（作物遗传育种专业论文）高粱幼苗水分胁迫诱导表达差异cDNA的研究.pdf

摘要 干旱是能够引起植物发生水分胁迫的一种最重要的环境因子，它极大限度地制约着植物生长 和作物产量。改善和提高植物的抗旱性研究是植物抗逆性研究的重要内容。随着分子生物学技术 的发展，通过基因工程改良植物的抗早能力被广大科研工作者认为是一种快捷、有效的方法。 差异显示反转录聚合酶链式反应。简称d d r t - p c r 。因其操作简单、快速、灵敏性高、易重 复等优点，自1 9 9 2 年由l i a n g 和p a r d e e 发明以来，已成为分子生物学领域一种强有力的工具， 被广泛地用来分离差异表达的基因。 在当前的研究中，我们采用了m r n a 差异显示技术和银染技术，对经过用1 9 5 0 o ( 1 l r 一0 7 m p a ) p e g - 6 0 0 0 溶液处理不同时间而诱导表达的高粱基因进行分离，共得到差异表达的e d n a 片段5 3 条。方法是：用1 9 5 ( 1 l r = o 7 m p a ) p e g - 6 0 0 0 溶液来处理高粱幼苗，用去离子水培育幼苗做对 照，提取的总r n a 经反转录后进行p c r 扩增，扩增的p c r 产物最后经6 的变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离，银染染色后可观察到清晰的条带。所回收的5 3 条差异带，其中包括6 个完全诱导 表达片段，4 2 个上调表达片段和5 个下调表达片段。经r e v e r s e n o r t h e r n 脸证后，得到阳性表达 的e d n a 片段1 3 个。当用单个随机引物对上述1 3 个片段进行再次扩增时，全部表现为阴性。得 到的1 3 个阳性e d n a 片段克隆并测序，通过与g c a b m l k 中的e s t 数据库比对，结果发现，1 0 个c d n a 片段与已知序列有较高的同源性，3 个为未知基因序列。其中，受水分胁迫处理诱导表 达信号增强的e d n a 片段乃4 仍与损伤的二色高粱叶片e d n a 克隆同源性1 0 0 ，与氧化胁 迫的二色高粱叶片和根e d n a 克隆同源性1 0 0 ，与酸碱处理的二色高梁根e d n a 克隆同源性 1 0 0 ，与水杨酸处理的二色高粱苗期e d n a 克隆同源性1 0 0 ；乃j g 4 p 一与氧化胁追的二色 高粱叶片和根e d n a 克隆同源性1 0 0 ：乃j g d 与脱落酸、铁缺乏和盐胁迫诱导的二色高粱苗 期e d n a 克隆同源性1 0 0 。另外7 个受水分胁迫处理诱导表达的e d n a 片段序列与水杨酸处理 的二色高粱苗期e d n a 、损伤的二色高粱叶片e d n a 、氧化胁迫的二色高粱叶片和根e d n a 、酸 碱处理的二色高粱根e d n a 、盐胁迫诱导的二色高粱苗期e d n a 、干旱胁迫诱导的二色高粱开花 前e d n a 、干旱胁迫诱导的二色高粱开花后e d n a 、二色高粱光生长e d n a 、铁缺乏诱导的二色 高粱苗期e d n a 同源性高达9 5 以上。另外3 个差异片段与已知序列同源性非常低，推测可能为 新的基因序列，其序列全长及其功能鉴定有待于进一步的工作。 关键词：高粱，水分胁迫，克隆，差异显示，e d n a a b s t r a c t d r o u g h ti s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n te n v i r o n m e n t a l f a c t o r st h a tc a u s eo s m o t i cs t r e s sa n d d r a m a t i c a l l yl i m i tp l a n tg r o w t ha n dc r o pp r o d u c t i v i t y i t s a ni m p o r t a n tb r a n c ho fp l a n tr e s e a r c ho n s t r e s sr e s i s t a n c et oe n h a n c eo ri m p r o v et h ec 印a b i h t yo fd r o u g h ta n dw a t e rd e f i c i t - - t o l e r a n c ei np l a n t w i t h t h e a d v a n c e o f m o l e c u l a r b i o l o g i c a l t e c h n i q u e ，b i o e n g i n e e r i n g b e c o m e s a r a p i d e f f i c i e n t m e t h o d o f i m p r o v i n gp l a n t r e s i s t a n c et od r o u g h t ，w a t e rd e f i c i t ，o nt h ev i e w p o i n to f m a n yr e s e a r c h e r s d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v c p d et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( d d r t - p c r ) o n eo f t h em o s t w i d e l ye m p l o y e dt e c h n i q u e s t oi d e n t i f yd i f f e r e n t i a lg e n ee x p r e s s i o n , h a sb e c o m eap o w e r f u lt o o li nt h e a mo fm o l e c u l a rg e n e t i c ss i n c e1 9 9 2w h e nt h et e c h n i q u ew a si n v e n t e db yl i a n ga n dp a r d e e t h e t e c h n i q u e i ss i m p l e ，t i m e - s a v i n g ，s e n s i t i v ea n dr e p r o d u c i b l e i np r e s e n tr e s e a r c h ，w ea d o p t e db o t hm r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a ya n ds i l v e rs t a i n i n gt e c h n i q u e st o i s o l a t eg r a i ns o r g h u me d n ai n d u c e db y1 9 5 ( - 0 7 m p a ) p e g - 6 0 0 0 ，t o t a l5 3d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n c d n af r a g m e n t sw e eo b t a i n e d s o r g h u ms e e d l i n g i n1 9 5 p e g - 6 0 0 0 o o l y e 血y l e n ed y c o l ， m w = 6 0 0 0 ，1 l r = - 0 7 m p a ) s o l u t i o nw a su s e da st r e a t m e n ts a m p l e , a n ds o r g h u ms e e d l i n gi nd h 2 0a s c o n t r o ls a m p l e d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fm r n a b e t w e e nt r e a t m e n ts a m p l ea n dc o n t r o ls a m p l ew a s a n a l y s e db y d d r t - p c r t h ep c ra m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s w e r es e p a r a t e d b y6 d e n a t u r i n g p o l y a c r y l a m i d eg e l s d i s t i n c tb a n d sw a r ev i s u a l i z e db ys i l v e rs t a i n i n g at o t a l o f5 3d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o ne d n af r a g m e n t sh a d b e e nd e t e c t e d ，i n c l u d i n g6a b s o l u t ee x p r e s s i o nf x a g m a n t si n d u c e db y w a t e rs t r e s s ，4 2e n h a n c e de x p r e s s i o nf r a g m e n t s ，5i n h i b i t e de x p r e s s i o nf r a g m e n t s a f t e rf u r t h e rc e r t i f i e d w i t hi o v e r s en o r t h e r nd o tb l o t t h i r t e e nf r a g m e n t sa r ep r o v e dt ob ep o s i t i v e w h e na m p l i f i e db ys i n g l e a r b i t r a r yp r i m e r , a l lo ft h ea b o v ef r a g m e n t sa p p e a r e dn e g a t i v e t h e s ef r a g m e n t sw e r ec l o n e di nt h e p g e m - t e a s y v e c t o r t h r o u g hs e q u e n c i n g a n d t h e n q u e r y i n g e s t d a t a b a s e o f g e n b a n k ，w e c a n f m d t h a tt e no f t h e mh a v eh i g hh o m o l o g o u ss e q u e n c e sw h i l et h eo t h e r3h a v ep o o r , o f t h e s et e nf r a g m e n t s ， t n a d p3 w a s 1 0 0 h o m o l o g o u s t ow o u n d e dl e a v e s s o r g h u m b i c o l o re d n ac l o n e 、 o x i d a ( i v e l y - s t r e s s e dl e a v e sa n d r o o t ss o r g h u mb i c o l o re d n ac l o n e 、a c i d - a n da l k a l i n e - t r e a t e dr o o t s s o r g h u mb i c o l o rc d n ac l o n ea n ds a l i c y l i c a c i d - t r e a t e ds e e d l i n g ss o r g h u mb i e o l o re d n ac l o n e t h g a 王r 2w a s1 0 0 h o m o l o g o u st oo x i d a t i v e l y - s t r e s s e dl e a v e sa n d r o o t ss o r g h u mb i c o l o re d n a c l o n e t l i g a p 4 w a s1 0 0 h o m o l o g o u st oa b s c i s i ca c i d - t r e n t e ds e e d l i n g ss o r g h u mb i e o l o re d n a c l o n e 、i r o n - d e f i c i e n ts e e d l i n g ss o r g h u mb i c o l o re d n ac l o n ea n ds a l t s t r e s s e ds e e d l i n g ss o r g h u m b i c o l o re d n ac l o n e o t h e rs e v a nf r a g m e n t sw e r em o r et h a n9 5 h o m o l o g o u st ot h es o r g h u mb i c o l o r c d n ac l o n ei n d u c e d b y a b s e i s i c a c i d - t r e a t e d 、w o u n d e d 、o x i d a t i v e l y - s t r e s s e d 、a c i d a n d a l k a l i n e - t r e a t e d 、s a l t - s t r e s s e d 、d r o u g h t - s t r e s s e db e f o r ef l o w e r i n g 、l i g h t g r o w na n di r o n - d e f i c i e n t 1 1 1 e o t h e r st h e r ew e r el o wh o m o l o g o u st oe s t l i b r a r ya n dw e r es u p p o s e dn o v e lg e n e s ，w h o s e f u n c t i o n sn e e df u r t h e rs t u d y t h e r e f o r , i tm o s tp r o b a b l yb ean o v e lg e n e , a n dt h e r ei ss t i l lm u c h w o r kt od of o ri t sf u l ll e n g t ha n di t sf u n c t i o ni d e n t i f i c a t i o n k e yw o r d s ：s o r g h u m w a t e rs t r e s sc l o n ed i f f e r e n t i a ld i s p l a yc d n a 论文评阅人和答辩委员会 评姓名职称专业单位备注 阅施巾帼教授作物遗传育种中国农业科学院原子能所 人杨丽 副研究员生物技术中国标准化研究院 答 姓名职称专业单位 辩 林忠平教授生物技术北京大学主席 委 刘庆昌教授作物遗传育种中国农业大学成员 员 王述民研究员作物遗传育种中国农业科学院作物科学研究所成员 赵开军研究员作物遗传育种中国农业科学院作物科学研究所成员 会 卢新雄研究员作物遗传育种中国农业科学院作物科学研究所成员 答辩 时间 2 0 0 5 年6 月2 4 日下午 缩略词 a c e t y l a w db s a f b o v i n es e r u m a l b u m e n ) a g a r o s e a m p i c i l l i n a n c h o r - p r i m e r a r b i t a r y - p r l m e r b a c l o _ 廿y p t o n e b a c t o - y e a s te x t r a c t b u f f e r e d n a ( c o m p l e m t m t a r y d n a ) c o m p e t e n te c l l d d r t ( d i f f c r e n t i a l d i s p l a y r e v e b e m m s c r i p t i o n ) d n t p ( d c o x y n u c l e o s i d ct r i p h o s p h a t e ) d r “d i t h i o t h r d t 0 1 ) d e p c ( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t c ) e b ( e t h i d i u mb r o m i d e ) e s t ( e x p r e s s i o ns e q u c t l c e n g ) f o r m a l d e h y d e g l y c e * o l i p t o ( i s o - p r o p y l t h i o b - d - g a l a c t o s i d e ) l b ( l u r l a - b e r t a n l ) l i g a s v l m p ( l o w e rm e l t i n gp o i n t ) a g a r o s c m o p s ( 3 - ( n - m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s w f o n i ea c i d ) p a g e 0 0 l y a c r y l a m i d eg e ld e t r o p h o r e s i s ) p c r ( p o l y m c r a s ec h a i nr e a c t i o n ) p e g - 6 0 0 0 0 0 l y e t h y l e r t e9 1 y e o l ，m w = 6 0 0 0 ) p l a s m i d p r o b e s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) s o b s o c v e c t o r x - g a l ( 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 一3 - i n d o l y l - b - d - g a l a c t o s i d e ) 乙酰化牛血清白蛋自 琼脂糖 氨苄青霉素 锚定引物 随机引物 细菌培养用胰蛋白胨 细菌培养用酵母提取物 缓冲液 互补d n a 感受态细胞 差异显示反转录 脱氧核苷三磷酸 = 硫苏糖醇 焦碳酸二乙酯 溴亿乙锭 表达序列标签 甲醛 甘油 异丙基硫代一口d i 半乳糖苷 l b 培养基 连接酶 低熔点琼艏糖 3 - ( n - 吗琳代) 丙磺酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚台酶链式反应 聚乙= 醇，分子量为6 0 0 0 质粒 探针 十二烷基磺酸钠 细菌培养基名 细菌培养基名 载体 5 i 溴4 i 氯3 - 吲哚- 8 - d 。半乳糖昔 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：年“勿日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名： 燃 缸平 时间：) 必年歹月力日 时间：曲口t 年g 月9 沪日 中国农业科学院硕士学位论文 第一章引言 1 1 研究目的和意义 第一章引言 水是人类赖以生存的物质基础，也是植物生长的先决条件。植物的各种生理代谢过程都是在 水分参与下完成的。尽管地球表面的7 0 被水覆盖，但是在地球总储水量中只有2 - 2 5 是淡水。 这些淡水资源不仅分布极不均匀，而且还有相当一部分无法被人们利用。另一方面，全球干旱、 半干旱地区约占土地总面积的3 6 ，占耕地面积的4 3 。如前苏联、美国、加拿大、澳大利亚等 国家播种面积的7 0 位于干旱、半干旱地区，其余耕地也常因遇到周期性或难以预料的干旱而导 致农作物减产( 汤章城，1 9 8 3 ) 。据统计，世界各地因不同程度的干早所导致的小麦减产每年约 在3 0 2 生右( m u g o e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。因此世界各国对干旱条件下作物的生长给予了很大关注。 我国是世界人口第一大国，预计到2 0 3 0 年人口将高达1 6 亿，处于历史上承载最大人口数量 的关键时期。因此保障粮食安全对于正在发展中的国家经济尤为重要。同世界其他国家相比，由 于自然条件的限制和社会经济发展的巨大需求等原因，我国农业可持续发展面临着严重的水资源 危机( 景蕊莲，1 9 9 9 ) 。我国大部分地区属于中纬度干旱半干旱气候类型，而干旱、半干旱地区 主要分布在华北、西北、内蒙和青藏高原等地区，约占全国土地总面积的5 0 ( 张林刚等，2 0 0 0 ) 。 同时全国受旱面积还在不断扩大，有数据表明2 0 世纪5 0 年代全国平均受旱面积为1 1 3 3 万公顷， 8 0 年代为2 3 3 3 万公顷，而9 0 年代则增加到2 6 6 7 万公顷。因缺水而导致的粮食损失在7 0 0 8 0 0 亿公斤( 景蕊莲，1 9 9 9 ) 。随着社会经济的不断发展和全球气候的变化，水资源不足的形势日益 严峻，今后出现持续干旱的形势不可低估。因此，除了贯彻好宏观上的节水农业、优化生态环境、 节约及合理利用水资源外，培育抗旱、耐早作物新品种成为抵御干旱最为经济、安全和有效的措 施之一，对我国及世界粮食产量的稳定具有极其重要的意义。 植物的抗旱性是指植物在干旱条件下的生存能力，而作物的抗旱性是指在土壤干旱或大气干 旱条件下作物不仅能存活下来，而且能使产量保持在一定水平的能力( 黎裕，1 9 9 9 ) 。干旱胁迫 常常影响作物生长发育，造成作物严重减产。作物的产量是作物遗传基因在特定环境下表达的产 物，其实际产量与生产潜力相差较多的原因是不良环境的危害，其中干旱是很重要的因素之一( 袁 宝玉，1 9 9 8 ) 。传统农业中，通常采用常规方法选育抗旱品种，但是常规方法选育抗旱品种不仅 费时、费力，而且不能满足农业生产对抗早节水新品种的需求。近年来，随着分子生物学研究的 不断深入和生物技术的迅猛发展，利用基因工程技术结合传统育种方法来培育高产、稳产、耐早、 耐盐、抗病等优良性状的作物新品种已成为研究热点之一。 高粱被人们称为“生命之谷”、“救命之谷”，是人类栽培的重要谷物之一，全世界五大洲、 4 8 个国家和地区都有种植，年种植面积大约为“0 0 万h r a 2 ，仅次于小麦、水稻、玉米，列第四 位。研究表明，高粱的蒸腾系数为2 5 0 3 0 0 ，比水稻( 4 0 0 - - 8 0 0 ) 、小麦( 2 7 0 6 0 0 ) 和玉米( 2 5 0 - 4 5 0 ) 小；高粱凋萎系数为5 9 ，低于玉米( 6 5 ) 和小麦( 6 3 ) 。因此，在干旱、半干旱地区发展高粱 生产，有利于缓解水资源短缺的矛盾。目前，随着人民生活水平的提高，高粱在粮食作物中的重 要地位有所下降，但其所具有的许多优良性状和综合利用价值是其它作物无法替代的。在我国干 旱、半干旱、低洼易涝、土壤瘠薄的地区，高粱可作为种植业结构调整的重要粮食作物、出口创 汇的优势作物或适应当地气候条件的特色作物，在促进农村经济增长，增加农民收入等方面起到 愈来愈重要的作用。这是因为高粱植株的各部分均有潜在的利用价值。例如，高粱籽粒和茎叶均 可做为畜、禽、鸟、鱼的饲料，还可酿造白酒、酒精、醋等。高粱籽粒可制糖、加工成淀粉或麦 芽制品：高粱壳可提取色素，并且无任何毒副作用，可广泛应用于食品添加剂、化妆品等行业， 茎秆可制作板材，髓可加工成食用纤维，高粱蜡粉可加工成蜡质，具有耐高温特性，等等( 马尚 耀等，2 0 0 2 ) 。 随着工农业的发展，耕地面积逐渐减少，自然灾害发生频率增加，高粱作为减灾作物将在国 民经济发展中起着重要的作用。高粱具有抗逆性强的特性，既抗旱、耐涝，又耐盐碱、耐瘠薄。 因此，本研究以高粱作为材料，研究抗旱相关基因的表达，旨在为从分子水平上认识植物抗旱机 理，发掘并利用抗旱基因奠定基础。 1 2 作物抗旱性研究概况 1 2 1 作物的抗旱性及其生理机制 1 2 1 1 作物的抗旱性 作物的抗旱性可定义为作物物种或品种在蒙受周期性水分亏缺的地区能正常生长、结实的能 力。从生物学上讲，植物在干旱条件下存活并不一定和最高产量有联系。在水分匮乏的环境里， 植物常常通过部分或完全保护生命的方式，即减少叶面积、抑制代谢作用等继续存活，这类存活 机制往往与降低产量潜力有关。作物品种资源中，在干旱条件下存活能力强的基因型其农艺性状 往往较差、产量较低，难以直接利用，这就赋予抗旱育种工作者以艰巨的任务，要将抗旱性和丰 产性统一于一体，选育抗旱丰产的品种。 作物的抗旱性可以划分为避早性、御旱性和耐旱性三类。作物的避旱性定义为在土壤发生严 重水分亏缺之前作物完成其生活史的能力，包括迅速的物候发育和发育的可塑性。作物的御早性 也称为高水势下的耐旱性，指干早条件下作物保持体内充足水分的能力，包括水分损失的限制和 水分吸收的维持。作物的耐旱性是指作物忍受低水势和耐脱水的能力，包括两种机理：一种是使 植物适应低水势并维持生长、发育及生产的机理；一种是使作物熬过并从严重干旱中恢复过来的 机理，即耐干性( 山仑等，2 0 0 0 ) 。抗旱性虽然是一个很复杂的问题，但不同基因型间的抗旱性 差异是确实存在的( 景蕊莲等，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 2 作物抗旱的生理机制 1 2 1 2 1 气孔调节 植物对水分亏缺的最初反应是通过减小气孔口径来调节气孔开度，尽可能地减少因蒸腾作用 造成的水分散失。气孔的反应方式有两种：一种是对空气淀度的直接反应；另一种是对叶片水势 变化的反应。植物组织的水势体现了植物体内水分的能量状态，可与土壤和大气中的水分联系起 来，直接决定着植物对水分的吸收、运输和散失过程。现在人们已经知道叶片气孔的关闭是由根 系在干旱胁迫下产生的a b a 通过导管输送到叶片的气孔上实现的。由此，可以通过转基因技术 2 中国农业科学院硕士学位论文 第一章引言 将编码a b a 生物合成关键酶的基因导入植物基因组中，使作物在干旱胁迫条件下产生更多的 a b a ，从而引起气孔的关闭进而达到抗旱的目的。当然气孔关闭会影响光台作用的效率，进而影 响作物的生长。因此必须协调好两者之间的关系，使作物既具有一定的抗旱性，同时又有较好的 生长势。 1 2 1 2 2 渗透调节 在受到轻度干旱胁迫时，作物能够通过渗透调节降低水势，保持膨压。作物的渗透调节主要 通过积累渗透调节物质来实现。朱志华等( 1 9 9 5 ) 研究认为小麦品种渗透调节能力与抗旱性呈显 著正相关，不同生育期渗透调节能力不同，灌浆期最高，苗期次之，孕穗期最低。目前已知的渗 透调节物质有：蔗糖、甘露醇、脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱、海藻糖、果聚糖、肌醇、多胺等小分 子化合物( 张树珍等，2 0 0 1 ) 。此外，离子和水分通道的变化调节着离子和水分进出细胞，也是 渗透调节的重要方面。如在正常情况下游离脯氨酸含量仅为0 2 0 6 m g g 干重，占总游离氨基酸 的百分之凡。而在干旱条件下它可成1 0 倍地增加，相对量可达到3 0 以上。由此通过转基因技 术能使作物本身在干旱条件下产生更多的渗透调节保护物质，从而可大大提高作物的抗旱性。甜 菜碱是植物中另一类常见的亲和性渗透物质，广泛存在于高等植物、动物与细菌中。干旱胁迫下， 甜菜碱的累积与胆碱加单氧酶( c m o ) 和甜菜碱醛脱氢酶( b a d h ) 活性的增加密切相关 ( b m u q u i s s c e ta 1 ，1 9 8 9 ) 。此外，渗调蛋白、脱水素、胚胎发育后期丰富蛋白等大分子物质也对 渗透调节有一定贡献。 1 2 1 2 3 清除活性氧 8 0 年代以来，人们对干旱胁迫下植物体内抗氧化防御系统进行了大量研究，发现植物体内存 在着一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质，如超氧歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧 化氢酶( c a t ) 和抗坏血酸( a s a ) 等。它们协同抵抗干旱胁迫造成的氧化伤害，但是，单一的 抗氧化酶或抗氧化物不足以完全防御这种氧化胁迫。如s o d 催化两个超氧自由基发生歧化反应 形成0 2 和h 2 0 2 ，h 2 0 2 再被p o d 和c a t 催化。在整个氧化防御系统中，s o d 是所有植物在氧化 胁迫中起重要作用的抗氧化酶。根据其结合金属离子的不同，s o d 可分为c t l 亿n - s o d 、m n - s o d 和f e s o d3 种类型。c u z n s o d 主要存在于叶绿体和细胞质中，m n - s o d 主要存在于线粒体中， f e - s o d 则主要位于叶绿体中。一般来讲，干旱胁迫条件下植物体内s o d 等酶的活性与植物抗氧 化胁迫能力呈正相关。抗旱性强的植物，在干旱胁迫下，s o d 、p o d 、c a t 的活性较高，因而能 有效地清除活性氧，抑制膜脂过氧化。 1 2 1 2 4 改变光合作用途径 c 3 植物的光合作用是在白天进行，即白天开放气孔吸收和同化c 0 2 ，但白天气温较高、蒸 腾强，不利于在干旱条件下保持水分。而景天科代谢( c a m ) 途径是夜间开放气孔进行c 0 2 的 吸收和固定，白天关闭气孔减少蒸腾失水。研究发现某些植物在水分亏缺条件下，可以由c 3 途 中国农业科学院硕士学位论文 第一章引言 径转变为c a m 途径( 张秀海等，2 0 0 1 ) 。 1 2 1 2 5l 蛋白、水通道蛋白和脱水素 l e a 蛋白，全称为胚胎发育晚期丰富蛋白( l a t e - - e m b r y o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n ) ，是指胚胎 发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质，最早发现于棉花胚胎发育后期的子叶中( d u r ee t a l ， 1 9 8 1 ) 。l e a 蛋白在干早过程中能对植物起一定的保护作用，使植物能够在水分亏缺时，保持细胞 膜系统及生物大分子免受破坏。特别是在极端干旱的情况下，被诱导出的l e a 蛋白对植物所起的 保护作用显得更为突出。目前推测l e a 蛋白可能有以下三方面的作用：( 1 ) 作为脱水保护剂。由 于l e a 蛋白在结构上富含不带电荷的亲水氨基酸，它们既可能像脯氨酸一样，通过与细胞内的其 它蛋白发生相互作用，使其结构保持稳定，又可能给细胞内的束缚水提供了一个结合衬质，从而 使细胞结构在脱水中不致遭受更大的破坏；( 2 ) 作为一种调节蛋白而参与植物渗透调节；( 3 ) 通 过与核酸结合而调节细胞内其它基因的表达。有些l e a 蛋白含有一些带正电荷的保守区域，有人 推测这些区域可以同核酸类物质结合。 水通道蛋白是一类膜蛋白，分子量约2 6 2 9 k d ，这类蛋白形成水分运输的特异性通道，能 增强细胞膜对水分的通透性。水通道蛋白属于主要内在蛋白( m a j o r i n t r i n s i c p r o t e i n ，m i p ) 家族。 所有的m i p 蛋白在结构上均有6 个跨膜的结构域，其羧基端及氨基端位于细胞质的一侧。水通道 蛋白最早发现于哺乳动物的某些特殊的细胞类型中，如红细胞、肾小管细胞等。最近在植物中也 发现了多种水通道蛋白，这些水通道蛋白可分为两类：质膜水通道蛋白和液泡水通道蛋白。 近年来，复苏植物成为研究高等植物耐旱机制的热点。i n g r a m 等在复苏植物的叶子中发现通 常存在于种子发育早期的脱水蛋白，又称脱水素( d e h y d r i n ) ( i n g r a ma 1 ，1 9 9 6 ) 。它是一种广泛 存在于高等植物的干旱诱导蛋白，含有一个或数个由1 5 个氨基酸组成的富含赖氨酸的保守区， 即e m k e k l p g 。这类蛋白具有很强的亲水性和热稳定性。赵恢武等( 2 0 0 0 ) 根据已知 植物脱水素基因的保守区域设计引物，采用r t - p c r 方法从耐旱植物厚叶旋蒴苣薹的总e d n a 中 扩增出一个5 0 0 b p 的与植物脱水素基因同源的序列。结合5 r a c e 获得了植物脱水素基因家族 的一个新成员b d n l 的全长e d n a ( 1 1 4 8 b p ) 。s o u t h e r n 杂交分析表明，b d n l 基因在厚叶旋蒴苣 薹基因组中以单拷贝形式存在；n o r t h e r n 杂交结果表明该基因的表达受千早、寒冷及a b a 的诱 导。由此推断该基因可能与厚叶旋蒴苣薹的耐早特性有关。 1 2 2 作物抗旱性的分子生物学基础 随着生物技术的发展，人们利用分子生物学方法对作物的抗旱性展开了一系列研究。研究表 明，作物耐受干旱胁迫的一系列生理生化代谢途径，如水分吸收的维持或增强、光合作用的保护、 离子稳态的维持等，都是受多基因控制的，具有数量性状性质。有报道认为，a b a 积累、渗透 调节、根系形态等变化是受多基因控制的( r a y e ta 1 ，1 9 9 6 ；t u b e r n s ae ta 1 ，1 9 9 8 ：c h a m p o u xe t a 1 ，1 9 9 5 ：l i l l e ) , e ta 1 ，1 9 9 6 ：l e b r e t o n g t a l ，1 9 9 5 ) ，由此可以理解作物抗旱性的数量性状本质。 另有报道认为，这些与干旱胁迫诱导相关的基因可能是一些结构基因或调节基因( s c h w a r t z ，1 9 9 7 ： l i ue ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在抗早相关性状的分子标记方面，r f l p 、r a p d 、a f l p 和s s r 等分子标记技 4 中国农业科学院硕士学位论文 第一章引言 术越来越多地被用于种质资源和品种的筛选、鉴定，已从不同作物几种性状的数量性状位点 ( q u a n t i t a t i v e t r a i t l o c i ，q t l ) 作图研究中获取大量信息，也鉴定出一些编码具有潜在功能蛋白 的干旱诱导表达基因，例如水稻、豌豆、西红柿及模式植物拟南芥等( n e i l l e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 1 3 干旱诱导的基因表达与调控 1 3 1 干旱诱导的基因表达 现已分离出许多干旱诱导基因，对此研究较多的有l e a 基因和从拟南芥中分离出的一些基因， 这些基因表达的多肽，有的功能已经清楚( i n g r a i ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。如从拟南芥中分离的e r d ( e a r l y - r e s p o n s i v e t od e h y d r a t i o n ) 、r d ( r e s p o n s i v et od e s i c c a t i o n ) 、t m p ( t r a u sm e m b r a n e p r o t e i n ) 及番茄的a r s 基因，常以多基因家族形式存在，可迅速地应答干旱，其中对r d 基因的研究较深 入。在拟南芥中分离到的r d 2 、r d l 9 、r d 2 1 、r d 2 2 、r d2 9 、r d l 7 、r d 2 0 、r d2 5 和r d2 6 基因，它们表达的时间及产物功能皆不同。在干旱处理1 5 h 后，r d2 1 和r d1 9 开始表达：干旱 处理7 0 h 后，尼d2 0 和且d2 开始表达；干旱处理l o o h 后，r d2 2 、兄d2 8 和尼d1 7 才开始表 达，而r d2 9 却表达2 次，先在干旱处理2 0 m i n 后表达，然后在干旱处理3 o h 后又开始表达。 此外r d 2 2 和r d 2 9 基因的表达还可被a b a 诱导，但a b a 不能诱导r d l 9 、r d2 1 和r d 2 8 基 因的表达，这表明植物应答干旱胁迫时，r d 基因表达有几个信号途径( y a m a g u c h i - s h i n o z a k i e ta 1 ， 1 9 9 2 ) 。 y a m a g u c h i s h i n o z a k i 等( s h i n o z a k i e ta 1 ， 1 9 9 7 ) 从拟南芥中克隆到4 0 多个脱水诱导基因， 通过对这些脱水诱导基因的表达分析，他们认为在脱水反应中至少存在4 条信号转导途径，其中 2 条依赖于a b a ，2 条不依赖。如r d 2 2 基因的诱导可被a b a 调节，其启动子为一个6 7 b p d n a ， 其中m y c 和m y b 两位置在脱水诱导的表达中像是顺式作用元件。d n a 结合蛋白r d 2 2 b p l 和 r d 2 2 b p 2 ，分别特异地与6 7 b p 片段中的m y c 和m y b 位置结合。r d 2 2 b p l 基因的转录可被脱水 和a b a 处理所诱导，而r d 2 2 b p 2 基因可被a b a 诱导。因此，这两种蛋白在脱水条件下，可协 同执行r d 2 2 基因的表达。而不依赖a b a 信号途径的基因r d 2 9 a ，它的启动子至少包含两个顺 式作用元件，一个是在和a b a 有关的对脱水处理作出缓慢反应的过程中起作用，另一个是在不 需要a b a 参与的快速诱导中起作用。r d 2 9 a 启动子位于1 3 3 到6 1 的5 3 b p 区域内，含有一个和 a b r e 相似的序列及类似于激活子a s l 的序列，它们在r d 2 9 a 的第二次慢速诱导过程中起作用， 而启动子内位于2 6 8 到1 1 1 之间具有两个2 0 b p 的同向重复序列( a 1 a c t a c c g a c a t g a g t t ) ， 其中央的9 b p 序列( t a c c g a c a t ) 命名为同向重复1 或d r l ，是水分胁迫诱导r d 2 9 a 表达过 程中起调节作用的元件。它的缺失会造成r d 2 9 a 对水分胁迫不应答。d r l 是一个新的水分胁迫 应答元件( d r e ) ，它也可在高盐和低温应答中起作用，但不被a b a 诱导。而且它在行使功能时 不需要其它元件参与，借助不同顺式作用元件实现不同表达方式( y a m a g u c h i - s h i n o z a k ie t a 1 ， 1 9 9 4 ) 。现又分离出两种编码d r e 结合蛋白( d 砌b l a 和d r e b 2 a ) 的c d n a ，这两种蛋白包含 一个保守的d n a 结合基序，在体外可特异的结合到d r e 序列上。d r e b i a 基因表达可被低温胁 迫诱导，d r e b 2 a 基因的表达可被脱水诱导。因此，在低温和水分胁迫条件下，此两种蛋白像反 式作用因子分别在两个单独信号转导途径中起作用( l i ue t a l ，1 9 9 8 ) 。 5 1 3 2 千旱诱导基因表达的调节 众所周知，a b a 能够协调植物对逆境的反应。许多干旱诱导蛋白可以通过外源a b a 进行模 拟。如正常玉米幼苗经a b a ( 1 0 。t o o l l - 1 ) 溶液处理时，胚轴中合成的蛋白类型与p e g 处理的结 果相同( h e i k k l ae ta 1 ，1 9 8 4 ) 。p e g 诱导水稻幼苗产生的m r 为2 3 0 0 0 的蛋白及在种子脱水时产 生的l e a 蛋白均可被a b a 诱导。低温、高盐、干旱和a b a 都可使c d s p 3 4 的合成显著升高。因 此推测低温、干旱和高盐导致植物体内a b a 含量升高，而a b a 又诱导编码水分胁迫蛋白基因的 表达。但有些试验的结果却与此相反。如马铃薯中的c d s p 3 2 虽然可以被干旱、低温和商盐所诱导， 但其合成不受外源a b a 的影响。编码拟南芥类受体蛋白激酶的基因均可被脱水、a b a 、高盐和 低温所诱导，但脱水诱导此基因的表达与a b a 无关( h o n g e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 通常，一个基因的表达往往受多种因素的调节。如渗压素基因的表达至少受a b a 、渗透胁 迫、乙烯、伤害及t m v 感染等5 个信号的调控( l a r o s ae ta 1 ，1 9 9 2 ) 。渗压素还可以在缺乏植物 生长素的植株中积累，这暗示渗压素的积累也许受生长素与细胞分裂素的调节( g r o s s e te ta 1 ， 1 9 9 0 ) 。在给小麦离体胚外施a b a 时，可引起其e m 蛋白转录的提高，但当使用成熟胚时，e m m r n a 的合成不受a b a 的诱导，这说明不仅仅是a b a 一种信号负责e m 的表达( w i u i a m s o ne t a 1 ，1 9 8 8 ) 。可以被盐和水分胁迫诱导的n p 2 4 在番