（动物学专业论文）强啡肽对扁玉螺的免疫调节作用.pdf

中文摘要 贝类体内的神经肽和细胞因子等对其免疫防御起着重要的调节作用。强啡肽 ( d y n o r p h i nd y n ) 是一种阿片神经肽。随着阿片肽及其受体功能的研究，人们发现阿 片肽对心血管系统、消化系统、呼吸系统等都有重要的调节作用。而有关d y n 对扁玉 螺( n e v e r i t ad i d y m a ) 的免疫调节作用的研究还未见报道。本文采用免疫组化方法对 d y n 、1 ( 、6 和p 受体在扁玉螺各器官组织中的分布进行了研究，采用生化方法研究了 d y n 对血淋巴中部分免疫因子的影响，为贝类免疫学研究积累资料。 免疫组化定位结果表明，在扁玉螺的侧足神经节、脏神经节、口球上皮组织、触角 突起、外套膜外上皮及结缔组织、足的上皮组织、食道腺实质细胞、胃及直肠内褶皱处 的粘液细胞、肝脏实质细胞、肾实质细胞、心脏内心肌细胞和鳃的支持细胞中检测到大 量的d y n 。在扁玉螺的侧足神经节、脏神经节、口球上皮组织、触角突起、外套膜外 上皮及结缔组织、足的上皮组织、食道腺实质细胞、直肠内的粘液细胞、肝脏实质细胞、 肾实质细胞、心脏内心肌细胞、鳃的支持细胞呼吸上皮区检测到了呈不同阳性反应的1 c 受体。在扁玉螺的口球、触角、外套膜和足、消化道与消化腺、肾、心脏及鳃中发现的 呈d y n 及k 受体不同阳性反应的颗粒、细胞或纤维，表明d y n 分子有可能通过与分 布于这些组织中的1 c 受体相结合，参与了对扁玉螺的摄食过程、感觉功能、免疫防御、 运动功能以及消化、排泄、循环和呼吸等功能的调节。此外，在扁玉螺的侧足神经节、 脏神经节、口球和触角中均有呈不同阳性反应的“受体和6 受体的神经纤维和神经细胞 的存在，在扁玉螺的消化道与消化腺、心脏、肾脏和外套膜中检测到了“受体和6 受体 的存在，在扁玉螺的足和鳃中检测到了6 受体的存在，在扁玉螺的胃中检测到了“受体 的存在。“、6 受体在神经组织的分布，有可能表明除d y n 之外，内啡肽( e n d o r p h i ne n d ) 与脑啡肽( e n k e p h a l i ne n k ) 等阿片神经肽也参与了扁玉螺的神经调节。而“、6 受体在扁 玉螺的消化系统、呼吸系统、循环系统和排泄系统的分布，可能表明除d y n 之外的e n d 与e n k 等阿片神经肽也参与了对扁玉螺的消化、呼吸、循环及排泄功能的调节。 生化测定结果表明，( 1 ) 在d y n 浓度为1 0 0 p g m l 和1 0 0 0 l a g m l 的范围内。扁玉 螺血淋巴中酸性磷酸酶( a c p ) 的活力随d y n 浓度的升高而增大。( 2 ) 在d y n 浓度为 1 0 0 i _ t g m l 和1 0 0 0 9 9 m l 的范围内，扁玉螺血淋巴中碱性磷酸酶( a k p ) 的活力随d y n 浓度的升高而增大。( 3 ) 当d y n 浓度为1 0 0p g m l 时，能提高扁玉螺血淋巴中非特异 性酯酶( n s e ) 的活力；而当d y n 浓度为5 0 0p g m l 和1 0 0 0g g m l 时，均降低了扁玉 螺血淋巴中n s e 的活力，且在d y n 浓度为5 0 0p g m l 和l o 0 0p g m l 范围内，扁玉螺 血淋巴中n s e 的活力随d y n 浓度的升高而降低。( 4 ) 当d y n 浓度为l0 0p g m l 和5 0 0 p g m l 时，均能提高扁玉螺血淋巴中髓过氧化物酶( m p o ) 的活力，且在d y n 浓度为 1 0 0p g m l 和5 0 0 9 9 m l 范围内，扁玉螺血淋巴中m p o 的活力随d y n 浓度的升高而增 大；而当d y n 浓度为l o0 0p g m l 时，则降低了扁玉螺血淋巴中m p o 的活力。( 5 ) 当 d y n 浓度为1 0 0g g m l 和5 0 0 咖i 时，均能提高扁玉螺血淋巴中一氧化氮( n o ) 的 含量，且在d y n 浓度为1 0 0g g m l 和5 0 0 “g m i 范围内，扁玉螺血淋巴中n o 的含量 随d y n 浓度的升高而增大；而当d y n 浓度为l o 0 0 “g w a 时，则降低了扁玉螺血淋巴 中n o 的含量。( 6 ) 当d y n 浓度为1 0 0p g m l 和5 0 0p g m l 时，均能提高扁玉螺血淋 巴中过氧化氢( h 2 0 2 ) 的含量，且在d y n 浓度为1 0 0v e m l 和5 0 0p g m l 范围内，扁 玉螺血淋巴中h 2 0 2 的含量随d y n 浓度的升高而增大；而当d y n 浓度为l o 0 0v g r m 时，则降低了扁玉螺血淋巴中h 2 0 2 的含量。由生化结果可知，低浓度的d y n 能通过增 强扁玉螺血淋巴中a c p 、a k p 、n s e 以及m p o 的活力，提高扁玉螺血淋巴中n o 和 h 2 0 2 的含量对扁玉螺的免疫反应起到了正向调节作用，较高浓度的d y n 则通过增强扁 玉螺血淋巴中a c p 和a k p 活力，降低n s e 和m p o 的活力以及n o 和h 2 0 2 的含量对 扁玉螺的免疫反应进行调节。 总之，d y n 对扁玉螺的免疫反应起到了十分重要的调节作用，其作用机制可能是 通过与血细胞表面的受体结合而起作用的。 关键词：强啡肽扁玉螺免疫调节 a b s t r a c t n e u r o p e p t i d ea n dc e l lc ”o “n 部p l a ya nv e r yi m p o r t a n tr o l ei ni m n q u n ed e f e n s eo f s e a s h e l l s d y n o r p h i n ( d y n ) i so n eo ft h eo p i o i dn e u r o p e p t i d e b ys t u d y i n gt h ef u n c t i o n so f o p i o i dp e p t i d ea n dt h e i rr e c e p t o r s ，i tw a sf o u n dt h a to p i o i dp e p t i d ec o u l dr e g u l a t e c a r d i o v a s c u l a rs y s t e m 、d i g e s t i v es y s t e m 、r e s p i r a t o r yt os o m ee x t e n t t h er e s e a r c ho ni m m u n e r e g u l a t i o no fd y n t on e v e r i t a 也d y r n aw a s n tr e p o r t e db e f o r e w es t u d i e dt h ed i s t r i b u t i o no f d y n 、5 、pa n dl cr e c e p t o r si nt h eo r g a n so fn e v e r i t at 矗d y m aw i t hi m m u n o h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e ，a n ds t u d i e dt h ei m p a c to f d y n t os o m eo f t h ei m m u n ef a v o r si nt h eh e m o l y m p h w i t hb i o c h e m i c a lm e t h o d s ，g i v eh e l pw i t hs h e l l f i s hi m m u n o l o g y u s i n gt h ei m m u n o h i s t o c h e m i c a lt e c h n i q u e , w ef o u n dt h a tt h e r ea r ep l e n t yo fd y n i nt h e f o o tg a n g l i o n ，v i s c e r a lg a n g l i o n ，m o u t h ，a n t e n n a e ，m a n t l e ，f o o t ，e s o p h a g e a lg l a n d ，s t o m a c h ， r e c t a l ，l i v e r ，k i d n e y ，h e a r ta n dg i l l a l s o ，w ef o u n dt h a tt h e r ea r ep l e n t yo fkr e c e p t o r si nt h e f o o tg a n g l i o n , v i s c e r a lg a n g l i o n ，m o u t h ，a n t e n n a e ，m a n t l e ，f o o t ，e s o p h a g e a lg l a n d ，r e c t a l ，l i v e r ， k i d n e y ，h e a r ta n dg i l l t h ep l e n t yo fd y na n dkr e c e p t o r si nt h em o u t hs h o w e dt h a td y n m a yp a r t i c i p a t et h er e g u l a t i o no fn e v e r i t ad i d y m a0f e e d i n gp r o c e s st h r o u g hc o m b i n a t i o n w i t hk r e c e p t o r s ；t h ep l e n t yo fd y na n d1 cr e c e p t o r si nt h ea n t e n n a es h o w e dt h a td y nm a y p a r t i c i p a t et h er e g u l a t i o no fn e v e r i t ad i d y m a ss e n s o r yf u n c t i o nt h r o u g hc o m b i n a t i o nw i t l l1 c r e c e p t o r ；t h ep l e n t yo fd y n a n dkr e c e p t o r si nt h ea d e q u a t ea n dm a n t l es h o w e dt h a td y n m a yp a r t i c i p a t et h er e g u l a t i o no fn e v e h t ad i d y m a 台i m m u n ed e f e n s ea n dm o t o rf u n c t i o n t h r o u g hc o m b i n a t i o nw i t h1 cr e c e p t o r s ；a n dt h ee l e m e n t so fd y na n d1 cr e c e p t o r si nt h e d i g e s t i v et r a c t ，d i g e s t i v eg l a n d ，k i d n e y ，h e a r ta n dg i l l ss h o w e dt h a td y nm a yp a r t i c i p a t et h e r e g u l a t i o no fn e v e r i t ad i d y m a0d i g e s t i o n ，e x c r e t i o n ，c i r c u l a t o r ya n dr e s p i r a t o r yf u n e t i o n t h r o u g hc o m b i n a t i o nw i t hkr e c e p t o r s a l s o ，w ef o u n d6r e c e p t o r si nt h ef o o tg a n g l i o n ， v i s c e r a lg a n g l i o n ，m o u t h ，a n t e n n a e ，d i g e s t i v et r a c t ，d i g e s t i v eg l a n d ，h e a r t ，k i d n e y ，m a n t l e ，f o o t a n dg i l l ，w ef o u n di xr e c e p t o r si nt h ef o o tg a n g l i o n ，v i s c e r a l g a n g l i o n ，m o u t h ，a n t e n n a e ， d i g e s t i v et r a c t ，d i g e s t i v eg l a n d ，h e a r t ，k i d n e y ，m a n t l ea n d s t o m a c h t h ed i s t r i b u t i o no f6 r e c e p t o r sa n d “r e c e p t o r si nt h en e r v et i s s u es h o w e dt h a te x c e p td y n ，o p i o i dp e p t i d e sm a y p a r t i c i p a t et h er e g u l a t i o no fn e v e r i t ad i d y m a0n e r v ef u n c t i o n a n dt h ed i s t r i b u t i o no f6 r e c e p t o r sa n d “r e c e p t o r si nt h ed i g e s t i o ns y s t e m ，r e s p i r a t i o ns y s t e m ，c i r c u l a t i o ns y s t e ma n d t h ee x c r e t i o ns y s t e ms h o w e dt h a te x c e p td y n ，o p i o i dp e p t i d e sm a y p a r t i c i p a t et h er e g u l a t i o n o f n e v e r i t a 讲d y m a0d i g e s t i o n ，r e s p i r a t i o n ，c i r c u l a t i o na n dt h ee x c r e t i o nf u n c t i o n t h er e s u l to ft h eb i o c h e m i c a ld e t e r m i n a t i o ns h o w ：( 1 ) w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd y n b e t w e e n1 0 0 i t g m la n d1 0 0 0 肛g m l ，t h ea c t i v i t yo fa c pi nt h en e v e r i t a 班d y m a s h e m o l y m p he n h a n c e dw i t h t h e i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o no ft h ed y n ( 2 ) w h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fd y nb e t w e e n1 0 0i _ t g m aa n d1 0 0 0i _ t g m l ，t h ea c t i v i t yo fa k pi nt h e n e v e r i t ad i d y m a sh e m o l y m p he n h a n c e dw i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no f t h ed y n ( 3 ) i t c a l le n h a n c e dt h ea c t i v i t yo fn s ew h i c hi nt h en e v e r i t ad i d y m a 台h e m o l y m p hw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no f d y ni s1 0 0i t g m 1 a n dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd y n b e t w e e n5 0 0i t g m l a n d1 0 0 0l a g m l ，t h ea c t i v i t yo fn s e i nt h en e v e r i t ac 矗d y m a0h e m o l y m p hl o w e r e dw i t ht h e i n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no ft h ed y n ( 4 ) w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd y nb e t w e e n1 0 0 p g n f la n d5 0 0g g m 1 t h ea c t i v i t yo fm p oi nt h en e v e r i t a 破d y m a 台h e m o l y m p he n h a n c e d w i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no ft h ed y n ，b u tw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd y ni s1 0 0 0 i x g m l ，i tl o w e r e dt h e t h ea c t i v i t yo f m p oi nt h en e v e r i t a 击d y m a0h e m o l y m p h ( 5 ) w h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fd y nb e t w e e n1 0 0p g m la n d5 0 0 u g m l ，t h ec o n t e n to fn oi nt h en e v e r i t a 西d y m ajh e m o l y m p hi n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no ft h ed y n ，b u tw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fd y ni s10 0 0i _ t g m l ，i tr e d u c e dt h et h ec o n t e n to fn oi nt h en e v e r i t a d i d y m a0h e m o l y m p h ( 6 ) w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd y nb e t w e e n1 0 0p g m la n d5 0 0 “g n l l l ，t h ec o n t e n to f h 2 0 2i nt h en e v e r i t ad i d y m a0h e m o l y m p hi n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o no ft h ed y n ，b u tw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd y ni s10 0 0 a g m l ，i tr e d u c e dt h e t h ec o n t e n to fh 2 0 2i nt h en e v e r i t a 疥d y m a0h e m o l y m p h b yt h er e s u l to fb i o c h e m i c a l d e t e r m i n a t i o n ，w ek n o wt h a tl o wc o n c e n t r a t i o no ft h ed y nc a r lm a k eap o s i t i v er e g u l a t i o no f i m m u n er e g u l a t i o nb ye n h a n c e dt h ea c t i v i t yo fa c p ，a k p ，n s ea n dm p o ，i n c r e a s e dt h e c o n t e n to f n oa n dh 2 0 2 ，w h i c hi nt h en e v e r i t ad i d y m ajh e m o l y m p h ，h i g h e rc o n c e n t r a t i o no f t h ed y nc a l lr e g u l a t et h ei m m u n er e g u l a t i o nb ye n h a n c e dt h ea c t i v i t yo fa c pa n da k p ， l o w e r e dt h ea c t i v i t yo f n s ea n dm p o ，i n c r e a s e dt h ec o n t e n to f n oa n dh 2 0 2 i naw o r d ，d y nm a d eav e r yi m p o r t a n tr e g u l a t i o nf o rt h ei m m u n er e s p o n s eo fn e v e r i t a 讲d y m a ，a n di tm a y a c tb yc o m b i n a t i o nw i t ht h er e c e p t o r sw h i c hi nt h es u r f a c eo f h e m o l y m p h k e yw o r d s ：d y n o r p h i n n e v e r i t ac 疗d y m ai m m u n e r e g u l a t i o n 英文缩写 d y n e n k d e n d o f q e m a c p a k p n s e n o n o h 2 0 2 c a m p i l t n f 口 i j s c g 口 i n f p b s c a t d e a d a b e g 匝 符号说明 英文全称 d y n o r p h i n e n k e p h a l i n 肛e n d o r p h i n o r p h a n i n f q e n d o m o r p h m a c i dp h o s p h a t a s c a l k a l i n ep h o s p h a t a s e n o n - s p e c i f i ce s t e r 鲴e m y e l o p e r o x i d a s e m t r i co x i d e b y d r o g e np e r o x i d e a d e n o s i n ec y c l i cp h o s p h a t e i n t e r l e u k i n 1 1 m o rn e c r o s i sf a c t o r - a l i p o p o l y s a c c h a r i d e g u a n o s m e3 ，5 二_ c y c l i cm o n o p h o s p h a t ec g m p i n t e r f e r o n p h o s p h a t eb u f f e r r i ss o l u t i o n c a t a l a s e d i e t h a n o l a m i n e 3 ，3 d i a m o n o b e n z i d i n e e t h y l e n eg l y c o lm o n o m e t h y le t h e r 中文名称 强啡肽 脑啡肽 b _ 内啡肽 孤啡肽 内吗啡肽 酸性磷酸酶 碱性磷酸酶 非特异性酯酶 髓过氧化物酶 一氧化氮 过氧化氢 环一磷酸腺营 白细胞介素 肿瘤坏死因子a 脂多糖 环一磷酸鸟苷 干扰素 磷酸盐缓冲液 过氧化氢酶 二乙醇胺 3 ，3 一二氨基联苯胺 乙二醇单甲醚 鲁东大学学位论文原创性声明和使用授权说明 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：冉日期：w 7 年6 月p b 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权鲁 东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名： 导师签名： 年解密后适用本授权书。 日期：广萍# 月f 9 日 日期：一年占月伊日 镇 冉拍 鲁东大学硕士学位论文 综述d y n 研究的回顾与展望 d y n 是一种阿片神经肽，最早于2 0 世纪7 0 年代末从猪的垂体中发现并提取出来 的【l j 。d y n 为内源性阿片k 受体激动剂，它们主要存在于高等动物下丘脑和垂体中，是 一种与应激有关的内源性阿片肽。d y n 在许多应激条件下调节着损伤感觉，中心体温， 饮食及垂体分泌等生命现象【2 1 。关于d y n 的研究大多数是针对于高等动物神经系统方 面的，许多研究表明它参加了脊髓继发性损伤病理过程，参与了痛觉的调制，是一种不 易成瘾、不影响呼吸并能抑制吗啡戒断症状的新型镇痛引 。低等动物体内的d y n 的 研究比较少，目前发现低等动物( 如贝类等) 和高等动物一样有阿片肽及3 种阿片肽受 体类型，即“、6 和1 c 受体，这3 种受体广泛分布于贝类各种组织中，并且参与了对感 觉、运动、消化和免疫等功能的调节4 1 。 1d y n 的分子组成 d y n 系统具有d y n a ( 1 1 7 肽) 、d y n a ( 1 8 肽) 和d y n 一1 3 ( 1 2 9 肽) 以及 a 一新内啡肽等成员，它们是由新内啡肽一强啡肽原这一前体大分子经酶切等加工后产生 的。d y n 系统中的成员具有一个共同结构，即n 端的氨基酸残基均为 t y r - g l y - g l y - p h e - l e u ，其中第一位t y r 十分重要，更换后将丧失与阿片受体的结合能力。 在新内啡肽一强啡肽原中，d y n b 的n 端经一对碱性氨基酸与d y n a 的c 末端相连接 2 1 。在低等动物( 如水蛭和紫贻贝) 中，由强啡肽原水解得到的几种强啡肽同高等动物 中的内源性的d y n 除n 端4 个氨基酸残基相同外，在结构上也有很大程度的序列相似 性睁1 5 】，这说明，d y n 在进化上是十分保守的，在高等动物中进行的d y n 实验可以拿 来作为参照在低等动物中进行研究。 2d y n 的产生 人们采用分子生物学技术寻找各类阿片肽的前体结构及其基因克隆。对高等动物的 研究结果表明e n k 、d y n 和b - e n d 均有各自的前体，按照阿片神经肽生成加工的一般 规律，先在神经元胞体的核糖体上合成一个无活性的前体大分子，再经过转运过程中的 酶切、转化等翻译后加工，才产生有活性的神经肽。高等动物( 如小鼠等) 的前强啡肽 原含2 5 6 个氨基酸残基，可酶切加工出d y n 、d y n b 等。 1 9 9 7 年，s a l z e t 等用凝胶渗透层析法在颚蛭科的水蛭中提取出一种由1 1 9 个氨基酸 组成的蛋白，经鉴定，这种蛋白为一强啡肽原，它同小鼠强啡肽原、人强啡肽原、猪强 啡肽原的序列相似性分别为2 8 8 、2 2 9 、2 1 8 。这种强啡肽原水解后产生的a n e o 内啡肽、d y n - a 和d y n b 同高等动物的相应肽的序列相似性分别为1 0 0 、5 0 和7 6 6 鲁东大学硕士学位论文 【”】。1 9 9 8 年s t e f a n o 等发现在软体动物紫贻贝的血淋巴中存在强啡肽原，这种强啡肽原 分子量为1 6k d a ，将其经降解、蛋白质内切酶消化、处理后，得到a n e o 一内啡肽、d y n a 和d y n b 三种阿片肽，这三种阿片肽与豚鼠阿片肽相应分子对比氨基酸序列分别有 1 0 0 、7 0 5 和8 5 的序列一致性9 1 等等。这些研究表明，无脊椎动物中，主要存在阿 片肽的前体物质，这些前体物质经水解后分别产生强啡肽等阿片肽。 3d y n 的分布 在无脊椎动物中，d y n 等阿片肽及其受体定位的研究开展的比较早。早在1 9 8 1 年， l e r o i t h 等就在原生动物中发现了d y n 、b e n d 等阿片肽【1 6 】。1 9 8 5 年，j o s e f s s o n 等通过 实验发现低浓度的胰岛素、活性肽、d y n 等阿片肽可以使大变形虫的胞饮作用增强， 这说明大变形虫中可能有胰岛素受体、阿片肽受体及其它一些肽激素受体【”】。1 9 8 6 年， p a l m i s a n o 等从虾蛄食管下神经节中提取了一种蛋白，这种蛋白质中含有内源性类阿片 肽，经羧肽酶水解后得到了d y n a l 1 3 t 馆】。同年，f o r d 等通过实验发现在马德拉蜚蠊的 脑神经节中存在着1 ( 阿片受体，而k 受体的配体( 即强啡肽等阿片肽) 能增强其自发活 动的能力。这种增强作用受盐酸纳洛酮的抑制【l9 1 。在果蝇的神经组织中也发现了阿片受 体 2 0 1 。1 9 9 3 年，c h i e s a 等通过药理学鉴定，发现在原生动物中的四膜虫属中存在着阿 片受体，并且发现，阿片受体参与调节四膜虫的吞噬作用 2 ”。1 9 9 6 年，k a v a l i e r s 等发 现，在蜗牛中存在痛敏肽、d y n 等内源性阿片肽，并且这些肽参与了蜗牛的痛觉反应 等，d y n 的作用受k 受体拮抗剂的阻遏【】”。 所以说，d y n 及阿片受体在无脊椎动物中分布比较广，广泛存在于各种组织中， 尤其以神经系统中的分布比较集中。而关于d y n 的定位，研究最多、最成熟的是哺乳 动物中的老鼠。最新的研究结果显示，在老鼠的神经、内分泌和免疫三大类系统中都有 内源性阿片受体及d y n 等阿片肽，并且其在大脑和外周神经元中的分布为最岁“j ，在 消化系统、呼吸系统中也都有阿片受体及d y n 等阿片肽的存在【z j 。 4d y n 的受体 1 9 9 0 年，m a r t i n 等通过系统的研究，确定了三种阿片类药物综合征【2 3 】，由此使得 阿片类受体开始被人类所发现，直到1 9 9 5 1 2 4 年，三种阿片受体才被确定下来，即p 、1 c 、 6 受体。3 种阿片受体皆可偶联腺苷酸环化酶并抑制c 朋旧的形成，该抑制效应通过百 日咳毒素敏感g t p 结合蛋白即g 蛋白的介导，这些阿片受体也可介导钙离子和钾离子 通道活性。此外，1 9 9 2 1 9 9 3 年，科学家又发现了一种全新的阿片受体，这种受体与已 知的三种阿片受体具有较高的同源性，但它与已知阿片受体特异性配体的亲和力却很 低，故称之为阿片受体样受体，又称为孤儿受体h 。 2 鲁东大学硕士学位论文 二十世纪七十年代，随着确定吗啡作用机制的研究，人们先后发现了内源性阿片肽， 即e n k ( 5 肽) 、e n d ( 3 1 肽) 和d y n ( 1 7 肽) 。二十世纪末，m e u n i e r 与z a d i n a 又先 后发现了孤啡肽( o r p h a n i n fq ，o f q ) 和内吗啡肽( e n d o m o r p h m ，e m ) 等内源性阿片肽【2 】。 目前研究最多的内源性阿片肽是e n k 、e n d 和d y n 这三大类，这三类阿片样肽有一共 同结构，即n 端4 个氨基酸残基均为t y r - g i y g i y p h e ，其中第一位t y r 十分重要，更 换后将丧失与阿片受体的结合能力。内源性阿片肽对不同阿片配基的结合能力存在差 异，e n k 对6 型受体有较强的选择性，被认为是6 型受体的内源性配体；e m 对“型受 体亲和力和选择性晟高，是型受体性配体；o r q 是孤儿受体的受体性配体；而d y n 对k 型受体选择性较强，被认为是k 型受体性配体，另有证据显示：d y n 还与其它非 靶受体，如：兴奋性氨基酸的n m d a 受体【2 52 6 】和多巴胺受体【2 刀等之间存在复杂的相互 关系，可能是d y n 介导药物暴露相关的可塑性改变的重要神经生化机制2 8 1 。 5d y n 基因的研究 d y n 、e n k 和e n d 在动物体内主要以无活性的前体大分子形式存在，这些前体 大分子要经过转运过程中的酶切、转化等翻译后加工，才产生有活性的神经肽。有关 d y n 基因的研究已经开展，目前所知，人的前强啡肽基因位于第2 0 号染色体，长约 1 65 k b ，由4 个外显子和3 个内含子组成。外显子1 、2 连同外显子3 的起使1 7 个碱基 编码5 端非翻译区；外显子3 主要编码前强啡肽的信号肽及其n 端至l e u 4 3 ；外显子4 编码其余部分i l e 4 4 a l a 2 5 4 和3 端非翻译区，目前尚未确定，前强啡肽基因的外显子 l 序列中是否有一段内含子存在。猪的前强啡肽基因中没有上述的外显子2 。除人的前 强啡肽基因结构的研究外，其它阿片肽基因结构及其表达调控工作也在逐步进行。伴随 着分子生物学技术的进步，d y n 等阿片肽基因的结构及这些基因的表达调控将成为目 前和将来一段时间内科学家研究的熟点。 6d y n 的功能 d y n 等内源性阿片肽是一种重要的活性物质，在体内起着神经递质和激素的功能。 大量研究表明，它对机体的神经系统( 如镇痛) 、内分泌免疫网络调节及消化系统、呼 吸系统、心血管功能等都有重要的调节作用。 6 1d y n 对神经系统的作用 在正常机体内，阿片受体及d y n 等阿片肽系统通过各种复杂的神经网络调节着体 内众多的神经递质调节及激素的作用，保持体内各系统之间的功能平衡。 关于d y n 在神经系统中的作用，在无脊椎动物中的研究比较少，最早是p a l m i s a n o 等于1 9 8 6 年从虾蛄食管下神经节中提取了一种蛋白，这种蛋白质经羧肽酶水解后得到 3 鲁东大学硕士学位论文 了d y n a l 1 3 1 引。在果蝇的神经组织中也发现了阿片受体【2 0 】。1 9 9 6 年，k a v a l i e r s 等发 现，在蜗牛中存在d y n 等内源性阿片肽，这些肽参与了蜗牛的痛觉反应等。 d y n 对脊椎动物神经系统中的研究比较广泛，目前的研究主要集中在其对痛觉的 调制方面【2 ”3 1 。d y n 属于阿片肽，阿片肽作为内源性阿片样肽的简称，顾名思义，其 功能与阿片的药理功能相似，首先表现为强有力的镇痛功能。从阿片肽的分类来看， d y n 、e n k 和p d d 、以及e m 均有明显的镇痛功能；从阿片受体的分类来看，“受 体、6 受体和k 受体都参与痛觉调制。实验证明，无论是吗啡镇痛、脑刺激镇痛或针刺 镇痛都激活了以阿片肽系统为主要中介的内源性痛觉调制系统。但是从近年来发现的 o f q 系统来看，d y n 等阿片肽在痛觉调制中也存在着双重的作用。此外，d y n 可以 通过对1 c 受体的激活，抑制中脑边缘系统、黑质、纹状体等结构内的多巴胺的释放【3 5 朔、 降低精神活性物质的犒赏作用产生厌恶情绪【3 5 j 8 4 ”、使活动减少以及阻滞精神活性物 质的致敏作用，使受试动物产生类抑郁的表现【“4 5 1 。 近年来的研究还发现，d y n 等阿片肽除了中枢镇痛机制外，在外周的传入神经末 梢也存在着疼痛调节作用【”。另外，在高等动物及人类机体中，神经系统、内分泌系统 及免疫系统是控制机体生理功能的三大调节系统，而d y n 等阿片肽则是全面参与这三 大系统调节功能的重要因素。d y n 等阿片肽除能作为神经递质或调质参与中枢神经功 能的调节之外，还对下丘脑一垂体一内分泌腺体的多条途径具有一定的影响。此外已经在 外周免疫细胞上发现有阿片受体及阿片肽，这就为阿片肽参与神经免疫网络调节提供了 物质基础。阿片肽作为神经系统与免疫系统相联系的一种中介物质，这方面的研究已经 开始引人注目l 州。而在无脊椎动物中，d y n 对神经一内分泌一免疫网络的调节还未见 有报导。 阿片类物质还具有呼吸抑制、便秘和嗜睡等副作用。机体的内源性阿片肽参与机体 的一系列植物性神经功能的调节，包括心血管活动、消化活动和体温调节等。而许多经 典递质( 包括交感神经及副交感神经的主要递质去甲肾上腺素、乙酰胆碱等) 都是调节植 物性神经功能的主要活性物质。但是阿片系统也是参与调节的一种因素。这种调节功能 在正常生理状态时，作用一般不很明显，但在异常状态下( 如因创伤、缺氧和疼痛引起 应激时) 可能具有重要的病理生理意义【2 j o 6 2d y n 对免疫功能的影响 免疫系统是阿片肽的来源之一，目前已证实，免疫细胞表面具有神经递质和内分泌 激素的受体，而神经细胞表面也具有细胞因子( 如白细胞介素( i n t e r l e u k i ni l ) 、干扰素 ( i n t e r f e r o ni n f ) 等) 的受体。免疫系统可以合成释放内分泌激素和神经递质( 如e n k 4 鲁东大学硕士学位论文 等) ，这样，免疫系统和神经、内分泌系统就可以通过各自表面受体以及释放的介质， 进行信息交流及功能调节，以共同维持机体内环境的稳定。近年来的研究发现，几乎所 有的免疫活性细胞表面均存在阿片受体，而且活化的免疫细胞也可合成并释放阿片肽， 可能主要以自分泌和旁分泌方式参与免疫调节作用，内源性阿片肽不仅可以调节t 细 胞、b 细胞、自然杀伤细胞( n k 细胞) 和巨噬细胞等多种免疫细胞功能，而且可以参与 免疫应答的全部环节。 1 9 9 5 年，r e n z e u i c a i n 等通过实验发现d y n 等阿片肽及其类似物能增强蚯蚓属的 变形细胞的吞噬，聚集，成颗粒等活性，这一反应具有浓度依赖性，而盐酸纳洛酮能抑 制这一反应m 】。s t e f a n o 等对贻贝进行紧张刺激时，发现d y n 等内源性阿片肽参与了免 疫防御反应 4 7 1 。h u g h e s 等向贻贝血淋巴中加入阿片肽或免疫刺激剂脂多糖( l p s ) ，发 现二者都可使贻贝免疫细胞变扁、产生趋化活性，但它们分别激活免疫细胞的不同类群 4 8 1 ，将阿片肽和l p s 同时加入贻贝血淋巴时，阿片肽类物质可以增强l p s 对免疫细胞 的活化【4 9 】。 7d y n 的作用机制 7 1d y n 作用的分子机理 阿片肽类物质与阿片受体结合后可激活细胞膜上g t p 结合蛋白，使细胞内c a m p 水平下降( 5 0 1 。c a m p 可诱发胞浆内c e + 浓度的改变，即c a 2 + 由膜外进入或由细胞内储存 库释放，使一些依赖c a 2 + 的蛋白酶激活，促进磷酸化反应，激活一系列信号通路【5 ”。强 啡肽等阿片肽是调节痛觉传入活动的神经递质。它们的镇痛作用可能是通过激活位于感 觉神经外周端末梢上的阿片受体，抑制腺苷酸环化酶，降低细胞内c a m p 水平，从而使 由于炎症性介质的影响而敏感的传入细纤维的兴奋性恢复到正常水平，以达到镇痛效 果。 在免疫方面，许多免疫增强剂和抑制剂也是通过细胞内c a m p 和c g m p 的变化而影 响免疫反应的。有资料显示，在淋巴细胞的激活转化过程中，c a m p 的降低和c g m p 的 升高都有利于d n a 、r n a 及蛋白质的合成，并为细胞的分裂与增殖创造了有利条件。 d y n 等阿片类物质有可能通过调节c a m p 水平对低等动物( 如贝类) 进行免疫调节【5 2 1 。 7 2 对细胞因子的调节 细胞因子作为一种细胞间信息传递因子，其功能遍及神经、内分泌、免疫等各系统。 细胞因子是免疫系统的重要组成部分，具有广泛的生物学活性，如促进免疫细胞增殖和 分化、增强抗感染能力和细胞杀伤效应、调节其他免疫分子的表达、促进炎症过程等， 在非特异性免疫和特异性免疫的免疫应答、免疫效应和免疫调节中均发挥重要作用。白 5 鲁东大学硕士学位论文