（营养与食品卫生学专业论文）氯霉素残留快速检测胶体金试纸条的研究.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究 成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经 发表或撰写的成果内容。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 。 作者签名：王弗 ， 日期：如挥多月矽日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科 技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：王韦 日期：埘年3 月留日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口( 请在方框内打“4 一) ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密曰( 请在方框内打“4 ) 。 e t 期：瑚矿年3 月谚日 日期：亨年岁月毒日 摘要 本论文利用胶体金标记快速检测技术对氯霉素兽药残留快速检测方法进行了系 统的研究。通过优化各项实验指标，建立了渗滤式( f l o w - t h r o u g h ) 和层析式( l a t e r a l f l o w ) 两种金标记免疫竞争快速筛选方法。以氯霉素与固相膜上的氯霉素卵清蛋白 ( c a p o v a ) 偶联物( 即包被抗原) 竞争结合金标记抗氯霉素多克隆抗体的方法，通 过胶体金显色达到快速检测样品中氯霉素残留的目的。 采用柠檬酸三钠还原氯金酸法，制备出粒径为2 0n n l 的胶体金，以此作为标记物 标记抗氯霉素多克隆抗体，其中稳定1m l 胶体金所需抗体量约为1 8p g 。f l o w - t h r o u g h 和l a t e r a l f l o w 两种试纸条分别选用了硝酸纤维素( n c ) 膜和带底板的n c 膜及吸收 垫作为材料。将c a p o v a 偶联物和羊抗兔二抗按1 “g s t r i p 的和0 31 t l s t r i p 分别平 行喷涂于n c 膜上作为检测带和质控带，两条带间隔3 衄。两种试纸条的最低检出 限分别为0 8u g l 和1u g l 。 以甲醇为提取溶剂，磷酸盐缓冲液p b s 0 0 5 t w e e n 为基质掩蔽剂，对猪肉、鸡 肉、鱼、虾、牛乳等样品进行了添加回收实验并通过酶联免疫吸附测定方法验证了两 种快速检测方法的有效性。结果表明该方法的回收率为7 0 1 1 1 2 5 ，变异系数均 小于1 0 ，可成功地用于样品中氯霉素残留的快速检测。 课题还进一步研究了几种氯霉素的结构类似物对其快速检测的干扰。除氯霉素琥 珀酸钠外，甲砜霉素、氟甲砜霉素、氨卞西林和磺胺二甲基嘧啶在浓度为1 0 0 0 g l 时均对氯霉素检测无明显干扰，说明了检测方法的高特异性。稳定性实验证明了f l o w - t h r o u g h 金标试纸条在4 下6 个月内可保持检测结果的可靠性。 该试纸条检测方法无需检测仪器，操作简单，快速，1 5r a i n 内即可得出检测结果。 实验结果稳定性高，可作为动物源性食品中氯霉素残留现场大量筛选的有效手段，也 可为其他农兽药残留检测试纸条的研制提供借鉴。 关键词：氯霉素；胶体金；渗滤式；层析式；快速检测 r a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，t h er a p i dd e t e r m i n a t i o no fc h l o r a m p h e n i c o l ( c a p ) r e s i d u e sw a ss t u d i e d b y c o l l o i d a l g o l d b a s e d t e s t s t r i p s t h ec a pc o m p e t e d w i t l lc a p - o v ac o n j u g a t e i m m o b i l i z e do nt h es t r i p st oc o m b i n e 、析也t h ec o l l o i d a lg o l d l a b e l e da n t i - c a pp o l y c l o n a l a n t i b o d i e s ( p a b s ) a f t e ro p t i m i z i n gt h ev a r i o u sf a c t o r sa n dc o n d i t i o n so ft h et e s t ，t h e c o m p e t i t i v ei m r n u n o a s s a yo ff l o w - t h r o u g ha n dl a t e r a l - - f l o wc o l l o i d a lg o l d l a b e l e dt e s ts t r i p s w e r ed e v e l o p e df o rt h er a p i do n - s i t ed e t e c t i o no fc a pr e s i d u e s g o l dc h l o r i d ew a sr e d u c e d 州t 1 1s o d i u mc i t r a t et om a k e2 0n mc o l l o i d a lg o l d ，w h i c h w a sc o u p l e d 、析t l lt h ep a ba si m m u n o c o l l o i d a lg o l d 18p go ft h ea n t i b o d yw e r en e e d e dt o s t a b i l i z e1m lg o l ds 0 1 t h en i t r o c e l l u l o s ef n c ) m e m b r a n ea n da b s o r bp a b 谢mn c m e m b r a n ew e r es e l e c t e da st h em a t e r i a l so ff l o w - t h r o u g ha n dl a t e r a l - f l o w , r e s p e c t i v e l y t h e c a p - o v ac o n j u g a t ea n dg o a ta n t i - r a b b i ti g gw e r ed i s p e n s e do n t ot h en cm e m b r a n ea s t e s tz o n ea n dc o n t r o lz o n ew i t h1 g s t r i pa n do 3i _ t l s t r i p t h es p a c eb e t w e e nt h et w o z o n e sw a s3m m t h el i m i t so fd e t e c t i o no ff l o w - t h r o u g ha n dl a t e r a l - f l o ww e r eo 8 “g l a n dlp g l ，r e s p e c t i v e l y t h es p i k e da n dr e c o v e r ye x p e r i m e n t so fp i gm u s c l e ，c h i c k e nm u s c l e ，f i s hm u s c l e ， s h r i m pm u s c l ea n dm i l ks a m p l e sw e r ec o n d u c t e dw i t ht h em e t h a n o la st h ee x t r a c ts o l v e n t ， a n dt h em a t r i xe f f e c tc o u l db er e m o v e db yd i l u t i o n 、析也p b s t t h ec o n f i r m a t i o no ft h i s s t u d yw a sv a l i d a t e db ye n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y t h ea v e r a g er e c o v e r yo ft h i s m e t h o dw a s7 0 1 l1 2 5 ，a n dt h ec o e f f i c i e n t so fv a r i a t i o nw e r eu n d e r1 0 t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h et e s ts t r i p sc a nb ea p p l i e di nt h er a p i dd e t e c t i o no fc h l o r a m p h e n i c o l r e s i d u e s t h ei n t e r f e r e n c ew i t ht h ed e t e c t i o no fc a pr e s i d u e sc a u s e db yt h es t r u c t u r a la n a l o g u e c o m p o u n d sw a ss t u d i e d w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft h i a m p h e n i c o l ，f l o r f e n i c o l ，a m p i c i l l i n a n ds u l f a m e t h a z i n ew a s10 0 0 g l ，t h ee f f e c to fc r o s s - r e a c t i v i t yc o u l db ei g n o r e d 诵t 1 1t h e e x c e p t i o no fc h l o r a m p h e n i c o ls o d i u ms u c c i n a t c ，w h i c hv a l i d a t e dt h es p e c i f i c i t yo f t h et e s t b e s i d e s ，t h es t a b i l i t yt e s ti n d i c a t e dt h a tt h er e l i a b i l i t yo ff l o w - t h r o u g hs t r i p sw a sg o o da t4 晰也i n6m o n t h s t h ep r o c e s so fd e t e c t i o ni ss i m p l e ，r a p i da n dc o n v e n i e n t ，w h i c hc o u l db ef i n i s h e d w i t h i n15m i n u t e s t h er e s u l t sc a nb ev i s u a l l yr e a db ye y e sw i t h o u ti n s t r u m e n t a t i o n t h e s t a b i l i t ya n ds i m p l i c i t ym a k ei t f e a s i b l et od e t e r m i n et h el a r g en u m b e ro fa n i m a ld e r i v e d f o o ds a m p l e s t h em e t h o dc o u l db eu s e da sr e f e r e n c ef o rt h ed e t e c t i o no fo t h e rv e t e r i n a r y d r u g sr e s i d u e s k e yw o r d s ：c h l o r a m p h e n i c o l ，c o l l o i d a lg o l d ，f l o w t h r o u g h ，l a t e r a l - f o w , r a p i dt e s t 目录 l 前言：1 1 1 氯霉素1 1 1 1 概述1 1 1 2 理化性质“1 1 1 3 氯霉素的药理学2 1 1 4 氯霉素的毒副作用3 1 1 5 氯霉素残留污染现状5 1 1 6 氯霉素残留的检测技术7 1 2 免疫胶体金技术及其应用1 1 1 2 1 胶体金的发现1 1 1 2 2 胶体金的性质及制备1 2 1 2 3 胶体金标记蛋白质i 1 5 1 2 4 免疫金的纯化1 6 1 2 5 胶体金标记免疫检测技术及其应用1 7 1 3 论文研究的目的及意义一1 9 1 4 研究内容“1 9 2 材料与方法”2 0 2 1 实验材料2 0 2 1 1 主要药品和试剂2 0 2 1 2 仪器及材料2 0 2 1 3 载体膜2 1 2 1 4 主要溶液的配制”2 1 2 2 实验方法“2 1 2 2 1 抗氯霉素多克隆抗体的处理2 2 2 2 2 胶体金的制备2 3 2 2 3 免疫金的制备2 4 2 2 4f l o w t h r o u g h 金标记试纸条制备及检测步骤2 5 2 2 5l a t e r a l f l o w 金标记试纸条制备及检测步骤2 6 2 2 6 胶体金试纸条检测条件的优化2 7 2 2 7 最低检出限的确定。2 7 2 2 8 试纸条检测方法的特异性2 7 2 2 9 实际样品的分析2 8 一 3 3 胶体金与抗氯霉素多克隆抗体结合最适p n 值的优化”3 3 3 6 胶体金试纸条检测条件的优化t 3 5 3 1 0 4 直接竞争酶联吸附测定法验证试纸条方法的有效性一4 3 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 氯霉素 1 1 1 概述 氯霉素类( c h l o r a m p h e n i c o l s ，c a p s ) 包括氯霉素( c a p ) 及其衍生物，又称为 酰胺醇类( a m p h e n i c o l s ) 【l 】 药物的母体结构如图1 1 所示，其中r l 和r e 为不同基团 取代后可以得到一系列不同的氯霉素类药物。 r o i i o h n h c c h c l 2 ii c h c h c h 2 r 2 图1 - 1 氯霉素类药物的化学结构 f i g 1 1c h e m i c a ls t r g c t t l r c so fc h l o r a m p h e n i c o l s 到目前为止，氯霉素类药物已发展到了第三代。第一代为：氯霉素( c h l o r a m p h e r f i c o l ， c a p ) 及其酯类，第二代为甲砜氯霉素( t h i a m p h e n i c 0 1 ) ，第三代为氟甲砜氯霉素 ( f l o r f e n i c 0 1 ) 或称氟苯尼考，本文提到的氯霉素专指第一代中的氯霉素，第二代和 第三代的氯霉素类药物一般制成针剂，常用于宠物疾病的治疗药物，价格相对较贵， 应用不是很广泛。现在世界有些国家也把甲砜霉素和氟甲砜霉素应用于水产养殖和畜 禽养殖中【2 1 。 氯霉素最初是由委内瑞拉链丝菌( s t r e p t o m y c ev e n e z v e l a ) 的培养液中提取制得的， 是一种广谱抗生素，也是第一种采用化学合成法产生的抗生素，其化学名称为d ( ) - 苏阿型一1 一对硝基苯基2 - 二氯乙酰胺基1 ，3 丙二醇( 简称氯胺丙醇) ，因其分子中含 有一个不游离的氯，故命名氯霉素【3 1 ，最初用于临床，后来被广泛用于畜禽等养殖业 中。 1 1 2 理化性质 1 前言 氯霉素呈白色针状或长片状结晶，熔点1 5 0 5 1 5 1 5 ，紫外最大吸收在2 7 8 n m 。2 5 时氯霉素在水中的溶解度约为2 5m g n ：l l ，2 0 时溶解于4 0 0 份水、2 5 份 9 5 乙醇和7 份丙二醇中。易溶于大多数有机溶剂，如醇类、丙酮、乙酸乙酯等，难 溶于苯、石油醚及植物油。氯霉素饱和水溶液的p h 值为4 5 7 5 。 氯霉素很稳定，在沸水中煮沸5h 不失效，在p h2 9 、室温情况下抗生活力可持 续2 5h 之久，在p hl o 以上可失去活性【4 5 】。干燥晶体可储备两年以上。在酸碱( 较 敏感) 及加热条件下能发生水解。氯霉素具有热稳定性，通过蒸煮等加工方式无法将 食品中的氯霉素破坏而使其失去毒性，也没有其他好的方式去除氯霉素而不影响食品 品质、风味和引入新的危害。总之，食品中一旦残留有氯霉素就没有合适的方式将其 消除。 氯霉素的紫外吸收光谱显示最大吸收位置和波谱形状表明其是硝基苯的衍生物， 经确证氯霉素分子式为c 】l h 】2 c 1 2 n 2 0 5 ，分子量为3 2 3 1 3 ，氯霉素的合成品具有左旋光 性，故又名左霉素( l e v o m y c e t i n ) ，而右旋体无抗菌活性【2 】。含等量的左旋体和无效 右旋体的混旋体为合霉素( 混旋氯霉素) ，现已淘汰。 为降低氯霉素对造血系统的毒性、增加水溶性和生物利用度等，曾对氯霉素进行 了结构改造。如将氯霉素与琥珀酸、硬脂酸、泛酸及棕榈酸等反应制成各种氯霉素酯， 如棕榈酸氯霉素、琥珀酸氯霉素( 单酯) 。这些酯类作为氯霉素前药，进入体内后经 酶解释放出氯霉素发挥药效，藉此可降低氯霉素的毒性，延长作用时间，提高其血浓 度。棕榈氯霉素俗称无味氯霉素，为白色滑腻结晶粉末，熔点8 6 9 2 ，不溶于水、 石油醚，易溶于醇类、氯仿、乙醚及苯中。琥珀酸氯霉素为淡黄色结晶型粉末，易溶 于稀碱和乙醇，不溶于乙醚和氯仿【6 j 。 1 1 3 氯霉素的药理学 1 1 3 1 药效学 氯霉素为脂溶性，通过弥散进入细菌细胞内，并可逆的结合在细菌体内7 0 s 核糖 体的5 0 s 亚基上，能特异地阻止m r n a 与核糖体的结合，同时又能抑制酰基转移酶的 作用，使肽链增长受阻，从而阻止蛋白质的合成1 7 j 。 氯霉素一般对革兰氏阴性菌作用较革兰氏阳性菌强。敏感菌有肠杆菌科细菌( 如 大肠杆菌、产气肠杆菌、克雷伯氏菌、沙门氏菌等) 及炭疽杆菌、伤寒杆菌、副伤寒 杆菌、痢疾杆菌产气杆菌、肺炎球菌、链球菌、李斯特氏菌、白喉杆菌、葡萄球菌等。 衣原体、钩端螺旋体、立克次体也对本品敏感。本品对厌氧茵如破伤风梭菌、产气荚 膜杆菌、放线菌及乳酸杆菌、梭杆菌等也有相当作用。但对绿脓杆菌、结核杆菌、病 毒、真菌等均无效。对各种立克次氏体、原虫及部分病毒也有一定的抑制作用。 氯霉素自1 9 4 8 年上市以来一直是治疗伤寒、副伤寒和沙门氏茵病的首选药物。 对乳房炎也有很好的疗效。氯霉素内服吸收良好，但注射吸收缓慢、主要滞留在局部。 吸收后全身分布，并能透过血脑和胎盘屏障f 8 1 。大部分氯霉素在肝中与葡萄糖酸结合 天津科技大学硕士学位论文 而失活，少部分降解为芳胺。约1 0 原形氯霉素经肾排泄，亦能通过乳汁分泌。肝或 肾功能障碍使消除延长，易发生蓄积中毒。 细菌对氯霉素有发展缓慢的耐药性，主要产生乙酰转移酶。通过质粒传递而获得。 某些细菌的一些菌株( 绿脓杆菌、变形杆菌、克雷伯菌等) 也因改变了细菌胞壁通透 性，使氯霉素不能进入菌体而耐药。 1 1 3 2 药动学 氯霉素给犬内服后易于吸收，2h 左右出现血药峰浓度。猪内服的情况与犬相似。 给马内服需高剂量( 5 0m g k g ) 才可产生短暂( 不到8h ) 的有效血浓度( 5 舭以 上) 。成年反刍动物( 牛、羊) 内服常量达不到有效血浓度，可能是通过瘤胃时部分 为瘤胃微生物所迅速降解。犊牛内服本品亦需要较高剂量( 1 5 0m g k g ) 才能达到有效 血药浓度。氯霉素肌内注射后在注射部位蓄积，吸收比内服慢( 反刍动物除外) ，牛 在2 1 2h 产生并维持有效血浓度。琥珀氯霉素的水溶性强，注射后吸收迅速，给母牛 一次肌内注射5 0m g k g ，其血药峰浓度较同量氯霉素高6 倍，消失也较快。静脉注射 氯霉素能立即达到血药峰浓度，有效血浓度的维持时间短，例如给母牛静脉注射1 1 r n e , l ( g 氯霉素，只能维持有效血浓度4 - - 5h 。琥珀氯霉素给鸡肌内注射后，吸收及消除 均迅速，1 0m i n 达血药峰浓度，6h 即不易检出；以4 0 8 0m g k g 体重的剂量混于饲料 中喂服，4h 达有效血浓度( 4 - - - 1 6g g m l ) 以0 1 和0 2 浓度的饮水给鸡饮服3 6h 亦能在血中达到以上水平。 氯霉素的药动学在不同动物间差异很大，给犬、猫、猪、山羊和马静脉注射2 2 m g k g 后其血浓度以马最高( 2 1 5r t g m l ) ，猫最低( 9 3r t g m l ) ，而犬( 1 2 4i _ t g m l ) ， 猪( 2 1j - t g m l ) ，山羊( 1 6 5 肛g m l ) 则介于其中。消除半衰期以马最短( 0 9h ) ，猫 最长( 5 1h ) ，而犬、猪、山羊则分别为4 2 、1 3 和2h 。氯霉素的血浆蛋白结合率在 血浓度为2 0i - t e , m l 时以山羊最低( 3 0 i 5 ，人最高( 4 6 5 ，而犬、猫、猪、马分别 为3 9 5 、3 7 7 、3 5 1 和3 0 4 。由于马静脉注射后氯霉素从体内消失迅速，故马 不适合静脉注射。 氯霉素在组织和体液中广泛分布，以肝、肾中浓度最高，依次为肺、脾、心肌、 肠和脑组织巴氯霉素易透过血脑屏障进入脑脊液，其浓度为血药浓度的2 0 - - - 5 0 ， 脑膜炎时可达4 5 8 9 。本品也可透过血胎盘屏障和血眼屏障进入胎畜循环和房水 中。还能分布至乳汁、唾液和滑膜液中。氯霉素大部分在肝脏与葡萄糖醛酸结合而失 活，小部分转变成氨基水解产物。大约有1 0 原药由肾小球过滤入尿中，仅少量随胆 汁排入肠内，部分被重吸收而呈现“肝肠循环 。 1 1 4 氯霉素的毒副作用 自1 9 4 9 年氯霉素应用于临床后，在一些感染性疾病，尤其是伤寒流行中取得良 好疗效，但也于1 9 5 0 年发现本品可造成严重致死性血液系统毒性。此后，有关这方 面的报道渐渐增多1 1 ，氯霉素的主要毒副作用是抑制造血机能【l o 1 2 1 5 l ，表现形式有 1 前言 以下几种： 1 1 4 1 对血液系统的影响 氯霉素对血液系统方面的毒性表现为与剂量有关、呈可逆性的骨髓抑制或少见的 与剂量无关、不可逆的再生障碍性贫血。 抑制骨髓造血机能 往往与氯霉素的血药浓度有关，血药浓度超过2 5i t e d m l 及长期应用时极易出现 与剂量有关的造血抑制。症状有二：一为可逆的各类血细胞减少，其中粒细胞首先下 降，这一反应与剂量和疗程有关。一旦发现，应及时停药，可以恢复；二是不可逆的 再生障碍性贫血，虽然少见，但死亡率高。 再生障碍性贫血 该毒副作用不可逆，与使用剂量和频率无关，但多发生于有明显骨髓抑制而未及 时停药的患者中。临床表现为皮肤粘膜淤点、淤斑、苍白、咽痛、黄疽、高热等，应 用氯霉素后再生障碍性贫血的发生率估计为1 ：4 0 0 0 0 ，一旦发生，则难逆转，死亡率 高达5 0 - - 7 0 ，少数可发展为粒细胞性白血病。此反应原因可能是某些人群存在遗 传性体质异常，其骨髓造血细胞有某种代谢缺陷，因而对氯霉素分子中硝基苯集团的 作用特别敏感。虽然再生障碍性贫血较少发生，但却是致命的。青霉素g 在人体引起 致命过敏反应的几率为1 ：6 7 0 0 0 ，但发生氯霉素再生障碍性贫血的几率却为 l ：3 0 0 0 0 。长期使用氯霉素，即使总剂量很小( 如1 0 0m g ) 也可能发生再生障碍性贫 血。已存在4 0d 内连续使用氯霉素眼膏( 8 2r a g ) 导致死亡的报道。 白血病 氯霉素引起的严重骨髓损害者中少数幸存者可能逐渐进展至粒细胞性白血病。可 能由于氯霉素促进了非整倍细胞系列的发育，最后发展成为白血病，以儿童或5 0 - 7 0 岁的老年患者中多见。亚洲曾是使用氯霉素较多的地区，据统计，每1 0 万人中，欧 洲有0 2 人患白血病，中国有两人，泰国3 7 人，南亚一些国家患病的更多。 1 1 4 2 “灰婴综合症 ( g r a yb a b ys y n d r o m e ) 1 9 5 9 年首次报道，此现象与剂量和疗程有关但不可逆，主要发生于早产儿及新生 儿，当给予，7 5 1 0 0m g ( k g d ) 的高剂量时出现腹部膨胀、呕吐、呼吸节律紊乱、体温 下降，皮肤呈灰色，因苍白和微循环障碍为突出的临床表现故而得名“灰婴综合症”， 死亡率约为4 0 ；偶尔亦可发生在低剂量治疗时。可能是由于他们的肝脏发育不全， 肾脏的排泄能力也较差，使氯霉素的代谢、解毒过程受限制，导致药物在体内蓄积。 因此，早产儿及出生两周以下新生儿应避免使用。成人过量也可能出现同样症状。 1 1 4 3 神经系统 氯霉素偶可引起视神经炎、球后视神经炎及视力障碍，并发展至视神经萎缩和失 明。 1 1 4 4 变态反应 氯霉素的变态反应极少，可表现为各种皮疹、药物热、血管神经性水肿等，直接 天津科技大学硕士学位论文 接触可发生基础性结膜炎。 1 1 4 5 其他 口服氯霉素可以引起消化道症状：食欲减退、恶心、腹泻、口角炎、口腔苦味等， 但胃肠道反应较少见。 1 1 5 氯霉素残留污染现状 氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。欧盟、美 国等均在法规中规定氯霉素残留限量标准为“零容许量”，日本2 0 0 6 年实施的肯定 列表制度也规定在食品中不得检出氯霉素，我国农业部已将氯霉素从2 0 0 0 年中 国兽药典中删除1 1 6 j ，此药重新进入安全评价体系，在动物性食品兽药残留规定 中规定可食部分不得检出，并且在出口的日常检测中，将其列为必检项目，一旦发现 超标，一律禁止出口。农业部公告第1 9 3 号( 2 0 0 2 - 4 - 2 7 ) 发布的食品动物禁用兽药 及其化合物清单中，氯霉素被列为禁用药1 1 7 】。近年来，氯霉素残留污染主要表现在 以下几个方面： 1 1 5 1 水产品方面 2 0 0 1 年初，奥地利“绿色和平 组织正在紧急对本国商场内所有的水产品进行“毒 物”检测。因为有消费者在食用当地“家乐福”超市出售的冻虾仁引起过敏反应。结 果发现德国雷斯蒂克( 对s n c ) 公司生产的部分虾仁产品含有违禁物质氯霉素。德国 雷p d s t i c 公司撤下公司所有在市场上出售的所有冻虾仁产品，连夜查验了所有来自 中国、印度和越南的进1 2 1 库存原料后证实，中国舟山出i z l 的冻虾仁中含有0 2 - - , 5r t g k g 的氯霉素。2 0 0 1 年8 月2 3 日，德新社披露：“德国和其它部分西欧国家市场发现产自 中国舟山地区的大虾含有氯霉素成份。 2 0 0 1 年1 1 月8 , - - 2 2 日，欧盟考察团对我国辽宁大连、江苏南京、山东潍坊、浙江 舟山和杭州等地的4 个检测实验室、1 个兽药批发市场和1 个兽药零售店、2 个蜜蜂 养殖场、2 个外贸出口养鸡场、1 个水产养殖场和1 个出口水产品加工厂进行了实地 考察。结果评估报告提出：中国在兽药安全使用监督、兽药残留监控方面没有法律规 定：残留监控计划执行不力；质量检测实验室的检测质量没有保证等。最终结论是“目 前中国无法向欧盟充分保证出口的动物源性食品不含有害兽药残留和其它有害物质 引。之后，欧盟仍不断查出我出1 2 1 冻虾被污染的案例，累计已达5 5 批，同时其他国 家又相继查出我国福建省出口的鳗鱼、江苏省出口的淡水小龙虾也存在氯霉素或其他 药物残留。 2 0 0 2 年1 月2 8 日，联合国粮农组织和世界卫生组织在摩洛哥的马尔喀什议会大 厅，当即欧盟官方在会上公布决议：“自1 月3 1 日起禁止从中国进口供人类消费或用 于动物饲料的动物源性产品，但肠衣及在海上捕捞、冷冻、最终包装并直接运抵共同 体境内的渔业产品( 甲壳类除外) 不在禁止进1 5 之列 【1 9 1 。 自欧盟宣布对中国出口的动物源性食品实行禁运后，在2 0 0 2 年1 月3 0 日前，从 1 前言 中国出1 3 的兔肉、鸭肉和鱼虾己陆续运抵荷兰鹿特丹港1 3 ，至2 0 0 2 年3 月7 日，共 到货物2 6 5 个集装箱，6 0 0 0 多吨产品，价值约1 5 0 0 万美元，约合人民币1 2 亿元。 按照欧盟有关法律，对检测不合格的中国货物实行就地销毁。 欧盟是我国第四大水产品出口市场，是我国远洋捕捞产品的两大主要出1 3 市场之 一。据不完全统计，2 0 0 1 年我国向欧盟出口的水产企业总数为9 5 家，2 0 0 2 年每个企 业因欧盟禁令所遭受的损失平均在3 0 0 5 0 0 万美元之间，9 5 家企业对欧盟水产品出口 贸易金额合计6 2 3 亿美元。由此可见，今年欧盟对我国出口到欧盟的动物源性产品实 行禁运，就意味着我国将在欧盟市场丢掉1 3 万吨的市场份额和造成6 亿多美元的经 济损失。且受损失最大的是我们水产的龙头骨干企业，这对于我国水产品出口无异于 伤筋动骨的伤害i l 9 1 。 我国对欧盟水产品出口贸易涉及近5 万人，涉及养殖渔( 农) 户1 0 万人以上。 这次欧盟禁令对于我国重点渔业地区的冲击尤为剧烈，给渔业产业结构调整、渔区稳 定带来一系列重大影响。 更令人担忧的是，由于欧盟的禁令，美国、日本等国已高度关注我国出口水产品 的质量，2 0 0 2 年1 月，美国f d a 也做出反应，对我国虾产品发出预警通报，并于近 日再次发文强调禁止在动物源性食品中使用氯霉素、磺胺类等1 1 种药物；2 0 0 2 年5 月2 4 日，美国路易斯安娜州农林部通过紧急法案，对中国进口的所有小龙虾和虾类 产品进行氯霉素检测；接着，美国佛罗里达州检出中国虾类含氯霉素并有可能效仿路 易斯安娜州的做法；2 0 0 2 年3 月，曰本厚生省宣布对我国动物产品实施严格检查，并 公布了1 1 种药物的残留限量。2 0 0 2 年1 到6 月，我国水产品对欧盟出口量、出口额 比去年同期分别下降7 0 8 和7 3 。 尽管我国已采取紧急的应对措施，此次事件，还是对所有中国产品的形象造成极 坏影响，氯霉素问题将影响所有食品采购商的购买决定，法国和德国已将中国的水产 品和其它冷冻食品从超市货架上取走，欧洲的采购者和客户对中国产品的需求将会被 印度、泰国、韩国、马来西亚等其它国家的产品所替代【2 叭。 2 0 0 6 年1 1 月1 7 日，上海市食品药品监督管理局召开新闻发布会，通报抽检“多 宝鱼 ( 学名大菱鲆) ，中氯霉素等多种禁用渔药残留，并提醒市民慎重购买和食用： 多宝鱼被扣上“毒鱼的帽子，价格从3 0 元斤跌到5 元斤曾经兴旺的多宝鱼产业一 度陷入绝境1 2 。 1 1 5 2 蜂产品方面 、 欧盟是我国蜂蜜传统出口市场，年进口蜂蜜1 5 万吨，其中，自我国进口3 _ 4 万吨， 占其进口蜂蜜总量的2 7 左右，据我国海关统计，2 0 0 1 年我对欧盟出口蜂蜜4 3 万吨， 占全球出口总量的4 1 。2 0 0 2 年2 月，英国卫生当局从货架中抽样检测蜂产品，1 6 个样品中被检出氯霉素残留的有1 0 个，检出率为6 2 5 ，被检出链霉素残留的有7 个，检出率为4 3 7 5 ，2 0 日，英国食品标准局发布公告，建议商店停售用中国蜂蜜 或掺有中国蜂蜜生产的产品【捌。这是继1 月2 5 日欧盟委员会有关机构全面禁止进口 一 天津科技大学硕士学位论文 中国动物源性食品后通过的又一项不利于我国产品出口的决议，同时严重影响到了中 国蜂蜜对日本、加拿大等国的出口。 自2 0 0 2 年起，欧盟以氯霉素超标为由，禁止进口中国蜂蜜。尽管2 0 0 4 年7 月欧 盟对中国解除了这一禁令，欧盟关于进口蜂蜜中氯霉素残留的检测标准更加苛刻：氯 霉素含量1 0 万吨中不得超过l 克。出口蜂蜜若再检出超标，生产企业将被列入“黑 名单 而被逐出欧盟市场，很多企业为此跃跃欲试又格外谨慎【2 2 1 。 加拿大食品安全管理部门在2 0 0 2 年初就曾因为对从中国进口的蜂蜜进行氯霉素 检测呈阳性，而警告( 后来解除) 消费者不要食用蜂蜜成分的烤制食品。2 0 0 3 年美国 s a r a l e e 公司一供应商所出售的蜂蜜被f d a 检测出含有微量的氯霉素，f d a 怀疑这些 蜂蜜原产于中国，而对含有氯霉素蜂蜜下禁令。2 0 0 5 年3 月，日本将我输日蜂王浆氯 霉素残留列入监督检查计划，日本规定蜂王浆中不允许检出氯霉素。 1 1 5 3 其他方面 2 0 0 2 年初，瑞士联邦经济部兽医局及联邦内政部卫生署鉴于各邦卫生检验单位抽 验出多件原产于中国的鸡肉含有过量残留的氯霉素，2 月2 7 日，联合宣布暂时禁止进 口原产于中国的鸡肉。2 0 0 2 年2 月份，德国黑森州发现中国的猪肠衣含有氯霉素；石 荷州两周前发现来自中国的蟹肉含有氯霉素。 因此，为了保障人民的健康及扩大食品的贸易往来，建立灵敏度高、特异性强、 简便快速的动物性食品种氯霉素残留的检测技术是非常必要的。 1 1 6 氯霉素残留的检测技术 对于氯霉素残留，由于存在多种检测方法，因此各种方法的检出限问题已成为关 注的焦点。发达国家对检出限的要求越来越严格，欧盟由原来的1 0p g l ( g 改为1 斗g k g ， 继而又降至o 1 “g k g 【2 3 ，冽；美国f d a 规定的检出限也由原来的5 g k g 改为1 弘g k g ， 即将降为o 3 “g l ( g ，且目前正在研究应用更为灵敏的方法，可使检出限值达0 1u e , k g 。 氯霉素残留检测方法的检出限已在国际贸易合作中成为新的技术性壁垒【2 5 1 。 氯霉素的检测方法分为微生物法、免疫分析方法、色谱法和其他方法。 1 1 6 1 微生物法 棉签法 棉签法( s w a bt e s to np r e m i s e s ，s t o p ) ，又称现场拭子法，是检测动物体中抗生素 残留的现场试验方法。本法自1 9 7 9 年由美国农业部食品安全和检验署研究开发出以 后，世界各国都普遍采用，目前在加拿大和美国已经有药盒形式的商品出售。【2 6 】 该方法是用棉签( 拭子) 采取动物体内的组织液，然后将其放置在涂满枯草杆菌 的培养基中保温过夜，样品中如有残留抗生素残留，则对培养基中的细菌产生抑菌圈， 根据抑菌圈的有无及大小来判定结果，采用不同的试验菌，可检测不同的抗生素残留 p ”。如果该动物仅用氯霉素进行过治疗，则认为该组织中存在氯霉素残留。此法费用 少，在几分钟内即可完成取样操作，1 的1 8h 即可获得结果，是简便易行而又有一定 1 前言 准确性的检测方法，比较适合基层现场筛选检测。但是该检测法灵敏度较差，检出限 较高，多在“眺级，特异性差，一般抗生素类药物都有此类反应，而且不能定量【2 8 ，2 9 1 。 梅先芝等1 3 川用该法对鲤鱼体内氯霉素残留进行了研究。他采用枯草芽孢杆菌菌 株配制芽孢悬浮液。将切碎鱼肉与不同浓度氯霉素标准液混合，用上述方法检测是否 形成抑菌圈，结果表明最低检出限为1 0 0 斗g 儋。 杯碟法 杯碟法( c y l i n d e rp l a t em e t h o d ，c p m ) 指样品经处理后，注入牛津杯中，与含菌 液的检定平板贴合，培养后，根据抑菌圈的有无及大小判定结果。微生物法易受组织 中其他抗生素的影响，特异性低，灵敏度也不高，但操作简便，样品用量少，预处理 简单，在基层大规模筛选工作中有很大的应用价值【3 1 1 。 焦彦朝【3 2 】用此法研究了鲤鱼体内氯霉素残留。在样品处理过程中分别加入青霉+ 素、土霉素以消除干扰影响。研究表明，此法检出限为0 2 5 g ；氯霉素浓度在 0 2 5 1 0 0 g 时回收率范围在6 6 - - 6 9 2 之间，平均回收率为6 7 5 ；而且排除了青 霉素、土霉素的干扰。 1 9 9 1 年日本学者神保胜彦【3 3 j 对微生物法进行了改进，灵敏度达到1 0 “g k g ，但仍 高于大多数国家的氯霉素最高残留限量，因此该法适用于动物性食品中氯霉素残留的 现场基层初筛。 这种方法与棉签法相比，灵敏度高，能够排除一定的干扰，但是，要进一步提高 灵敏度很困难。 其他方法 其它微生物法还包括纸片法、琼脂扩散法、氯化三苯四氯唑( t t c ) 法等，这些 方法都存在灵敏度低的缺点。 微生物法易受组织中其它抗生素的影响，特异性低，灵敏度也不高，但操作简便， 样品用量少，预处理简单，在基层大规模筛选工作中有很大的应用价值。 1 1 6 2 免疫分析方法 免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础，对新型动物性食 品中氯霉素残留进行( 半) 定量的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互 补的静电、氢键、范德华力和疏水区域的综合作用【3 4 l ，非常适合于复杂基质中痕量组 分的分离或检测。包括酶联免疫吸附测定法( e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y , e l i s a ) 、放射免疫测定法( r a d i o i m m u n o a s s a y , r t a ) 、免疫传感器法等【3 引。 酶联免疫吸附测定法 酶联免疫吸附测定的基本原理是：将酶与抗原或抗体用交联剂结合起来，此种酶 标记抗原或抗体与待测样品中相应抗体或抗原发生特异反应，并牢固结合，在加入相 应的酶的底物时，底物被酶催化生成呈色产物，可根据呈色物的有无和呈色深浅作定 性或定量观察。由于此技术是建立在抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上，故 而该技术具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好等特点，而且，可与其他技术偶联 天津科技大学硕士学位论文 而衍生出适用范围更广的新方法。， 用于氯霉素分析的所有e l i s a 形式包括3 种成份：特异性抗体、半抗原标记物和 目标分析物( 氯霉素) 。而制各出具有高特异性的抗体是整个e l i s a 分析的关键。 e l i s a 的主要技术类型有双抗体夹心法、竞争法、捕获法等。 i 双抗体夹心法 双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇a 和b 分 别与固相载体上的抗体a 和酶标记抗体b 结合，形成抗体a 待测抗原酶标抗体b 复 合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。 i i 竞争法 竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原( 抗体) 与待测的 非标记抗原( 抗体) 竞争性的与固相载体上的限量抗体( 抗原) 结合，这是直接竞争 反应( d c e l i s a ) ；而间接竞争( i c e l i s a ) 则是先包被标记抗原，再加入抗原和抗 体，使标记抗原和游离抗原竞争与抗体相结合，最后加入酶标二抗，复合物的显色程 度与待测物含量成反比。竞争e l i s a 是检测氯霉素最常用的形式1 3 5 瑚】。