（分析化学专业论文）抑菌作用及污染物生物修复、检测的电分析技术研究.pdf

硕十学位论文 摘要 压电体声波传感技术因具有灵敏度高、响应谱广、易于实现数字化、结构简 单和成本低廉等独特优点而被广泛应用于分析化学、生物化学、环境监测、生命 科学及分子生物学等众多领域。电化学方法，尤其是伏安法，由于具有使用费用 低、易于操作、选择性良好、灵敏度高等优点，已广泛用于环境监测分析。本文 利用电分析技术对溶液中物质高灵敏度的响应，对环境中有毒物质的微生物治理 和检测展开了以下几个方面的研究： 1 采用串连式压电传感技术监测了铜绿假单胞菌( pa e r u g i n o s a ) 的生长情况， 并首次将其结合高效液相色谱测定乐果浓度，研究了铜绿假单胞菌降解乐果的 动力学过程，并建立了一个反映微生物降解农药的动力学模型。 2 基于铜绿假单胞菌以葡萄糖作为生长碳源，能还原六价铬的特性，考察了中性 环境中柠檬酸根存在条件下，铜绿假单胞菌与柠檬酸共同还原六价铬的动力学 情况。 3 根据动态电阻与溶液粘密度的关系，采用压电阻抗声波技术考察了乳链球菌素 n i s i n 对金黄色葡萄球菌的抑制动力学过程，通过考察n i s i n 用量与生长动力学 参数似、t m 和a ) 之间的关系，建立了一个反映n i s i n 抑制金黄色葡萄球菌的 阻抗响应模型，并通过n i s i n 浓度与最大阻抗响应值之间的关系，对未知样品 n i s i n 的效价进行了测定。 4 根据乐果在碱性环境中水解生成巯基化合物的原理，利用纳米金放大电化学信 号，用金电极在k o h 溶液中直接测定了乐果。电化学沉积法用于在电极表面 制备颗粒小且分布均匀的纳米金来提高响应的灵敏度，循环伏安法和电化学交 流阻抗法表征了该修饰电极的电化学行为。 关键词：串连式压电传感；降解；铜绿假单胞菌；乳酸链球菌素；乐果；纳米金 抑菌作用及污染物生物修复、柃冽的i 乜分析技术研究 a bs t r a c t p i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a lh a sb e e na p p l i e dt on u m e r o u sf i e l d ss u c ha s a n a l y t i c a lc h e m i s t r y ，b i o c h e m i s t r y , e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，l i f e s c i e n c ea n d m o l e c u l a r b i o l o g yb e c a u s e o fi t s a d v a n t a g e s s u c ha s h i g hs e n s i t i v i t y , b r o a d s e n s i n g - s p e c t r u m ，s i m p l ec o n s t r u c t i o na n dl o wc o s t t h ee l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e ， e s p e c i a l l yv o l t a m m e t r y ，h a sb e e nu s e df o re n v i r o n m e n t a la n a l y s i sd u et ot h e i rh i g h s e n s i t i v i t y ，e a s eo fa p p l i c a t i o n ，l o wc o s t ，h i g hs e l e c t i v i t ya n da c c u r a c y b a s e do nt h e h i g hs e n s i t i v i t yr e s p o n s eo fe l e c t r o a n a l y t i c a lt e c h n i q u e st ot h es u b s t a n c eo fs o l u t i o n ， t h i st h e s i sp r e s e n t st h e o r e t i c a la n da p p l i e ds t u d i e sf o rb i o m e d i a t i o na n dd e t e c t i o no f t o x i cs u b s t a n c ei nt h ee n v i r o n m e n ta sf o l l o w s ： 1 t h eg r o w t hc o n d i t i o no f p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aw a sm o n i t o r e db yt h es e n s i t i v e r e s p o n s eo fas e r i e sp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l ( s p q c ) t ot h ec o n d u c t i v i t yo f s o l u t i o n c o m b i n e dw i t ht h ed i m e t h o a t ec o n c e n t r a t i o nd e t e c t e db yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，t h ed y n a m i cp r o c e s so fd i m e t h o a t e d e g r a d a t e db yp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aw a ss t u d i e d m e a n t i m e ，ac o m b i n e ds y s t e m r e s p o n s em o d e l ，f o rm i c r o o r g a n i s mr e d u c t i o nk i n e t i c sa tp e s t i c i d ew a sd e r i v e da n d p r o v e db a s e do nt h en o v e ls y s t e m 2 b a s e do nt h ec h a r a c t e r i s t i c so fp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ar e d u c t i o nh e x a v a l e c h r o m i u ms e r v e dg l u c o s ea sc a r b o ns o u r c e ，w ef i r s t l yi n s p e c t e dp a e r u g i n o s a r e d u c t i o nh e x a v a l ec h r o m i u mc o m m o ni nt h ec o n d i t i o n so fc i t r a t ei nn e u t r a l 3 a c c o r d i n gt ot h ec h a n g i n go fd e n s i t y v i s c o s i t yi nt h es o l u t i o nd u r i n gt h eg r o w t ho f b a c t e r i a ，t h ei n h i b i t o r yc h a r a c t e r i s t i c so fn i s i nt os t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw a s s t u d i e dw i t hp i e z o e l e c t r i ci m p e d a n c ea n a l y s i st e c h n i q u e b a s e do nt h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h ea m o u n to fn i s i na n dg r o w t hk i n e t i cp a r a m e t e r s 叫，m ，五) ，an e w i m p e d a n c er e s p o n s e m o d e lr e f l e c t i n gt h i si n h i b i t i o ne f f e c to fn i s i nt o w a r d s s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw a sd e r i v e df o rt h ef i r s tt i m e a n dt h ep o t e n c yo fn i s i n u n k n o w nw a sd e t e r m i n e db yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec o n c e n t r a t i o no fn i s i n a n dt h em a x i m u mv a l u eo fi m p e d a n c er e s p o n s e 4 an e we l e c t r o c h e m i s t r ym e t h o df o rd e t e r m i n e dd i m e t h o a t ew a sp r o p o s e di nt h i s p a p e r a c c o r d i n gt ot h ep r i n c i p l eo fd i m e t h o a t eh y d r o l y s i sg e n e r a t e ds u l f h y d r y li n a l k a l i n ee n v i r o n m e n t ，d i m e t h o a t ew a sd e t e r m i n e di nk o ha tg o l de l e c t r o d e su s i n g g o l dn a n o p a r t i c l ee n l a r g i n g e l e c t r o c h e m i c a l s i g n a l s t h e e l e c t r o c h e m i c a l d e p o s i t i o nm e t h o dw a se m p l o y e dt oo b t a i ns m a l l s i z e da n dd i s p e r s e du n i f o r m l y i i i 硕上学位论文 g o l dn a n o p a r t i c l e s0 nt h eg o l de l e c t r o d es u r f a c ew i t ht h ea i mo fa l li m p r o v e d a n a l y t i c a lp e r f o r m a n c e c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e s p e c t r o s c o p y ( e i s ) w e r eu s e d t oe v a l u a t et h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro ft h e m o d i f i e de l e c t r o d e s k e yw o r d s ：as e r i e sp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l ( s p q c ) ；d e g r a d a t i o n ；p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ；n i s i n ；g o l dn a n o p a r t i c l e s i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师指导下独立研究所取得的科研成 果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其它人或集体已经 发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：f q僵 日期：触睁罗月扩日 ， 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和接阅。本 人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩影或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 作者签名：侗 导师签名： 1 保密口，在年解密后使用本授权书。 2 不保密 ( 请在以上相应方框内打“，) l 覆 硕十学位论文 第1 章绪论 近年来随着化学工业的发展和农药的大量使用导致自然环境中某些水体、土 壤、大气和生物体中有机污染物超过法定限量。另一方面随着人们环境意识的提 高，对环境中有机污染物的控制越来越严格，要求检测技术更加快速方便、灵敏 可靠【1 】，对这些有毒物质的修复的也提出了新的要求。 压电化学与生物传感是一门新兴的分支科学。它利用以压电材料为基底的声 波传感器件在振荡过程中与周边环境的相互作用，由器件超高频声波的声电阻抗 谱、频谱或相位等参量变化来对包括质量、粘弹性、导纳、介电或流变特性、离 子溶剂传输等在内的环境介质的物理、化学性能作出相关应答，并转换为传感检 测信号，获得有关目标组分或体系的一维或多维信息，通过对信息进行解析以求 得到全面、动态、实时或在位的描述，从而用于化学、生物学、药学、临床医学 和环境科学等领域的传感检测【2 j 。近年来，压电化学在生物体系和环境体系的分析 表征以及生物和微生物过程的监测表征等方面，显示出了许多优势【3 6 1 ，已发展成 为传感器技术研究中最为活跃的领域之一。 结合论文的研究方向，本章就微生物在环境方面的应用、电化学方法测定微 生物的研究进展、压电生物传感器、农药检测方法的研究进展进行了简要综述， 并提出了本文的基本构思。 1 1 微生物在环境方面的应用 1 1 1 微生物对污染环境的废弃物的生物处理 生物处理( b i o t r e a t m e n t ) 也叫生化处理，是指利用处理系统中的生物，特别 是微生物的代谢活动以及各种特性来处理各种废弃物的过程。生物技术在处理环 境污染物方面具有速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和以及无二次 污染等显著优点，为从根本上解决环境问题提供了希望，它区别于其它技术的最 根本特点是消除污染物而不是分离转移污染物。 ( 1 ) 城市垃圾生物处理技术垃圾堆肥是较原始的固体垃圾生物处理方法， 主要是利用垃圾中原本带有的微生物进行自然发酵，但所需的处理时间长，处理 量小，发酵过程不易控制。发展的新的城市垃圾生物处理工艺是引入具有特定功 能的微生物( 主要是一些能高效降解有机物质，如纤维素、脂肪、蛋白质的微生 物) 进行好氧处理或厌氧发酵，加速发酵过程，同时还可以收集所产生的沼气【。 经过充分发酵后的垃圾是一种很好的农业肥料。 ( 2 ) 污水生物处理技术在废水排放到环境中之前的处理，目前普遍使用生 抑菌作用及污染物生物修复、衿测的电分析技术研究 物法或生物法与其它方法结合，其基本原理都是利用处理系统中的各种微生物群 落的代谢作用，以去除污水中的污染物。根据处理系统中微生物所处的状况，则 可以分为：悬浮细胞法【引、活性污泥法【9 1 、生物膜法等【10 1 。目前最普遍使用的是活 性污泥法，效率较好的是生物膜法。 1 1 2 微生物对环境污染物的生物修复 生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) ，也称生物整治、生物恢复、生态修复或生态恢 复，是指利用处理系统中的生物，主要是微生物的代谢活动来减少污染现场污染 物的浓度或使其无害化的过程。 ( 1 ) 对重金属离子的氧化还原作用很多微生物可以通过氧化作用或还原作 用( 多数情况) 把重金属从毒性较高的价态转变成为毒性较低的价态，从而解除 了重金属的毒性。例如对汞的抗性即是如此，自然界中有很多微生物( 大肠杆菌、 假单胞菌、芽孢杆菌等等) 可以把高毒性的h 9 2 + 还原成为低毒的h 酽，形成沉积或 挥发到大气中【1 1 1 。另外，自然界还有些微生物( 大肠杆菌、铜绿假单胞菌等) 可 以将高毒的c r 6 + 还原成为低毒的c r 3 + ，从而达到解毒的作用【1 2 , 1 3 】。 ( 2 ) 对重金属离子的吸附作用在细胞外产生可以结合( 包括细胞表面吸附) 有毒重金属离子的结合物，从而减少环境中毒性重金属的浓度，达到解毒的目的。 如n c r a s s a 的抗铜作用即是如此，它可以分泌能结合铜离子的蛋白质，从而降低 了铜离子的有效浓度【l4 1 。很多微生物的细胞表面具有特殊的结构，可以吸附重金 属离子，从而达到减少溶液中重金属离子的浓度。有些b a c i l l u ss u b t i l i s 可以吸附 很多重金属( 如铅、金、银、镍、铀等) 或其它离子【l5 1 ，吸附量甚至可达到细胞 干重的9 0 。 ( 3 ) 对生物外源性物质的脱卤化作用此类化合物的典型代表有多氯酚 ( p c p ) 和多氯联苯( p c b ) 类化合物，它们被广泛用作防腐剂、杀虫剂及合成高 分子材料的化工原料。它们都很难被降解，即具有很高的生物稳定性。尽管如此， 微生物学家还是找到了许多可以降解它们的微生物。如黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u ms p ) 可以降解五氯酚f 16 1 ，不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rs p ) 可以降解p c b 1 7 】。 ( 4 ) 对生物外源性物质的还原作用将生物外源性物质上的取代基，特别是 硝基，进行还原； ( 5 ) 对生物外源性物质的水合反应，如对有机氰的水合反应，形成无毒的 含氮有机化合物。 1 1 3 微生物应用于工农业生产的研究 ( 1 ) 可生物降解塑料p h a ( 聚p 羟基烷酸酯) 分子量大，具有良好的柔韧性 和抗张性，并具有良好的可塑性，在实际应用上无异于人工塑料。1 9 2 5 年法国巴 斯德研究所的一位研究人员从巨大芽孢杆菌中发现了聚d 羟基丁酸酯( p h b ) 颗粒， 硕一t 学位论文 是p h a 中的一种，它被微生物降解掉，被人们称为“生物可降解塑料”i l 引。用细菌 生产的聚b 羟基丁酸酯除了替代现有的塑料制品外，还可以用来生产高弹性的无 纺布。聚d 羟基丁酸酯无毒性，高纯度的产品可用来做伤口的缝合线及骨骼固定 绷带，当用这种缝合线缝合伤口后也用不着拆线，它可以在人体内自行被分解吸 收。 ( 2 ) 生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌( b t ) 的细胞内存在着有毒的蛋白质被昆 虫吞食后能中毒死亡，这种活细胞对环境无毒无害，而且在动物的胃肠道内，酸 性环境下蛋白晶体不能溶解，对人畜无毒，是一种高效安全的生物杀虫。苏云金 芽孢杆菌制成的b t 生物杀虫剂于1 9 3 8 年以商品制剂s p o r e i n e 在法国问世，以后相 继发现了对鞘翅目，螨类、同翅目、膜翅目、直翅目昆虫，动植物寄生线虫，鞭 毛虫，变形虫，扁虫中的吸虫、绦虫有致病性的b t 菌株【l 9 1 。 1 2 电化学方法测定微生物的研究进展 微生物检测在i 临床医学、食品卫生检测、生物过程控制与环境监测等领域有 广泛地应用需求。相关的检测方法种类很多，如：平板培养法、显微镜直接观察 法；用压电晶体、阻抗仪、粘度法、表面荧光过滤技术、生物发光法、免疫测定 法、反射测量法、拉曼光谱法、微量量热法、超声波技术等非生物电化学方法【2 0 2 5 】； 质粒指纹图谱、dna 探针技术、蛋白质、脂类衍生物( 生物化学方法) 【2 6 , 2 7 】、细 胞壁成分组分法【28 】等细胞成分的方法。 传统的微生物检测通常在大型实验室集中进行，一般需要较长时间，并要求 较高的专业技能，而且操作过程烦琐。在现场和其它环境下的检测，要求仪器具 有快速、自动等优点，而灵敏度也应满足实际需求。快速检测系统的核心部件通 常称为生物传感器，它一般包括生物识别元件( 如接收器、核酸或抗体) 和换能器。 从信号转换上，生物传感器分四类：光学、质量、电化学、热传感器。从广义上 还可分为：直接检测与间接检测( 标记) ，前者实时检测生物反应引起的物理变化， 后者检测生物化学反应的生成物。电化学方法作为一种间接检测手段，通常能在 2 4 h 内得出结果，有些不需监测生长的技术更可在半小时内完成测量，节省了大 量时间与精力，其成本一般比光学、生物技术低，并且结果分析可由计算机自动 完成，具体有非常广阔的实际应用前景，因此这里主要讨论电化学的微生物检测 方法。 1 2 1 阻抗法与电导法 阻抗技术是电化学研究方法之一，和微生物检测结合，已经形成了一个独立 的研究领域。微生物在培养过程中，生理代谢作用使培养基的电惰性物质( 如碳水 化合物、类脂、蛋白质) 转化为电活性物质，脂肪代谢为重碳酸盐，大分子物质转 化为小分子物质。伴随这些变化，若将一对电极置入培养基中，测得的交流阻抗 抑菌作用及污染物生物修复、检测的电分析技术研究 随之发生变化，上述过程通常包括阻抗下降，电导、电容增加，因此阻抗、电导 或电容测量仅仅是不同的技术手段，其内在原理相通。 现代阻抗法检测微生物的研究从2 0 世纪7 0 年代开始受到关注，u r 与b r o w n 2 9 】 最先报道了通过监测阻抗变化来检测细菌生长及对抗生素的敏感性；2 0 世纪8 0 年 代前后有许多应用b a c t o m e t e r 微生物自动检测仪的研究，这些报道拓展了阻抗技术 的应用领域，现在，阻抗法主要应用到临床微生物学( 尿样30 1 、血样1 3 1 】) 、环境微 生物学( 工业废水【3 2 1 ) 、食品卫生学( 冷冻蔬菜【3 3 1 、肉类【3 4 1 、果汁饮料35 1 、奶制品 【3 6 】等1 。 此外，也有许多利用交流电导率测定微生物总数的研究【3 7 , 3 8 1 。当培养基电导 较低时，随细菌生长电导变化明显，适合作电导分析；当培养基电导较高时，电 导变化很小，而相应的极化电容变化较大，因此应借助电容分析监测细菌生长【3 6 1 。 有研究3 9 a 0 发现双电层电容比培养基电导变化更明显，检测时间更短，且和平板 计数法测定的结果相关系数更高。 1 2 2 伏安法 伏安法是电势控制法的一种，这类方法的电极电势强制依附于已知程序，电 势控制在恒定值或者按预先确定的方式随时间变化，测量电流作为时间或电势的 函数。 n a k a m u r a 等【4 l 】使用平面热解石墨电极( b p g ) ，并用多孔硝化纤维膜过滤尿样 中的e c o l i ，在测得的伏安图中，峰电流值与初始细菌浓度成正比，系统的检测范 围在5 1 0 2 5 1 0 5c e l l s m l 间；r u a n 等【4 2 】用一般的三电极体系测量氧阴极峰电 流出现时间，以计算沙门氏菌初始浓度，在细菌生长的某个阶段，耗氧加速，伏 安曲线急剧下降，这时测得的电流与培养时间的关系曲线定义为耗氧曲线，从耗 氧曲线得到的检测时间与培养基中细菌初始数量成反比，响应在( 1 2 ) 1 0 0 一( 1 2 ) 1 0 6c e l l s m l 内呈线性关系；b e r r e t t o n i 等1 4 3 】将电化学网状玻碳( r v c ) 超微电极 阵列与化学计量学方法结合用于检测葡萄球菌，在测得的常规脉冲伏安图( n p v ) 中，不存在与微生物总数有直接线性关系的特征，因此，他们用一种变量选择算 法( i p w ) 先筛选出6 个有效电势，并计算得到5 个潜在变量，然后将微生物总数作 为因变量，用偏最小二乘法做回归分析与建模，使用该技术的检测底限为l 一2 c e l l s m l 。 1 2 3 电位电流分析法 电位分析和电流分析是将电极和电位计( 电流计) 连接，通过氧化还原酶反应和 适当的媒介，将微生物的代谢氧化还原反应转换成可量化的电信号，随着电解池 中氧化还原反应的进行，电极上出现表征电解池变化或特性的信号，然后记录工 作电极上的电位( 电流) 。此种方法的关键是提高检测的灵敏度，以及从电信号中提 硕士学位论文 取出和待测微生物指标呈良好线性关系的特征。 w i l k i n s 等【4 4 j 最初用铂电极与标准甘汞电极检测产氢细菌，当细菌生长达到10 6 c e l l s m l 时，氢分子在铂电极上氧化引起的电极电位变化能被检测到，这个检测时 间与初始细菌浓度成线性关系，j u n t e r 等f 4 5 j 用金一甘汞组合电极电势分析计数大 肠杆菌，通过改进培养基成分，检测底限能达1 0c e l l s l ，所需时间约1 1 h ； m a t s u n a g a 等【4 6 】用两对电极同时测量微生物与电活性物质氧化产生的电流，其中 一对电极的阳极用纤维素渗析膜包覆，以阻止微生物和阳极接触，这样，两对电 极上的电流差即可反映微生物的相关信息，该系统响应时间为15 m i n ，但检测限较 高，仅适于发酵工业中监测微生物浓度；n i s h i k a w a 等【47 】报道了另一种添加氧化 还原色素d c i p ( 2 ，6 d i c h l o r o p h e n 0 1 i n d o p h e n 0 1 ) 的电极系统，经多孔乙酰纤维素膜过 滤预富集，能测定1 0 4 - - 1 0 6c e l l s m l 范围浓度的微生物。 1 3 压电生物传感器的发展历程和最新进展 晶体受外界机械压力作用，在其表面出现正负束缚电荷的现象称为压电效应 ( p i e z o e l e c t r i ce f f e c t ) ，具有这种效应的材料叫做压电材料。在化学和生物传感应 用中，所用的材料主要是a t 切型的0 t 石英单晶片，所采用的变形模式为厚度剪切 模式( t s m ) 4 8 1 。 1 3 1 压电气相传感及应用 压电石英晶体( p q c ) 在气相中振荡时，其性能与表面涂层的质量、物态、性质 及分布、体声波由晶体向涂层的传播及声阻抗等因素有关。此外，与压电晶体自 身振荡状态有关的一些因素( 如温度、晶体谐振器参数) 也可影响其传感响应。1 9 5 9 年，德国物理学家s a u e r b r e y f 4 9 】导出了晶片上附加物质质量( m ) 与厚度剪切压电石 英晶体频移( 力之间的方程关系： 一竿：竺：兰 ( 1 1 ) 一一= 一= 一 ii_i j q m p q t o _ a 式中f o 、a 、历、p q 和f q 分别为p q c 的基频( m h z ) 、电极面积( c m 2 ) 、质量( g ) 、 密度( 2 6 4 8 9c m 3 ) 和厚度( c m ) 。此方程形成了气相p q c 传感分析应用的基础。 1 9 7 7 年，在s a u e r b r e y 工作的基础上g u i l b a u l t 导出了仅适于常用的a t 切型 石英晶体的响应公式【5 0 】： a f ：- 2 2 6 x1 0 6 疗- a m( 1 。2 ) 以 由该方程可发现p q c 是种非常灵敏的质量传感器，其检测限能达到纳克级。 p q c 传感技术广泛地应用于化学尤其是分析化学始于k i n g 的工作f 5 1 1 。1 9 6 4 年，k i n g 打开压电器件外坚硬的外壳，大胆地在晶体表面上涂上敏感的材料并将 抑菌作用及污染物生物修复、检测的电分析技术研究 p q c 用于气相色谱体系中。此后的2 0 年间，p q c 作为灵敏的石英晶体微天平广 泛地应用于气相测定：如真空镀膜厚度的在线监测，各种大气污染物的测定等等 5 2 - 5 5 】。为了进一步提高检测灵敏度和选择性，p q c 气相测定向有机化合物和生物 成分修饰方向发展。1 9 8 3 年，g u i l b a u l t 首次将生物修饰的p q c 用于气相的测定， 他将酶修饰在p q c 的表面测定了甲醛【56 1 。n g e h n g w a i n b i 等提出了气相免疫传感 器【57 1 。最近几年的气相传感应用也仅限于非极性蒸气、氯代烃、芳香烃等的测定 【5 8 ，5 9 】 o 1 3 2 压电液相传感及应用 p q c 在液相中的停振问题最终通过改进振荡电路或采用单面触液型p q c 传感 器得到了解决。1 9 8 0 年，美国的k o n a s h d 、组【6 0 】和日本的野村小组【6 1 1 几乎同时报道 了他们成功的将压电晶体以单面触液方式在溶液中稳定振荡，标志着压电传感器 从此进入了液相时代。 最初阶段，由于未找到起振的关键，石英只能在少数液体中起振。1 9 8 5 年【6 2 】 本室报道了保证起振的关键，即p q c 在溶液中存在着停振温度点，进而实现了在 水解液和4 0 余种液体中的稳定振荡，提出了保证晶体稳定振荡的途径【6 3 射】，随后， 又就有关压电传感的规律、理论与元件展开了深入系统的研究1 6 9 m 】，为p q c 应用 于液相分析莫定了基础。 在p q c 的液相传感理论方面，探索者们也作了大量的研究工作。考虑到压电 晶体泛频级次( b ) 与触液面数( n = l 为单面触液，n = 2 为双面触液) ，适用于液相质量 响应的公式为： 厂：2 2 6 1 0 6 n b f 2 a m ( 1 3 ) 彳 与式( 1 2 ) 相比，我们发现，p q c 在液相中的响应规律与在气相中的响应规律基 本一致。 研究表明，压电石英晶体传感器不仅对质量有灵敏的响应，还可对溶液中的 许多其他非质量因素，如粘度、密度、电导率、介电常数等有灵敏的响应。根据 压电晶体剪切波与流体阻抗剪切波耦合物理模型，b r u c k e n s t e i n t 7 3 1 和k a n a z a w a t 7 4 】 认为压电晶体并不带动整个溶液振荡，实际上只有很薄的液层( 1l a m ) 参与了晶体 的振荡，导出了单面触液压电晶体谐振频移( 觚) 与溶液粘度( 叩) 密度p ) 的 关系： ( 1 4 ) 式中，p q 和鳓分别为压电晶体的密度和剪切模量。 姚和周【6 7 】基于机电耦合模型，建立了压电晶体振荡频率与溶液粘度、密度、 电导率和介电常数的完整的关系式。进一步的研究表明，p q c 在液相中的振荡行 硕 ：学位论文 为还受许多与界面环境的物理和化学性质相关的参数的影响，如晶体表面的粗糙 度75 1 、表面应力【7 6 1 、溶液密度7 7 1 、介电效应【78 1 、表面气泡7 9 1 、界面电容与界面 能【8 0 】等。 p q c 传感器的响应信号的测定方法可归纳为主动法和被动法【8 1 】。主动法常被 称为振荡器法。该法中，压电晶体作为振荡电路的一部分，连接在振荡器放大电 路的输入端和输出端之间，通过引入正反馈电路产生自激振荡，用频率计数器可 测定此时的振荡频率。这种方法常用的是t t l 振荡电路，测定石英晶体的零相移频 率。与主动法相对应的是被动法，常被称为阻抗分析法。在阻抗分析法中，压电 晶体作为外部元件接在电学测量仪( 阻抗分析仪) 的测量端，阻抗分析仪测定的是 加在晶体上的电压与流过晶体的电流之比值即阻抗，它与能量耗散有关。阻抗技 术可以给出全面表征传感器响应的多个参数，这些参数可分为三类：石英晶体等效 电路元件的参数( 包括动态电阻、动态电感、动态电容和静态电容) ，石英晶体的 各种特征频率( 包括最大、最小阻抗频率和串并联谐振频率) 和相位移。其中，石 英晶体的等效电路元件参数均有各自的物理意义：动态电阻代表能量损耗，与本体 粘度和密度有关；动态电感表征晶体表面的粘弹性；静态电容与介电性质有关。 因此采用阻抗分析方法可以获得液相中p q c 声波传感器的多维化学信息，而不象 主动法那样只得到单一的频率响应。 借助于阻抗分析技术，1 9 9 5 年s c h n e i d e r 和m a r t i n l 8 2 建立了压电声波传感模 型，导出了频移与电感关系式。基于牛顿流体的n a v i e r s t o k e s 方程和阻尼波传播 波动方程，t h o m p s o n 等【8 l 】研究了界面边界条件、液体粘度和密度对频率响应的影 响，建立了四层结构理论，还研究了晶体在液相中的振荡行为【8 3 1 。s h a n a 等7 7 1 讨 论了在液相中p q c 的声波效应。1 9 9 0 年前后，z h o u 6 8 】和n o m u r a 分别独立地开发 出一种新型的电极即脱开式压电传感器( e s p s ) 。e s p s 是在p q c - n 放置一块平 行电极作为p q c 的激励电极，被测溶液放置于电极和压电晶体之间。e s p s 不仅 保留了经典触液式传感器的质量、粘密度等基本响应性能，而且还具有灵敏的阻 抗响应特性。1 9 9 3 年，y a o 等又进一步开发出了串联式压电传感器( s p q c ) 7 1 】。 s p q c 由p q c 串联一个电导电极组成，p q c 在真空中振荡，只让电导电极接触溶 液。s p q c 仅对溶液的电导率和介电常数的变化有响应，而对溶液的粘度和密度几 乎没什么响应。 本室还导出了s p q c 的频移公式f 7 4 】，并对等效电路模型和参数进行了详细的 讨论 7 1 , 8 4 】。 1 3 3压电生物传感 压电生物传感器是将高灵敏的压电传感器技术与特异的生物反应结合，通过 换能器将生物信号转化为易于定性或定量检测的物理或化学信号的新型生物检测 分析方法。压电石英晶体传感器是微电子技术、生物医学技术、新材料技术相互 抑菌作用及污染物生物修复、榆测的电分析技术研究 结合发展的产物。它设备操作简单、成本低廉，不需要任何标记；而且还具有灵敏 度高、特异性好、微型化、响应迅速等特点，代表着现代分析技术的前进方向。 在生物医学的各个领域，如：免疫检测，基因检测，细胞和微生物研究等。 1 3 3 1 压电免疫传感器的应用 压电免疫传感器作为一种新型生物传感器，利用压电晶体对质量变化的敏感 性，结合抗原抗体特异性结合的特点而形成的一种自动化分析检测系统，可对多 种抗原或抗体进行快速、在线、连续的定量测定及反应动力学研究，克服了酶联 免疫分析法( e l i s a ) 、放射免疫分析法( r i p ) 、荧光免疫分析法( f i a ) 等传统免疫 检测费时、昂贵及需要标记等缺点，在临床实验室诊断、病原微生物检测、和食 品安全检验中有着广泛的应用前景。 s u r ic r 等博刮把胰岛素的特异性抗体通过s p a 固定法包被于晶体电极表面， 检测血液中胰岛素浓度，最低检测限为1 g l ，时间缩短至3 0 6 0m i n 内完成。 陈志敏等【8 6 】和吴朝阳等【8 7 】采用自组装膜法( s a m s ) 在晶体金电极表面形成 m p a ( 巯基丙酸) 单分子膜，经n h s 和e d c 分别固定梅毒螺旋体分子抗原 ( 4 7 k u ) 和日本血吸虫分子抗原( 3 2 k d s j a 9 3 2 ) ，检测不同浓度的梅毒抗体和日本 血吸虫抗体溶液。b e r n dk 【8 8 】等采用人工合成多种人疱疹病毒，如单纯疱疹病毒i 和i i 型、带状疱疹病毒、e b 病毒等的各自特异抗原肽，制备相应的单克隆抗体， 再通过蛋白a 固定在lo m h z 的石英晶体金电极表面制成免疫敏感膜，检测样品中 的病毒颗粒。h a r t e v e l d 等【8 9 】报道了一种与流动注射技术相结合并利用多克隆抗体 作为识别分子的压电免疫传感器，该传感器被应用于葡萄球菌肠毒素b ( s e b ) 的检 测，其检测限为0 1 9 m l 。p l o m e r l 9 0 】通过葡萄球菌蛋白a 吸附将抗肠道细菌共同抗 原的单克隆抗体包被在10 m h z 的压电石英晶体表面检测大肠杆菌，菌液浓度在 1 0 6 1 0 9c e l l s m l 传感器有较好的响应。p a r k l 9 1 】利用s u l f o l c s p d p ( 磺基琥珀酰 2 吡啶二硫。3 丙酰氨基6 一己酸盐) 连接巯基化的沙门氏菌抗体和石英晶体 表面金膜层，传感器响应时间3 0 9 0 m i n ，可检测细菌悬液浓度的范围是9 9 1 0 5 1 8 1 0 8 c f u m l 。 1 3 3 2 压电生物传感器用于基因检测 传统的p q c 传感器对质量变化的灵敏度高，通常对振荡晶片上任何的负载和卸 载都有响应，但对物质的具体性质却无选择性；而d n a 杂交反应的依据是碱基互 补配对原理，只有全部或部分互补的2 条链才能相互杂交，选择性较高。将二者优 点相结合，构建成灵敏度高、特异性强的压电d n a 传感器。高志贤【9 2 】等利用硅烷 法将s s d n a 固化在p q c 金电极上，构建了压电d n a 传感器快速检测葡萄球菌肠毒 素( s e b ) 基因的方法。用3 氨基丙基三乙氧基甲硅烷( 3 a p t e s ) 修饰p q c 金电极 表面，形成a u o s i 键，在金表面修饰上o h ，然后加入s s d n a ，金表面修饰的o h 硕十学位论文 能与s s d n a 的磷酸基基团反应生成磷酰酯而共价固定。电极固化d n a 探针的量可 用蛋白质核酸分析仪分析固化前后核酸的含量来确定：固化于压电晶体表面 s s d n a 的量可通过生物素标记d n a 的磷酰酶显色的d n a 斑点杂交来确定。此研究 还证明，d n a 探针核酸片断长度相对较短的杂交效果好，再生重复使用次数较多。 1 3 3 3 压电传感器应用于细胞和微生物研究 根据细胞在培养液中的状态可以把细胞分为悬浮细胞和贴壁细胞。贴壁细胞 顾名思义就是在培养器皿的壁上生长，细胞的分裂生长过程对应于器壁的质量增加 过程，故可以利用压电传感器的质量特性对细胞生长过程进行监测。 r e d e p e n n i n g 等人用压电传感器对成骨细胞o s t e o b l a s t s 的贴壁速率进行了监测， 并用扫描电子显微镜测定细胞的表面覆盖率，结果发现晶体的频率下降值与晶体表 面细胞的覆盖率有线性关系，但信号主要来自细胞贴壁所导致的表面粘度变化，因 此s a u e r b r e y 方程不成立。这一结果也在预料之中，因为细胞的典型直径约为1 0 “m ， 比压电晶体表面声波的作用距离大得多，细胞中只有贴壁的一小部分参与晶体的振 荡；另外，细胞在表面不是均匀刚性膜，而且细胞含大量的细胞浆，在溶液中细胞还受 溶液的浮力作用。由于在细胞与晶体的作用中，粘弹性的作用大于质量作用，所以在 压电传感器的检测方式上，除采用频率外还以阻抗分析法测量与能量损耗有关的参 数【6 乳7 2 l 。此外，细菌生长过程中的新陈代谢作用也会改交培养基的物理活性参数如 粘度等，这一现象也可用压电传感器加以监测【9 3 彤】。文献【9 3 1 报道了一种克服压电传 感器频率漂移的方法，使传感器的长期稳定性大为改善。 1 3 3 4 压电生物传感器和纳米胶体金颗粒制备技术联用 刘涛等1 9 6 】用柠檬酸三钠还原氯金酸方法制备纳米金溶胶，在压电石英晶体表 面通过l ，6 己二硫醇固定不同粒径( 5 6 0n m ) 纳米金颗粒对q c m 表面的修饰。研 究表明，2 0a m 粒径金颗粒和d n a 探针的杂交率和检测灵敏度最大，对q c m 表面 修饰作用最佳。 1 4 农药的应用现状 农药是用于防治危害农作物及农副产品的病虫害、杂草及其它有害生物的化 学药剂的统称。它不仅降低了农产品的成本，提高了经济效益，而且在农产品收 获以后的储存、保鲜、运输、销售以及加工等过程中也起到了重要的作用。农药 不但是人类和饥饿作斗争的重要武器，同时也是人类预防疾病的有力武器侈n 。但 与此同时，由于一部分农药具有很强的化学稳定性，食用后不易分解，仍有部分 或大部分残留在土壤中、作物上以及其它环境中。这些残留农药在食物上达到一 定浓度后，入或其它高等动物长期进食这些食物，就会使农药在体内积聚起来， 引起慢性中毒。 抑菌作用及污染物生物修复、柃测的电分析技术研究 1 4 1有机磷农药的降解研究 有机磷农药( o r g a n o p h o s p h a t e ，简称o p s ) 是当今农药中的主要类别，一直在国 内外大量生产和广泛使用。对于环境中有机磷农药的降解研究，尤其是水体及土 壤中农药的降解研究目前已有较多报道。 微生物及微生物酶降解现已研究表明，降解农药的微生物主要为细菌、真 菌、放线菌和藻类，其中细菌由于易诱发突变和适应能力强而占多数，在细菌中， 又以假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 研究的较多。农药微生物降解的途径包括氧化、 还原、水解、脱卤、缩合、脱梭、异构化等，其作用实质是酶促反应。有机磷酸 酯和氨基甲酸酯类农药在土壤中比较容易降解正是由于土壤中存在分泌可降解磷 酸酯和氨基甲酸酯结构水解酶的微生物【9 8 圳。 光催化降解认为有机磷农药的光催化降解是由- o h 和h 2 0 的作用所造成的， 且反应发生在光催化剂表面，0 2 和h 2 0 的存在是光催化降解的必要条件。当近紫外 光照射到t i 0 2 表面时，表面将产生电子一空穴对，吸附在光催化剂表面的