、溶胶凝胶法 溶胶凝胶法是制备材料的湿化学方法中的一种。将易于水解的金属化合物 ( 无机盐或金属醇盐) 在某种溶剂中与水发生反应，经过水解与缩聚过程而逐渐凝 胶化，再经干燥、烧结等后处理，制得所需的纳米材料，其基本的反应有水解 反应和聚合反应。溶胶凝胶法通常是在室温合成无机材料，能从分子水平上设计 和控制材料的均匀性及粒度，得到高纯、超细、均匀的纳米材料。此外，溶胶凝 胶法还用来制备纳米薄膜，用金属化合物制成溶胶，将衬底浸入溶胶后，以一定 的速度进行提拉，在衬底上附着一层溶胶，经一定温度加热即得到纳米微粒的薄 膜，膜的厚度可通过提拉次数来控制。 3 、水热法 水热法是利用特定的高压密闭反应容器( 高压釜) ，采用水溶液作为反应体 系，通过在烘箱中加热至临界温度或接近临界温度，使这个体系在高压的环境中 反应进行无机合成与材料制备的一种有效方法。在水热法中，水起到两个作用： 一是不管液态还是气态可作为传递压力的媒介；另一个是在高压下，绝大多数反 应物均能部分溶解于水，促使反应在液相或气相中进行。水热法工艺流程简单、 条件温度易于控制，适于纳米金属氧化物和金属复合物氧化物陶瓷粉末的制备。 4 、微乳液法 微乳液法( 也称反胶团法) 是将琢种互不相溶的溶剂混合，加入表面活性削， 在表面活性剂的作用下形成均匀的反应器，剂量小的溶剂将被包裹在剂量大的溶 剂中形成一个微泡，微泡的表面由表面活性剂分子组成。将两种包括不同物质的 微乳液混合，化学反应在微泡内进行，使成核、生长、聚结、团聚等过程局限在 一个微小的球形液滴内，从而形成球形颗粒，又可避免颗粒间的进一步团聚。溶 剂的剂量比和表面活性剂的用量决定了微泡的大小和数量。将微泡的大小控制在 纳米量级并在其中进行反应即可得到表面包覆有表面活性剂的纳米材料 5 、电化学法 该法包括水溶液和熔盐的电解。利用电解过程，通过严格控制电极电位，去 3 第一幸引言 除杂质，可以得到优质高纯的粉末根据性能的要求，改变电解参数，可制取不 同形状不同的粒子分布和不同组分的金属、合金以及氧化物粉末。 6 、燃烧法 燃烧法是利用一些氨的化合物( 甘氮酸，尿素) 为助燃剂，在加热的条件下 达到助燃剂的燃点后，通过瞬时的热能使金属盐溶液转化为金属的氧化物或其他 化合物。燃烧法的反应温度可以达到8 0 0 1 3 0 0 。 1 2 荧光免疫技术的应用和发展 荧光免疫分析( f l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y ) 创始于上世纪4 0 年代初，1 9 4 2 年c o o n s 2 1 等多次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可熔性 肺炎球菌多糖抗原，当时由于此钟荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直 至5 0 年代末期，r i g g s 等( 1 9 5 8 年) 合成性能较为优异的异硫氰酸荧光黄。m a s h a l l 等( 1 9 5 8 ) 对荧光抗体方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。随 着科学技术的发展，荧光免疫分析在重大疾病的早期检测及诊断发挥越来越大的 作用。以荧光信号作为免疫技术的种类有：有机荧光素的免疫技术、化学发光的 免疫技术、纳米半导体量子点以及以稀土发光( 稀土有机配合物和无机掺杂纳米 材料) 为荧光探针的免疫技术。荧光免疫分析的原理是将抗原抗体反应的特异性 和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光体为标记物，与已知的抗体( 或抗 原) 结合。但不影响其免疫学特性，然后将荧光体标记的抗体作为标准试剂，用 于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜和光谱仪下，可以直接观察呈现特异荧 光的抗原抗体复合物及其存在部位。在实际工作中，由于用荧光体标记抗体检查 抗原的方法较为常用，所以一般称为荧光抗体技术。 1 2 1 有机荧光素的免疫技术 有机荧光素( 也称有机染料) 是一种被光激发能产生荧光发射，并能作为染 料使用的有机化合物。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光索 ( f i t c ) 、四乙基罗丹明、四甲异硫氰酸罗丹明。利用有些有机荧光素分子可以 和蛋白质上特定的基团共价结合，然后检测待检测的抗原与标记抗体的免疫反应 来达到目的特定的基团存在多种，胺基( a m i n e ) 和巯基( t h i 0 1 ) 是蛋白质中 容易结合的两种基团，蛋白质和肽中的半胱氨酸残基含有巯基，胱氨酸还原时也 4 王新博士论文蚋米晶上转换发光和z n o 纳米复舍勃度其耦联蛋白质的研究 能形成巯基。此外，蛋白质中不存在特定基团也可以用化学方法将巯基引入蛋白 质中。象卤代乙酰类衍生物，顺丁烯二酰亚胺及其他一些巯基反应剂，可以和巯 基共价结合：异硫基酸盐如f i t c ( f l u o r e s e e i ni s o t h i o c y a n a t e ) ，琥珀酰亚胺酯、羧 酸、磺酰氯等，可和氨基共价结合。 图1 1 有机荧光素标记组织细胞和神经元细胞的图像 基于有机荧光素标记抗体和抗原的免疫反应分析，后来发展用其来对组织细 胞和脑神经元进行荧光成像( 图1 1 ) 和对d n a 序列的测序、表达及诊断。图 1 2 是有机染料分子标记d n a 检测碱基配对的数量和分子信标技术。分子信标 技术是两端的核酸序列互补配对，标记在一端的荧光基团如果与标记在另一端的 淬灭基团紧紧靠近，荧光基团被激发后产生的光子则被淬灭剂淬灭。在复性温度 下，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在，环序列将与模板 配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭基团 分开。这时荧光基团被激发，而淬灭作用又被解除，从而发出光子。 、：飞 霉弋兰雾凇一 赫曰_ 图l - 2d n a 的染料荧光探针和分子信标 5 第一幸引言 1 2 2 化学发光的免疫标记 化学发光免疫分析( c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ，c l i a ) 基于化学反 应发光，这种发光是一种特异的化学反应，有机分子吸收化学能后发生能级跃迁， 产生一种高能级的电子激发态不稳定的中间体，当其返回到基态而发出光子，即 为化学发光。将化学发光与抗原抗体相结合而形成的免疫分析技术，即为化学发 光免疫分析。化学发光的发光类型通常分为闪光型( f l a s h t y p e ) 和辉光型( g l o w t y p e ) 两种。闪光型发光时间很短，只有零点几秒到几秒。辉光型又称持续型， 发光时间从几分钟到几十分钟，或几小时至更久。化学发光免疫分析是近十年来 在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析，是继酶免技术、放免技术、荧 光免疫技术之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术。具有高灵敏度、检 测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。化 学发光免疫分析是放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者。 1 2 3 纳米半导体荧光量子点探针 量子点又可称为半导体纳米微晶体，是一种由一v i 族或i i i v 族元素组 成的纳米颗粒，目前研究较多的主要是c d x ( x = s 、s e 、w e ) 。量子点由于粒径 很小( 约1 1 0 0n m ) ，电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分 立能级结构。量子点的体积大小严格控制着它的光吸收和发射特征。晶体颗粒越 小，比表面积越大，分布于表面的原子就越多，而表面的光激发的正电子或负电子 受钝化表面的束缚作用就越大，其表面束缚能就越高，吸收的光能也越高，即表面 效应，它的增强使得其吸收带蓝移、荧光发射峰位也相应蓝移，如图l o 。和有 机荧光素分子相比，以c d s e 为核心z n s 为外壳的纳米颗粒( c d s e ) z n s 具有许多独 特的光学特性。首先，量子点的激发光波长范围很宽，只要能量大于其最小激发 波长的光都可以对其进行激发。因此不同大小的( c d s e ) z n s 量子点可以由同一波 长的光激发，这将给生物学研究带来很大的方便；而对于不同的有机荧光分子， 由于每种荧光分子都有其特异激发波长，常常要用不同波长的光来激发，由于荧 光染料分子荧光特性的限制( 如：荧光光谱较宽、量子产率低、半衰期短) ，限制 了荧光探针作为高通量的生物大分子专一标识的应用。其次，量子点具有较大的 斯托克位移( s t o k e ss h i f 0 和窄对称性的荧光谱峰，其半高峰宽( f u l lw i d t h sh a l f 6 王新博士论文蚋米矗上转换发光和z n o 纳米复合物友其耦联蛋白质的研完 m a xy w n m ) 常常只有4 0n m 或更小。这样就允许同时使用不同光谱特征的量子 点，发射光谱不出现交叠( o v e r l 印) ，或只有很少交叠，使标记生物分子荧光谱的区 分、识别变得很容易，图1 3 是不同尺寸荧光量子点的荧光光谱。 m a n ys h a r p ，d i s t i n c tc o l o r s h 翻w t v i 帆蚋( n m l e 删协n 舯：抽和e 2 9 0 n n m h l t $ 站5 n m 图1 - 3z n s e ，c d s e ，c d t e 荧光量子点的荧光光谱 研究人员们己发现可以用量子点来监测细胞内部或细胞表面的蛋白质，即可 以用量子点来标记一个蛋白质，作为一种观察细胞活动事件的方法。2 0 0 3 年， w u s l 等证明了量子点标记抗体能特异的识别亚细胞水平的分子靶点，如图1 _ 4 所示。他们用量子点标记的羊抗鼠i g o 作为二抗，结合抗h e r 2 单克隆抗体观察 到了乳腺癌细胞表面的h e r 2 。用抗生物素蛋白( a v i d i n ) 交联具有不同发射光谱特 征的量子点，配合生物素标记的二抗和特异性单抗，可同时识别细胞表面的h e r 2 和核抗原，也能同时识别胞浆微管蛋白和核抗原。量子点还可能应用于医学成像， 由于可见光多只能穿透毫米级厚度的组织，而红外光则可穿透厘米级厚度的组织。 因此将某些在红外区发光的量子点标记到组织或细胞内的特异组分上，并用红外 光激发，就可以通过成像检测的方法来分析研究组织内部的情况，达到诊断的目 的【6 】。 以上介绍了有机荧光素免疫标记，化学发光免疫标记，荧光量子点免疫标记 的原理性质等，现在利用纳米粒子的上转换荧光作为探针的免疫标记也发展迅 速，引起了国内外研究工作者的极大兴趣。 本论文的工作的研究背景也是基于上转换荧光纳米晶性质的研究将能应用 于生物免疫标记。下面我们介绍稀土上转换发光在生物技术上的应用 7 ，摹c!暑善e-oz 第一章引言 图1 - 4c d s e 荧光量子点分别标记( a ) 、人上皮细胞核抗原，( b ) 、荧光验证抗 人细胞核抗原不替代i g g ，( c ) 、3 t 3 细胞核的标记，( d ) 、乳腺癌h e r 2 细 胞 1 3 稀土上转换发光在生物技术上的应用 上个世纪5 0 年代，稀土配合物的生物标记的研究受到了人们的关注，稀土 发光具有许多优异的特性，窄的线形发射、荧光寿命长等。但是，由于难于突破 技术上的瓶颈使其发展进步缓慢。随着纳米科学技术的发展，稀土掺杂纳米晶材 料的研究更受人们的关注，它主要可以用于荧光粉、光子剪裁、以及生物技术上。 特别是部分稀土元素具有多光子非线性光学性质，它在光通讯技术得到了广泛的 应用。而稀土掺杂的纳米晶材料的这种非线性光学性质，同样可以应用在生物技 术上，这将极大促进纳米生物技术的发展。稀土掺杂纳米晶的非线性特性是它可 以同时吸收多个长波长的光子转化为一个短波长的光子的发射，这种性质也称为 上转换发光，图1 5 是上转换发射和下转换发射原理图。 上转换发光的稀土纳米晶作为生物免疫标记具有那些优良的特性昵? 我们 详细解析它发光的实质，如果吸收长波长的光子其频率在近红外波段，吸收多个 光子可以转化为蓝、绿，红的可见荧光发射，在同样近红外波长的激发下单纯的 生物分子却没有这种非线性性质，将观察不到可见的荧光发射，所以它的应用将 8 王新博士论文 纳米晶上转捷发先和z n o 纳米复合物友其耦联蛋白质的研究 极大提高信噪比，达到检测灵敏度被提高。另外，稀土离子的发光本身具有很多 优点：窄线发射( 荧光峰宽窄) ；大的s t o k e s 频移：稀土荧光的长寿命发射( m s ) ；稀土荧光覆盖范围大，可以适于多色标记；占据晶格格位稀土离子的荧光 不受外界环境的影响，如缓冲溶液p h 值、盐浓度。稀土掺杂的纳米晶用于生物 标记技术的特性归纳为：s t o k e s 频移大的窄带发射、荧光寿命长、光学性质稳定、 高的信噪比，检测灵敏高、多色标记。表l - l 进行了有机荧光素的免疫标记、化 学发光免疫标记、荧光量子点探针和上转换发光的稀土掺杂纳米晶的生物标记技 术的对比。 表1 1几种免疫荧光生物标记技术优缺点对比 化学发光简单、易操作 易受环境影响大( p h 、浓度) ，其 广泛应用被受限 图1 5 上转换发光原理是吸收红外光转化为可见光的发射过程 1 3 1 上转换发光颗粒的生物技术上应用 利用稀土离子掺杂微小颗粒的上转换发光性质，研究工作者在这个领域做了 9 第一幸引言 许多有意义的工作。从现有的文献报道它的应用主要是在核酸的检测、前列腺细 胞和组织的检测、乳突淋瘤( p a p i l l o m a v i r u s ) 的早期诊断和检测等领域。z j i m a n s ， c ta l 【7 1 1 9 i 小组在这个领域作出了贡献，他们的结果如下，图1 6 是石蜡植入生物 素化( 或抗生素) 前列腺组织切片的自发荧光和利用上转换荧光颗粒标记的图像 对比。图1 6 a 是有机染料标记前列腺组织的荧光图像，而图1 - 6 b 是在红外光 激发下利用上转换荧光标记组织的荧光图像，从而来检测前列腺组织的特异抗 原。从实验结果可以看出，上转换荧光颗粒( y 2 0 2 s ) 标记前列腺组织的图像没 有生物组织的背景荧光干扰，很容易辨别组织的分布及形状，然后可以经过切片 来进一步检测这些组织的前列腺特异抗原的含量，从而达到检测的目的。 ab 图l 一6 上转换发光粒子检测前列腺组织切片的前列腺抗原，有机染料标记 前列腺组织的荧光图像；( b ) 、上转换标记前列腺组织的荧光图像( 没有 组织的背景荧光干扰) 1 0 王新博士论文纳米晶上转换发光和z a o 纳米复合抽及其耦联蛋白质的研充 z j l = m a n s ，e ta l 研究小组利用上转换荧光颗粒( y 2 0 2 s ) 来标记核酸并和有机 染料( 荧光素) c y 5 的检测灵敏度进行了比较。发现上转换荧光颗粒标记核酸被检 测的灵敏度是有机染料c y 5 的4 倍，如果能提高上转换效率它的灵敏度还能提 高。图1 7 是巧i m a m 小组用c y 5 和上转换荧光颗粒标记核酸的原理图。首先是 d n a 和生物素杂交，再利用生物素和c y 5 分子及功能化的上转换荧光颗粒相结 合。利用聚焦激光扫描技术获得图像，其实验结果为图8 所示，绿颜色是上转换 荧光粒子标记核酸的图像，白色是有机染料c y 5 的结果，图中自箭头表示两类 标记灵敏度极限所对应的不同的核酸浓度，黑色箭头表示不同检测浓度的扫描图 像，而极限浓度值说明上转换荧光颗粒的灵敏度是c y 5 的灵敏度的4 倍，如图 1 8 。这个结果主要是利用上转换荧光颗粒具有高信噪比提高了其生物标记的灵 敏度，也进一步说明上转换荧光颗粒的生物标记灵敏度高的特点。 川i p2 ： i m l “m “ 一 i 廿 件，n q r “z ，r ； 一l - 嗤l 叠c 、c 枷 1 w h “_ l _