（动物学专业论文）卫河水对蛙类胚胎发育和红细胞毒性的研究.pdf

摘要 用于污染水体的生物监测己引起越来越多的关注。卫河是海河流域的一条重要骨干河 流，近年来，其水质有所恶化，但对两栖动物和人类潜在的危害不详。本文采用两柄动物 的胚胎和蝌蚪为材料，运用胚胎毒理学和遗传毒理学的方法，研究卫河水对中国林蛙( r a n n 砌g s m e n j 担) 和黑斑侧褶蛙( p p 印砂z 甜n f g r d m 日c “缸缸) 胚胎的发育毒性以及环磷酰胺和 卫河水对隆肛蛙( p 缸n 口“a d m n d ) 蝌蚪红细胞的影响。 结果表明：经卫河水原水处理，从卵裂期开始处理的中国林蛙胚胎只能发育3 2 8 5 小 时，从脱膜后开始处理的中国林蛙胚胎只能发育2 4 0 ，o 小时，从卵裂期开始处理的黑斑侧 褶蛙胚胎只能发育1 6 3 8 小时。中国林蛙和黑斑侧褶蛙的胚胎、中国林蛙和隆肛蛙的蝌蚪 在卫河水原水中不能发育存活。 经中浓度( 5 6 ) 的卫河水处理后，中国林蛙胚胎畸形率高达7 8 9 ，黑斑侧褶蛙胚 胎畸形率为3 2 o 。低浓度( 1 0 、1 8 、3 2 ) 的卫河水能明显抑制中国林蛙、黑斑侧褶 蛙胚胎的全长和中国林蛙胚胎的体重，使中国林蛙和黑斑侧褶蛙早期胚胎脱膜时间、早期 胚胎发育时间延长，并使中国林蛙早期胚胎发育分期明显滞后；对胚胎发育过程中畸形率 和死亡率影响不大。因此，中国林蛙和黑斑侧褶蛙的胚胎毒理学实验在监测环境有害物质 的生物影响时敏感可靠。在研究污染物尤其是低浓度的污染物对中国林蛙和黑斑侧褶蛙胚 胎发育毒性影响时，生长抑制参数：全长和体重，是比致死率和畸形率更为敏感的终点参 数。 5 0 浓度的卫河水能使中国林蛙蝌蚪的全长明显变短、体重明显减轻，发育分期显著 滞后。低浓度的卫河水( 1 0 、3 0 ) 对中国林蛙蝌蚪的全长、体重和发育分期的影响不 大，低浓度的卫河水对中国林蛙蝌蚪全长的影响主要是在处理的前期( 1 2 天以前) ，到处 理后期( 1 4 、1 6 天) 时，对其全长的影响已不明显。 用l o m l 、2 0 m 1 、4 0 m l 环磷酰胺溶液对隆肛蛙蝌蚪处理后，可使隆肛蛙蝌蚪红细 胞的微核率和总核异常率明显升高，尤其是在第1 2 天时，微核率和总核异常率分别高达 41 0 、9 1 9 、9 7 1 和2 2 0 7 、2 3 7 6 、3 2 9 1 。用1 0 、3 0 、5 0 浓度的卫河水 对隆肛蛙蝌蚪处理后，红细胞微核率和总核异常率在第1 2 天时最高，分别达2 6 5 、5 0 1 、6 0 7 和2 1 1 3 、2 5 ，0 7 、3 0 6 3 ，与阴性对照组相比均有显著的增加。 从以上结果中可以看出：卫河水中存在潜在的致畸变物质，含有较强的致突变物质， 对两栖动物和人类的危害巨大，卫河污染已相当严重，应引起有关部门的高度重视。必须 加强对沿途各污水排放大户的监管力度，提高公众的环保意识，减少各种污水的排放量。 同时，必须尽快对卫河水加以治理，以防止对地下水源的污染。 关键词：卫河水；蛙；胚胎毒性；红细胞微核 i a b s t r a c t b i o m o l l i t o r i n gh a sb e e np a i dm o r ea i l dm o r ea t t e m i o ni np o l l u t e dw a t e rm o n i t o r i n gb e c a u s e o fi t s s p e c i a la d v a t a g e s ，t h ew e i h er j v e ri s ab r a n c ho fh a m e 融v e rr e c e m l y ，m ew a t e r q u a i i t yo ft h ew 萌h e 砌v e rh a sb e e nd e t e r i o r a t e d ，b u ti t sh a m lt oa m p h i b i a na i l dh u m a ns 锄 r e m a i n 幽o w ht h ep r e s e n tp a p e r ，吐l ee x p 瓤m e n t a lm a t e r i a l sw e r ea m p h m i a ne m b r y o sa n d t a d p o l e s ，e m b r y o n i ct o x i c i t ya n dg e n e t i ct o x i c i t ye x p 缸m e n t a lm e m o d sw e r eu s e d ，s t u d i e d t h ed e v e l 叩m c n t a lt o x i c i t yo ft h ew e i h e 硒v e rw a t e ro nr 以”幽p 耶跏鲫咖a 1 1 d 尸p f 叩砂肠省 n f 。g 阳，托以c “缸地e n l b r y o s ，i l u c l e u sa i l o m a l i e so fp g 村i 加，z 日t a d p 0 1 e se r y t h r o c ”e sb y c y c l o p h o s p h 锄i d ea n dt l l ew e i h er i v e rw a t e ri n d u c e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t 砌p m b i a ne m b r y o s 僻c 而e 船加删j 括a n d 尸蛐野删d c “肠向) a l l d t a d p o l e s 似c 删j 觑印s 捃a n dpg 甜加以口) c o u l d n ts u i v em t h ew a t c ro f t h ew 。i h e 础v e l t h e e m b r y o 茄cd e v e l o p m e m a l 恤a eo f r c 矗删占讯p 胜由e m b r y o se x p o s e da te g g s c l e a v a g es t a g ew a s 3 2 8 5 3h o u r s ，a t l d 也et i m eo fe m b r y o se x p o s e da th a t c h 访gw a s2 4 0h o u r s p 力趣即肌删z 口m 锄b r y o se x p o s e da te g g s c l e a v a g es t a g ew a s1 6 3 7 8h o l 】r s w h e l lm e 铷b r y o sw e r ee x p o s e dt 05 6 o f m ew e i h e 王己i v e rw a t e r ，也em a l f o n n a t i o nr a t i oo f r 幽酬j 加鲫5 括e m b r ) ，o sw a s7 8 9 3 ，a i l dp 玎辔加川c “肠船e l n b r y o sw 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m i c r o n u c l e u sa i l dn u c l e u sa n o m a l i e s 讪c r e a s e d t o4 1 0 ，9 1 9 ，9 7 1 a n d2 2 0 7 ，2 3 7 6 ，3 2 9 1 ，c o m p a r e dt ot 1 1 ec o n 昀1 伊o u p c o n c e n t r a t i o no f2 0m lc y c i o p h o s p h 锄i d es e e m e dt ob em o r ea p p r o p r i a t e dw h e ni tw a su s e d t ob ep o s i t i v ec o n t r 0 1m a t e r i a l s f r e q u e n c i e so f 武c r o 姗c l e u sa n dn u c l e sa n o m a l i e s 恤p 叮m 口西册口t a d p o l e se r y t l 】r o c y t e s i n c r e a s e do b v i o u s l yc o m p a r e dt om ec o n t r o l 掣o u p sa 髓r1 2d a y se x p o s u r ei n1 0 ，3 0 a 工1 d 5 0 o ft h ew e m em v e rw a t e r 缸q u e n c i e so fm i c r o n u c l e u sa n dn u c l e u sa n o m a l i e si n c r e a s e dt o 2 6 5 ，5 0 1 ，6 0 7 a 1 1 d2 1 1 3 ，2 5 0 7 ，3 0 6 3 t h ew e i h e 融v e rw a sh e a v 主1 yp 0 1 l u t e d ，t h e r ew e r ep o t e n t i a la b e i t a l l tc o m p o n e n t sa n ds t r o n g p o t e n t i a lc a r c i n o g e ni n 也ew d h er i v 盯w a t e r 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l i t o 咖g 或b i o m o i l i t o 血g ) 在不同的文献资料中，定义略有区别。 联合国环境规划署将其定义为：测量活着的生物体对人为压力的灵敏度。美国国家环保局 则定义为：使用活着的生物体来测定环境影响。卢升高等( 2 0 0 4 ) 将其定义为：以生物个 体、种群或群落对环境污染物胁迫的反应为指标，检测环境的污染状况，从生物学的角度 为环境的监测和评价提供依据。传统上，生物监测通过采用测量生物体内蓄积的污染物浓 度的方法，揭示环境污染的程度和状况。近几十年来，生物监测概念的范畴已明显扩大， 包括测量生物体暴露于污染环境中的生理、生态、遗传等参数变化，以获得污染的有关信 息及暴露所造成的影响( 李江平等，2 0 0 1 ) 。 天然水域中存在着大量的水生生物群落，在一定条件下，水生生物群落和水环境之间 互相联系、互相制约，保持着自然的、暂时的相对平衡关系，形成一个非常精巧而又非常 复杂的生态系统( 孙儒泳，2 0 0 1 ) 。当水体受到污染而使水环境条件改变时，必然作用于 生物个体、种群和群落，影响生态系统中固有生物种群的数量，物种组成及其多样性、稳 定性、生产力以及生理状况，影响生态系统的正常循环。由于不同的水生生物对水环境的 l 前言 要求和适应能力各异，会产生不同的反应，这些变化与水环境受污染的种类和程度的变化 相辅相成。人们可以根据这些反应对水体污染程度做出判断，这就是水体污染生物监测的 基础( 张海波，1 9 9 8 ：吴国琳，2 0 0 4 ) 。所以，水体污染的生物监测就是利用水生生物个 体、种群和群落的数量、性质、健康状况、生理特性等的变化来表征水环境质量的变化。 1 2 生物监测的优点 与传统的理化监测方法相比，生物监测的优越性主要表现在( 1 ) 具有综合性：在环境 中，生物接触到的污染物不止一种。而几种污染物混合起来，有可能发生协同作用，使危 害程度加剧，生物监测能较好地反映出环境污染对生物产生的综合效应；( 2 ) 具有时效性： 一些低浓度甚至是痕量的污染物进入环境后，在能直接检测或人类直接感受到以前，生物 即可迅速作出反应，显示出可见症状。因此，可以在早期发现污染，及时预报；( 3 ) 具有 敏感性：对于那些剂量小、长期作用产生的慢性毒性效应，用理化方法很难进行测定，而 生物监测却可以做到；( 4 ) 生物监测方法简便，成本低廉，很少用价格昂贵的仪器，克服 了理化监测的局限性和连续取样的繁琐性，能反映整个时期环境因素改变的情况以及各环 境因素变化的协同和颉颃作用的结果( 张毓琪，1 9 9 3 ；李江平等，2 0 0 l ；盛连喜，2 0 0 2 ； 卢升高等，2 0 0 4 ；段昌群，2 0 0 4 ) 。 1 3 水体污染生物监测的概况 水体生物监测是反映水环境质量状况的标准和依据，而不仅仅是对理化监测的一种 补充和验证。水体生物监测宜接反映了环境质量变化对生物的影响和危害程度，是实现水 环境监测目的的一种最直接而有效的手段。在目前许多污染物的环境标准尚未健全，雨薪 的污染物又不断出现的时期，环境标准的健全势在必行。而水生生物监测是制订环境标 准的基础，只有具备大量水生物监测的基础资料，环境标准的制订才能更具有科学性。因 而永体的生物监测成为国内外水体污染监测中普遍采用的方法，近年来已成为一种测定和 评价水体中污染物毒性的基本方法( 金岚，1 9 9 2 ：张海波，1 9 9 8 ；程英等，2 0 0 1 ) ，由此 出现的水体污染生物监测的类型也很多( 黄先玉和刘沛然，1 9 9 9 ) 。而目前，水体污染生物 监测的研究主要是通过大量的生态毒理学实验来进行，并用这些结果作为评价环境物质的 毒性强度及可能对生态系统造成影响的种参数( 徐厚恩等，1 9 9 l ；张彤，1 9 9 8 ；陈民山， 1 9 9 9 ；朱琳和史淑洁，2 0 0 2 ；李树蕾等，2 0 0 2 ：李效宇等2 0 0 3 ；田云等，2 0 0 4 ) 。现在这 些方法不少已作为常规监测方法，这些手段所得出的结果较好地反映污染物对生态系统整 体水平上的影响，比较接近自然状况。在个体水平或系统水平上的研究对污染物的评价和 筛选起到了重要作用。 2 1 前言 目前，许多研究者主要从生物化学方面探索能反映污染物对生物早期影响的参数。虽 然研究的角度不同，但各研究者的基本观点是致的，即污染物对生态系统或个体酶影昭 无论多复杂、其最终的影响如何严重，最早的作用必然是从细胞内分子水平上作用开始的， 然后逐步在个体、种群、群落、生态系统各个水平上反应出来，这种最早期的作用在保护 种群和生态系统上有很大的预测价值。可见，随着生物技术的发展，分子生态毒理学正在 逐步形成，即采用现代分子生物学方法与技术研究污染物及代谢产物与细胞大分子包括蛋 白、核酸、酶的相互作用，找出作用的靶位或靶分子并揭示其作用机理( 杨明杰，2 0 0 0 ：任 虹等，2 0 0 0 ；赵江沙等，2 0 0 3 ；贾秀英等，z 0 0 4 ，2 0 0 5 ：牛红义等，2 0 0 5 ；安鑫龙等，2 0 0 6 ) 。 监测生物是生物监测的核心，其优劣直接决定生物监测结果的可靠性。检测指标是检 测监测生物对污染胁迫反应的依据，正确选择检测指标是生物监测成败的关键。因而如何 选择监：受! j 生物及指标成为生物监测中至关重要的问题( 卢升高等，2 0 0 4 ) 。水体污染生物 监测受试生物的选择并不是任意的，而是要遵循以下原则：第一，该生物是一种重要的水 生生态群的代表；第二，该生物在重要的食物链中占有一定的地位；第三，该生物分布广 泛、保养容易、遗传稳定；第四，该生物拥有相当丰富的背景资料( 黄先玉和刘沛然，1 9 9 9 ) 。 1 4 两栖动物的特点 两栖动物能在陆地存活，但不能在陆地繁殖，在脊椎动物从水生进化到陆生的过程中， 两栖动物有着“承先启后”的重要作用，是一群过渡类型的动物。它们的卵大而裸露，容 易培养和观察，是教学和科研的良好实验材料，已广泛用于科学研究之中。两栖动物中有 许多具有经济价值的种类，有的可以食用，如大鲵( 4 h 出勘s 妇p 抛h 埘) 和虎纹蛙 ( 爿印幻6 曲口曲淞螂f 胁淞) ，有的可以药用，如中国林蛙汨册dc 册s 研绷豳，雌性输卵管 的干制品“哈士蟆”( 马常夫，1 9 8 5 ) ，以及从两栖类皮肤中提取出的具有抗菌抗肿瘤作 用的抗菌肽等活性物质( 赖仞等，2 0 0 2 ) ；另外，两栖动物大多以农林害虫为食，对维持 农田、湿地和森林等生态系统平衡起重要作用，所以对两栖动物的研究具有重要的理论和 实践意义。 在当前环境污染目益严重的情况下，作为生态系统的重要组成生物，两栖动物也是其 中的受害者之一：一方面由于( 1 ) 气候变迁和u v - b 辐射；( 2 ) 生境破坏和片段化；( 3 ) 外来 物种的入侵；( 4 ) 环境污染导致两栖动物雌性化( 环境激素) ；( 5 ) 感染寄生虫、疾病的传播 以及各种因素间的相互作用等一些以前不为人知的因素，其种群衰退现象明显( a 1 f o t d 尉c h a r d s ，1 9 9 9 ，2 0 0 l ；h o u l a l l a i le ta 1 ，2 0 0 0 ；周洲等，2 0 0 4 ：武正军等，2 0 0 4 ；a 1 1 1 ( 1 e ye ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。另一方面，两栖动物具有其特定的生物学和生态学特征：卵和蝌蚪在水中生活， 3 i 日u 舌 成体在接近水的陆地上生活，所以不仅可以监测水体污染，而且还可以对陆地的污染物进 行监测；两栖动物可以用皮肤呼吸，故皮肤的渗透性很强，对污染物的累积作用很明显， 因此对水厦的反应极为敏感，会园生态环境变化而表现出各种反应，反映出当前生态环境 恶化的各个方面，被作为生态环境监测的重要生物类群( 李鹄鸣等，1 9 9 5 ；l g n a c i oa 1 1 da l i ， 2 0 0 1 ：m 加l u te ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 5 两栖动物作为水体污染监测生物的研究概况 用两栖动物作为环境监测的指示生物，检查水环境污染状况的研究，已引起国内外学 者的普遍重视。吕秀芬等( 1 9 8 9 ) 研究北京通县灌渠污水对中华大蟾蜍和黑斑侧褶蛙胚胎 发育的影响，发现通县灌渠污染严重，致使蛙类在胚胎期就形成畸形，然后全部死亡，蛀 类已不能在这种水域中进行繁殖。潘道一( 1 9 9 0 ) 用2 8 种除草剂对稻田泽蛙蝌蚪进行了急 性毒性测定，发现不同的除草剂对泽蛙蝌蚪的毒性不同，蝌蚪对除草剂反应敏感。h e r k o v i t s e ta 1 ( 2 0 0 0 ) 研究了镍离子一锌离子联合对鼬妇a 一艏r 鲫胚胎的毒性，发现在镍离子浓度为 5 3 5 m 鲋的情况下，低浓度的锌离子( o 5 m 1 ) 对镍的毒性影响不大，较高浓度的锌离子 ( 2 2 0 m 1 ) 可以增强镍的毒性，当锌离子浓度达到3 0 m 鲋时可显著增加镍的毒性。这项 金属离子联合毒性的研究为保护野生动物，以及水质量标准的建立，提供了科学的基础。 卢祥云等( 2 0 0 2 ) 研究了几种常用农药对黑斑侧褶蛙蝌蚪的霉性，结果表明：农药对黑斑 侧褶蛙蝌蚪的毒性大小依次为使它隆 多效唑 多菌灵 异丙隆 甲胺磷。阿根廷的h e r k o v i t s e ta 1 ( 2 0 0 2 ) 用标准的两栖动物胚胎毒性试验( s t a l l d a r d i z e d 卿1 1 i b i a i le m b r y ot o x i c j t yt e s t ， 脚h i t o x ) 对b u e f l o s 灿鹳s 地区3 4 个水样进行了实验，结果表明城市污水的毒性较高，需 要加以治理。龚道新( 2 0 0 3 ) 研究杀菌剂咪鲜安对蟾蜍蝌蚪的毒性表明：眯鲜安对蝌蚪的 9 6 hl c 5 0 为2 8 4t i l g l ，睐鲜安的主要代谢物对蝌蚪也有毒性，所以在评价睬鲜安的生态 环境效应时，不仅应考虑咪鲜安母体的残留与毒性，还应重视咪鲜安主要代谢物的残留与 毒性。m a h m u te t a 】，( 2 0 0 3 ) 研究了c d c l 2 3 h 2 0 对水蛙中黝肋，；讲6 “n 如幼蛙白勺急性毒j 生，得 出c d c l 2 3 h 2 0 对该水蛙幼蛙9 6 h 的l c 5 0 为5 1 2 m g 1 。 在此基础上，美国、法国等国已形成了一套完整的两栖类胚胎毒理学实验方法，概括 起来说就是：以非测爪蟾为实验动物，采用体外授精的方法获得受糖卵，挑选正常发育的 胚胎放入一系列直径6 0 m m 的塑料培养皿中进行染毒。水温控制在2 3 o 5 ，处理液每日 更换，更换处理液时清除死亡的胚胎。处理1 2 0 小时后，统计死亡和畸形情况。比较处理 组和阴性控制组的死亡率和畸形率。且其实验所用的溶液配方也已标准化。此种实验，方 法简单，不需要昂贵的仪器，便于推广应用，各个实验室之问可以进行比较极大的促进 4 1 前言 了两栖动物胚胎在药物筛选和检测环境致畸物质中的应用( b m n e re ta 1 ，1 9 9 8 ；r e i n i e re ta 1 ， 2 0 0 0 ；j o r 叠ee ta 1 ，2 0 0 2 ；p a s c a l ee ta l ，2 0 0 3 ；d a n i e le ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 应用生物监测水环境中的致突变物质，已有多种方法( 王蕊芳等，1 9 9 6 ；潘晓赋等， 2 0 0 3 ) ，而存在于水体中的污染物，其特点是种类多，浓度低。要直接检测水体中低浓度 污染物的遗传毒性，必须采用高灵敏度的指标。 蝌蚪红细胞微核试验，可能是检测水体中低浓度污染物比较理想的、有实用价值的 生物指示器。这是因为，以蝌蚪为实验动物作微核测定有其特有的优点：1 蝌蚪数量多， 捕捉方便，费用低，易于实验室饲养管理；2 蝌蚪红细胞较大，细胞分裂旺盛，对污染 物的灵敏度高；3 蝌蚪体内具有转化前诱变剂或前致癌剂为具有活性成份的微粒体活化 系统；4 微核标本制片方法简便，易于掌握，指标客观，取得结果快，便于推广应用；5 蝌 蚪微核试验，不仅能检测水体中单因子致突变效应，而且更适合检测污水中混合污染物的 联合致突变效应，具有实用价值：6 。蝌蚪在试验水体中可通过皮肤、鳃及摄食吸收积累 毒物，可直接检测到水体中低浓度的污染物( 贺维顺等，1 9 9 0 ； z 0 0 1 一m o r e l l xc ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 而且用两栖类幼体红细胞微核试验检测水体中污染物，其灵敏度要比鱼类高得多 ( h o o f h n a l l ，1 9 8 2 ；j a y l e t ，1 9 8 6 ；马立明等，2 0 0 2 ；潘晓赋等，2 0 0 3 ) 。 基于以上的优点，国外也己形成了一套完整的两栖类微核试验标准程序：简要的说就 是在水温2 2 0 5 ，正常的光暗循环下，蝌蚪暴露在处理液中1 2 天。处理期间处理液和 食物每日更换一次。同时设立阳性和阴性对照组。处理结束后，用心脏穿刺法取蝌蚪的心 脏血进行涂片，每只蝌蚪制备一张血涂片。用甲醇进行固定，苏木精染色，然后镜检，计 数每张血涂片上1 0 0 0 个红细胞中具有一个或多个微核的红细胞数，再进行统计分析 ( z o o l m o r e u xc ta 1 ，1 9 9 9 ；b 6 k a e ne ta 1 ，1 9 9 9 ，2 0 0 2 ；l a r ye ta 1 ，2 0 0 4 ) 。由于实验材料一致， 方法统一，各个实验室之间可以进行比较，为环境监测作出了很大的贡献。 在国内，不同学者用两栖动物的红细胞微核试验对不同的水体污染物做了研究，为我 国的环境保护做出了很大的贡献。贺维顺等( 1 9 9 0 ) 使用不同浓度的昆明大观河水养殖蝌蚪 7 天，其微核率随着污水浓度的加大而升高，并有明显的浓度效应关系。两栖动物幼体或 蝌蚪用于污水致突变性监测被证明有效，用于饮水监测是否也可行? 正如王蕊芳等( 1 9 9 6 ) 实验所示，只要在受试水样中延长暴露时间同样有效。潘晓赋等( 2 0 0 3 ) 研究了昆明地区 四种蛙血红细胞微核与环境质量的关系，结果发现：同一采集点中，不同种类蛙对相同环 境污染的敏感性不同。且蛙的微核率与各采集点的污染程度呈正相关关系，即污染越严重 的地点微核也就越多。吴美仙等( 2 0 0 4 ) 研究表明：黑斑侧褶蛙成体核异常现象与旱田除 草剂除草通浓度的相关性有一定的范围：且随着时间的推移，黑斑侧褶蛙红细胞核异常率 呈现先上升后下降的规律性变化。当除草通浓度为0 3 3 m g l ( 正常使用浓度的1 4 0 0 0 ) 处理 1 2 小时红细胞核异常率高达2 1 7 ，从整个实验结果看，旱田除草剂对水体的污染性不容 忽视。苑宇哲等( 2 0 0 5 ) 研究了除草剂阿特拉津对弹琴蛙( 胁aa 出门印e u ，a ) 蝌蚪微核和 核异常的影响，结果表明，阿特拉津可引起蝌蚪血红细胞微核率和总核异常率升高；且微 核率随着时间的延长有升高的趋势，除草剂阿特拉津对两栖类蝌蚪具有遗传毒性，可能对 人体具有潜在的致突变作用。卜宁等( 2 0 0 5 ) 采用体内红细胞微核测定法，研究了除草剂 丁草胺对蟾蜍红细胞核的诱变效应，结果表明，在一定的范围内，随着丁草胺浓度的增加 和作用时间的延长，蟾蜍红细胞微核和核异常率呈现先上升后下降的规律性变化。丁草胺 的作用具有双向性。一定剂量的除草剂丁草胺对蟾蜍红细胞具有明显的遗传毒性，除草剂 对水体的污染不容忽视。 从上述的文献中可以看出，在进行环境监测致突变实验时，国内所用两栖动物的蝌蚪 不一一样，基本上都以本地所特有的两栖动物物种为主，有用变态前的蝌蚪的：如饰纹姬蛙 变态前的蝌蚪( 刘清华等，1 9 9 9 ) ，黑斑侧褶蛙蝌蚪( 陈军建等，1 9 9 2 ) ，弹琴蛙蝌蚪( 苑 宇哲等，2 0 0 5 ) ，中华大蟾蜍蝌蚪( 叶亚新等，1 9 9 5 ：汤新慧，1 9 9 8 ；耿德贵等，2 0 0 0 ) ， 华西大蟾蜍变态前的蝌蚪( 贺维顺等，1 9 9 0 ；王蕊芳等，1 9 9 6 ；王蕊芳等，1 9 9 9 ) 还有用成 体的，如：黑斑侧褶蛙成体( 吴美仙等，2 4 ) ，金线蛙成体( 黄雄，1 9 9 4 ) ，蟾蜍成体 ( p 宁等，2 0 0 5 ) 。这些蝌蚪只有在特定的季节才能采集到，试验受到季节的限制。各个 实验室在处理时间及处理方法上也不相同，目前国内许多学者在用两栖动物蝌蚪进彳亍微核 实验时，蝌蚪在污染物中的处理时间有6 4 8h ( 耿德贵等，2 0 0 0 ) 、7 天( 叶亚新等，1 9 9 5 ； 汤新慧，1 9 9 8 ；刘清华等，1 9 9 9 ；f e n ge ta l ，2 0 0 4 ) 的、l o 天( 黄雄，1 9 9 4 ) 还有2 l 天( 王 蕊芳等，1 9 9 6 ) 的等。之所以处理不同的时间，是因为至今还没有一种公认的统一的标准， 相互之间也无法进行比较，极大影响了这些两栖动物在环境监铡中的应用。 1 6 本研究的目的、意义及内容 多年来，我国水资源质量不断下降，水环境持续恶化，由于污染所导致的缺水和事故 不断发生，不仅使工厂停产、农业减产甚至绝收，雨且造成了不良的社会影响和较大的经 济损失，严重地威胁了社会的可持续发展，威胁了人类的生存( 国家环保总局，2 0 0 4 ) 。 卫河是河南省八大河流之一，横穿新乡市区，向东北经山东、河北达天津入海河，是 海河流域的一条重要骨干河道。卫河在新乡市境内全长9 8 公里，是流经新乡市的最大河 流，具有泄洪、排涝、灌溉、供水、航运、景观等多种功能，对新乡市乃至整个地区的经 6 1 前言 济社会发展具有重要作用。 上个世纪7 0 年代以来，随着工农业的迅速发展，入口激增，而城市建设的步伐又远 远落后于经济的发展，大量工业废水和生活污水未经处理直接排入卫河( 崔延瑞等，2 0 0 4 ) ， 加之近年来上游水源干涸及沿河污水污物的随意排放倾倒，造成清水流不进、污水排不出， 致使卫河在新乡市区段成为一潭死水，水质恶化，污染严重，已成为劣v 类水( 刘德文等， 1 9 9 7 ；王国重，2 0 0 2 ) ，给新乡市的经济带来了巨大损失。此外，由于河水污染，水生生 物的数量与品种急剧减少，近年来河内鱼虾绝迹，生态平衡遭到严重破坏( 马双梅等，2 0 0 2 ) 。 面对珍贵的水资源，如不及时采取有效措施，卫河水环境污染将严重影响经济发展和 人民生活。因此，为有效保护和合理使用水资源，控制和治理水污染，必须对卫河水质进 行监测，以确定水体中污染物的时空分布，追溯污染物的来源和污染途径，了解污染物的 迁移转化规律，预测卫河水污染的发展态势，及时对卫河进行治理。 路淑霞等( 2 0 0 4 ) 用蚕豆根尖细胞微核测试法监测卫河水的研究表明：卫河新乡各河 段微核测试呈阳性，卫河新乡河段的污染程度因不同河段而异。但卫河水对两栖动物发育 及遗传毒性影响的研究至今未见有报道。而且从现有的研究情况来看，用两栖动物胚胎对 环境监测的研究，国外已建立起以非洲爪蟾胚胎为模式的两栖类胚胎毒理学生物监测方法 ( 程树培，1 9 9 5 ) 。国内亦有学者用不同的两栖类的胚胎对环境中的有害物质进行监测( 汪 学英等，2 0 0 1 ；卢祥云等，2 0 0 2 ；罗圣庆等，2 0 0 2 ) ，但至今尚未确定一种模式两栖类胚 胎用于生物监测，测试方法也不相同，各个实验室之间难以进行比较，极大影响了我国两 栖动物在环境监测中的应用。 中国林蛙( r 彻n 幽8 h j 加鲫s 括) 作为我国分布最为广泛蛙类之一，是继美国牛蛙之后， 世界上第二个人工养殖成功并进入商品化生产的蛙种( 汪松，1 9 9 8 ) 。关于该蛙所发表的 研究论文以及遗传学资料在我国以及世界上来说都特别众多( 樊龙锁等，1 9 9 8 ；陈壁辉， 1 9 9 l ；费梁，2 0 0 1 ：刘焕亮，2 0 0 4 ) 。黑斑侧褶蛙( 凡却砂此峨0 班口例如缸) 为我国一种广 泛分布的蛙类，研究文献众多( 江耀明和赵尔宓，1 9 9 2 ；庞启平等，2 0 0 2 ；郑荣泉等，2 0 0 2 ； 张雄飞等，2 0 0 4 ) 。故本试验拟用卫河水对中国林蛙和黑斑侧褶蛙的胚胎加以处理，研究 卫河水对中国林蛙和黑斑侧褶蛙胚胎发育的影响，以查明卫河水对水生生物胚胎发育的影 响程度，探讨我国模式两栖类胚胎毒理学生物监测方法的可行性；同时以期通过生物监测， 为判断卫河水污染对环境生态和人群健康可能造成的影响，为治理卫河，改善周边地区居 民的生活质量提供参考和依据。 此外，在进行环境监测致突变实验时，国内所用两栖动物的蝌蚪与国外相比都受到季 1 前言 节的限制，也极大的影响了这些两栖动物在环境监测中的应用。隆肛蛙砌口i m n 圳 碍一毋“n n 是我国的特有蛙种，隶属无尾目，蛙科，蛙属。该蛙体型较大，雄性肛部隆起成 方形，且体长略小于雌性。其生活环境较广泛，一般栖息在海拔5 0 0 1 8 0 0 米的溪流或池塘 中。国内主要分布在陕西南部、甘肃南部、四川、湖北、山西、河南、安徽等地，在秦巴 山区和伏牛山区数量较多，为这些地区蛙类中的优势种( 胡淑琴等，1 9 6 6 ；方荣盛，1 9 8 3 ； 费梁，1 9 9 9 ；张荣祖，1 9 9 9 ) 。而且隆肛蛙食谱中百分之八十以上都是农林害虫，对保护森 林和庄稼，增加产量，维持生态平衡起着积极作用。且该蛙的研究文献较多( 杨玉华等， 1 9 8 6 ；李丕鹏，1 9 9 2 ；李树深等，1 9 9 4 ，1 9 9 6 ；方盛国等，1 9 9 6 ；侯永萍，1 9 9 9 ；梁刚等， 2 0 0 4 ；陈晓虹等，2 0 0 4 a ，b ) ，由于其独特的生物学特性：蝌蚪需2 3 年才完成变态，一年 四季均可以采到其蝌蚪，有可能成为一种不受季节限制、长期、稳定和敏感的环境监测生 物。故本试验还拟对隆肛蛙蝌蚪作为环境监测生物的有关毒理学加以研究，研究卫河水对 隆肛蛙蝌蚪的遗传毒性，以期为人工养殖保护两栖类和环境监测积累资料，提供参考。 作为生态系统的重要组成部分，全球性的两栖类种群数量下降，将对其他的生物产 生重要影响，对生物多样性造成很大威胁。为了探讨全球变化对生命系统的影响，保护人 类生存环境，面对全球性的两栖类种群数量下降趋势，加强对中国林蛙、黑斑侧褶蛙和隆 肛蛙等两栖动物作为环境监测生物的研究，研究蛙类胚胎在卫河水中的耐受限度和卫河水 对蝌蚪的遗传毒性，不仅可以为治理卫河、为保护生物学研究提供科学依据，而且其研究 结果还可应用于环境监测、毒理学等领域，从而推动利用两栖动物作为环境监测生物来评 估当前环境质量的研究，为人与自然的和谐发展奠定基础。 2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 材料、药品和试剂 ( 1 ) 胚胎毒理学试验所甩蛙的受精卵技蝌蚪：2 0 惦年3 _ ，在河南省济源市太行山 国家级猕猴自然保护区采集中国林蚌的雌蛀和雄蛀，：爷回实验室暂