分子生物学原理RNA的生物合成.ppt

2019/12/7,分子生物学原理,第十一章,RNA的生物合成（转录）RNABiosynthesis,Transcription,2019/12/7,分子生物学原理,转录,转录(transcription),生物体以DNA为模板合成RNA的过程。也就是把DNA的碱基序列抄录成RNA的碱基序列。,2019/12/7,分子生物学原理,复制与转录的异同点,相同点：不同点:复制转录以DNA作模板双链复制模板链需4种NTPdNTPNTP碱基配对A=TA=U,T=A合成方向53依赖DNA的聚合酶DDDPDDRP多聚核苷酸大分子半保留式子代mRNA、tRNA、rRNA,2019/12/7,分子生物学原理,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子,2019/12/7,分子生物学原理,模板和酶TemplatesandEnzymes,第一节,2019/12/7,分子生物学原理,一、转录模板,结构基因：strucuralgene能转录出mRNA然后指导蛋白质生成的部分。模板链：templatestrand可作为模板转录成RNA的一股链。也称作有意义链或Watson链。编码链：codingstrand相对于模板链的另一股链。也称为反义链或Crick链。,2019/12/7,分子生物学原理,模板:转录、翻译的序列比较,5GCATTAGCTAGCTACTAGC3DNA3cgtaatcgatcgatgatcg5双链转录5GCAUUAGCUAGCUACUAGC3mRNA翻译NAlaLeuAlaSerTryC肽链,2019/12/7,分子生物学原理,转录的不对称性,不对称转录：asymmetrictranscriptionDNA双链对一个基因而言，一股可转录，另一股不转录。模板链与编码链相对而言,2019/12/7,分子生物学原理,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,2019/12/7,分子生物学原理,二、RNA聚合酶,转录酶：依赖DNA的RNA聚合酶DNAdependentRNApolymeraseDDRP,2019/12/7,分子生物学原理,原核生物的RNA聚合酶,大肠杆菌的RNA聚合酶：2其中2称为核心酶：只有转录功能亚基：辨别转录起始点+2=全酶受利福平或利福霉素（结核菌药物）的特异性抑制。,2019/12/7,分子生物学原理,核心酶(coreenzyme),全酶(holoenzyme),2019/12/7,分子生物学原理,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,2019/12/7,分子生物学原理,原核生物的RNA聚合酶,2019/12/7,分子生物学原理,真核生物的RNA聚合酶,RNA聚合酶II可认为是真核生物中最重要的RNA聚合酶,2019/12/7,分子生物学原理,三、模板与酶的辨认结合,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。,2019/12/7,分子生物学原理,三、模板与酶的辨认结合,启动区的保守序列原核生物有两个元件-35bp的辨认位点：5-TTGACA-10bp的Pribnow盒:5-TATAATPu真核生物有多个元件(如-30的Hogness或TATA盒)。,2019/12/7,分子生物学原理,RNA聚合酶保护法,目录,2019/12/7,分子生物学原理,开始转录,TTGACAAACTGT,-35区,(Pribnowbox),TATAATPuATATTAPy,-10区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognitionsite),2019/12/7,分子生物学原理,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,2019/12/7,分子生物学原理,转录过程TheProcessofTranscription,第二节,2019/12/7,分子生物学原理,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、原核生物的转录过程,2019/12/7,分子生物学原理,2.DNA双链解开,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi,转录起始过程,2019/12/7,分子生物学原理,转录起始中的事件,解链形成转录空泡为首的为三磷酸GTP或ATP转录起始复合物(RNA-聚合酶全酶-DNA-pppGpN-OH)第一个磷酯键形成后，亚基从转录起始复合物中脱落下来。RNA聚合酶沿DNA链向前移动。,2019/12/7,分子生物学原理,转录空泡(transcriptionbubble)：,RNA-pol（核心酶）DNARNA,2019/12/7,分子生物学原理,（二）转录延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,2019/12/7,分子生物学原理,转录的延长,转录的延长是以5到3的方向进行的。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi以G=C、A=U、T=A碱基配对。转录完成部分的DNA重新形成双链。较长的RNA链上有核糖体结合，说明在某些情况下，转录的同时，翻译已经开始进行了。,2019/12/7,分子生物学原理,2019/12/7,分子生物学原理,转录的过程,2019/12/7,分子生物学原理,转录的延长,2019/12/7,分子生物学原理,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,2019/12/7,分子生物学原理,（三）转录的终止,转录终止：是RNA聚合酶在模板上的某一位置停顿，RNA链从转录复合物上脱离出来。分为依赖Rho因子的转录终止和不依赖Rho因子的转录终止。,2019/12/7,分子生物学原理,1、依赖Rho因子的转录终止,Rho因子的左右是使RNA-DNA杂化双链的短链变性，从而有利于转录产物从转录复合物中释放出来。,2019/12/7,分子生物学原理,ATP,1.依赖Rho因子的转录终止,2019/12/7,分子生物学原理,2.非依赖Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,2019/12/7,分子生物学原理,2、非依赖Rho因子的转录终止,2019/12/7,分子生物学原理,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT.3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,2019/12/7,分子生物学原理,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,2019/12/7,分子生物学原理,不依赖Rho因子的转录终止模式,RNA链出现茎-环结构，促进转录的终止。1.这样的结构改变RNA聚合酶的构象，使酶不再向下移动。2.DNA和RNA各自形成自己的局部双链，使杂化链更加不稳定，以致转录复合物趋于解体。接着的一串寡聚U，则更是促进RNA新链从模板上脱落的促进因素。,2019/12/7,分子生物学原理,二、真核生物的转录起始,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,2019/12/7,分子生物学原理,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-actingelement),1.转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2019/12/7,分子生物学原理,2.转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)。,2019/12/7,分子生物学原理,参与RNA-pol转录的TF,2019/12/7,分子生物学原理,3.转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,2019/12/7,分子生物学原理,TFF,A,B,由RNA-Pol催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,2019/12/7,分子生物学原理,4.模板理论(piecingtheory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,2019/12/7,分子生物学原理,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,2019/12/7,分子生物学原理,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,2019/12/7,分子生物学原理,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAAGTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA3mRNA,（三）转录终止,和转录后修饰密切相关。,2019/12/7,分子生物学原理,真核生物转录终止的特点,真核生物mRNA带有聚腺苷酸尾巴的结构，这是转录之后加上的。在模板链读码框架的3端之后，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列，这些序列称为转录终止的修饰点。,2019/12/7,分子生物学原理,转录与复制的相似之处,都以DNA为模板需要核苷酸作原料，从5到3延长；生成磷酸二酯键以连接核苷酸都遵从碱基配对规律都需要依赖DNA的聚合酶产物都是很长的多核苷酸,2019/12/7,分子生物学原理,转录和复制的区别,2019/12/7,分子生物学原理,真核生物的转录后修饰Post-transcriptionalModification,第三节,2019/12/7,分子生物学原理,转录后的修饰,转录生成的RNA，称为初级转录产物。无论在真核生物或原核生物中，初级转录产物都经过一定程度的修饰加工，才能表现其功能。,2019/12/7,分子生物学原理,几种主要的修饰方式,1.剪接(splicing),2.剪切(cleavage),3.修饰(modification),4.添加(addition),2019/12/7,分子生物学原理,一、真核生物mRNA的转录后加工,（一）首、尾的修饰,5端形成帽子结构(m7GpppGp)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail),2019/12/7,分子生物学原理,帽子结构,2019/12/7,分子生物学原理,5pppGp,帽子结构的生成,2019/12/7,分子生物学原理,真核生物mRNA的转录后加工,5和3首尾的修饰剪接,2019/12/7,分子生物学原理,5加帽,转录产物的第一个核苷酸pppG水解成5-ppG或5-pG与另一个三磷酸鸟苷生成三磷酸双鸟苷第二个鸟嘌呤被甲基化加帽出现在hnRNA中，说明可能在细胞核中完成，并在剪接之前。,2019/12/7,分子生物学原理,3端加上聚腺苷酸尾巴,真核生物mRNA中polyA的出现是不依赖于DNA模板的。加入polyA之前，先由核酸外切酶切去3末端一些过剩的核苷酸，然后加入polyA。3端修饰也是在细胞核中，在剪接之前进行的。PolyA的有无与长短，是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身的稳定性。,2019/12/7,分子生物学原理,3端修饰示意图,2019/12/7,分子生物学原理,（二）mRNA的剪接,1.hnRNA和snRNA,核内的初级mRNA称为杂化核RNA(hetero-nuclearRNA,hnRNA)snRNA(smallnuclearRNA),2019/12/7,分子生物学原理,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splitegene),编码区A、B、C、D,2019/12/7,分子生物学原理,2.外显子(exon)和内含子(intron),外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,2019/12/7,分子生物学原理,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,2019/12/7,分子生物学原理,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,2019/12/7,分子生物学原理,真核细胞mRNA的剪接,DNA模板与hnRNA是完全配对的，而成熟的mRNA与hnRNA或DNA杂交都只是部分配对。因此真核生物的基因有断裂性。,2019/12/7,分子生物学原理,断裂基因,真核生物的结构基因，由若干个编码区被非编码区相互间隔开，但又连续镶嵌而成，因此真核生物的基因称为断裂基因。外显子代表了基因上编码氨基酸的核苷酸序列。内含子表示相应的非编码序列。原核生物结构基因是连续的编码序列，不是断裂基因。,2019/12/7,分子生物学原理,内含子的种类,线粒体，叶绿体转录初级rRNA基因线粒体，叶绿体的mRNA形成套索状结构的剪接，由SnRNA和核内蛋白形成的核小核糖核酸蛋白来完成。tRNA基因。,2019/12/7,分子生物学原理,3.内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA；III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子；IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,2019/12/7,分子生物学原理,4.mRNA的剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为并接体,2019/12/7,分子生物学原理,2019/12/7,分子生物学原理,pG-OH(ppG-OH,pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应(twicetransesterification),2019/12/7,分子生物学原理,RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differentialRNAprocessing)。,5.mRNA的编辑(mRNAediting),2019/12/7,分子生物学原理,内含子的功能,内含子有利于物种的进化选择调节功能,2019/12/7,分子生物学原理,tRNA的转录后加工,初级产物中有5端的16个碱基和反密码子后的14个碱基需要去除。,2019/12/7,分子生物学原理,二、tRNA的转录后加工,tRNA前体,2019/12/7,分子生物学原理,2019/12/7,分子生物学原理,tRNA核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,2019/12/7,分子生物学原理,碱基修饰,2019/12/7,分子生物学原理