（植物学专业论文）小立碗藓冷胁迫下表达序列标签分析及其相关基因cor166的功能初探.pdf

摘要低温是影响植物生长、发育及地理分布的一个重要生态因子，限制了冷敏感作物在低温季节的种植，导致光合效率低下，作物产量降低但是一些温带植物在秋末冬初感受逐渐下降的外界温度，体内发生一系列生理生化变化，产生了适应性反应，提高了对冬季低温的抵抗能力，表明植物为抵御低温进化出了一套完善的应答机制。深入研究植物冷适应机理对于农业生产如改良作物、增加冷季节的作物品种等意义重大小立碗舜( p h y s c o m i t r e l l a p a t e n s ) 是最近几年发展起来的模式植物系统其分布广、极耐逆境、易培养、培养周期短，容易进行遗传转化和同源重组，j 、立碗藓长期处于单倍体世代，对于遗传学研究来讲，单倍体植物基因突变或敲除所产生的形态或生理生化变化容易被监铡到，这些使研究植物抗逆基因的功能极为方便。本实验构建了一个小立碗藓配子体冷胁迫的s s h c d n a 双向文库在正、反向文库中，分别随机挑选了3 8 4 个阳性克隆，进行斑点杂交根据斑点杂交的信息，分别在正、反向文库中挑选了2 4 0 个和1 8 0 个克隆单向测序，各获得2 3 2 条和1 6 2条e s t 遥过b l s t x 和b l s t x n 与g e n b a n k 的数据库比较，在正向文库的2 3 2 条e s t 中，有2 1 5 条e s t 具有编码蛋白质功能，其余1 7 条e s t 序列与已知蛋白质同源性较低或找不到任何同源序列。在反向文库的1 6 2 条e s t 中，有1 3 4 条e s t具有编码蛋白质功能，其余2 8 条e s t 序列与已知蛋白质同源性较低或找不到任何同源序列在正向文库的2 1 5 条具有编码蛋白质功能的e s t 中，1 2 0 条e s t 序列的功能已知，9 5 条e s t 与推测、假想或功能未知的蛋白质具有很高的同源性：在反向文库的1 3 4 条具有编码蛋白质功能的e s t 中，1 0 4 条e s t 序列的功能已知，3 0 条e s t 与推测、假想或功能未知的蛋白质具有很高的同源性这些已知的功能基因分别来自3 2 个( 正向文库) 和2 7 个物种( 反向文库) 正向文库的已知功能基因3 0 3 来自拟南芥( a r a b i d o p s i s 髓a f i a n a ) 、1 5 8 来自水稻( o r y z as a t i v a ) 、7 9 来自小麦( t r i t i e u ma e s t i v u m ) 、1 3 来自于小立硫藓( p 弦c d 历i 舵胁p a t e n s ) ：反向文库的己知功能基因1 9 8 来自拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 、1 2 7 来自水稻( o r y z as a t i v a ) 、1 1 6 来自于小立碗藓( p h y s c o m i t r e l l ap a t e n s ) 、5 8 来自于烟草( n i c o t i a n at o b a c u m l ) 。对上述2 4 0 条和1 8 0 条e s t 片段进行重叠群分析分别有1 2 6 条和1 0 6 条非冗余e s t ，正向文库里有1 0 6 条单一序列和2 0 个重叠群；反向文库里有9 0 条单一序列和1 6 个重叠群对文库e s t 分析后表明，a b a 、c a “、一些蛋白激酶参与了小立碗莽的冷胁迫信号转导过程；热激转录因子、a p 2 结合结构域转录因子、m y c 相关的d n a 结合蛋白、m y b 家族转录因子、b z i p 转录因子等转录因子参与了冷胁迫下下游基因的表达调控；离子通道蛋白、水通道蛋白、膜通道蛋白、r a b 蛋白等参与了物质和能量的跨膜运输；脂肪酸去饱和酶保护了冷胁迫对细胞膜的伤害；锰超氧化物歧化酶、过氧化物还原酶、过氧化氢酶，谷胱甘肽分解酶等参与了解除冷胁迫下细胞过氧化物升茼导致的毒性的过程；泛素系统在分解变性蛋白的过程中起到主要作用：l e a 蛋白参与了细胞保水及维持相关酶的活性的过程。对类似l e a 3 蛋白的c o r l 6 6 l e a 基因的r t - p c r 、n o r t h e r nb l o t 分析表明：c o r l 6 6 l e a 基因在冷处理1 2 小时时有微弱的上调表达，冷处理2 4 小时表达加强，4 8 小时达到最大，7 2 小时时下调。关键词：小立碗藓；冷胁迫；抑制性差减杂交；表达序列标签；胚后期丰富虽自：基因表达a b s t r a c tl o wt e m p e r a t u r e1 i sc o n s i d e r e do n eo ft h em o s ti m p o r t a n te n v i r o n m a n t a lf a c t o r sl i m i t i n gt h eg r o w t h ，d e v e l o p m e n t ，p l a n t i n g ，c r o pp r o d u c t i v i t y ，p h o t o s y n t h e t i cr a t e ，a n dd i s t r i b u t i o no fp l a n t s b u ts o m et e m p e r a t ez o n ep l a n t sc a na d a p tt h ef u t u r e c o m i n gl o wt e m p e r a t u r eb yp r o d u c i n gs o m ec h e m i c a la n dp h y s i o l o g i c a lm e t a b o l i ni n e n da u t u m na n dp r i m a r ys p r i n g ，t h u si m p r o v e st h er e s i s t a n c et ol o wt e m p e r a t u r ei nw i n t e r i n d i c a t i n gp l a n t se v o l v eas e to fp e r f e c tm e c h a n i s mt or e s p o n s ef o rl o wt e m p e r a t u r e ac l e a ru n d e r s t a n d i n go fp l a n tc o l d i n d u c e dm e c h a n i s mi sas i g n i f i c a n tb r e e d i n go b j e c t i v ei na g r i c u l t u r ef o ri m p r o v i n gc r o pp r o d u c t i v i t y ，a n dm u c hs p e c i e sc a nb ep l a n t e di nw i n t e r p h y s c o m i t r e l l ap a t e n sd i s t r i b u t e di nw i d ew o r l di san e wd e v e l o p i n gp l a n tm o d e ls y s t e mi nr e c e n ty e a r sw i t ha d v a n t a g e s ：e n d u r i n ge x t r e m e l yc o n d i t i o n ；as h o nl i f ec y c l e ；e a s yt oc u l t u r e ，g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o na n dh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n i tf a c i l i t a t e st h eu n d e r s t a n d i n go fg e n e f u n c t i o nf o ri t sl o n gh a p l o i d yg e n e r a t i o n a si t sm o r p h o l o g i c a l ，c h e m i c a la n dp h y s i o l o g i c a lc h a n g e sr e s u l t e df r o mg e n em u t a t i o no rk n o c ko u ta r ee a s yt ob ei d e n t i f i e d at w od i r e c t i o n a ls s h c d n al i b r a r yo fc o l da c c l i m a t i o na b o u tp h y s c o m i t r e l l ap a t e n sg a m e t o p h y t ew a sc o n s t r u c t e d d o tb l o th y b r i d i z a t i o nw a sp r e p a r e dw i t h3 8 4r a n d o mp o s i t i y ec l o n e sf r o mf o r w a r da n dr e v e r s eh b r a r ys e p a r a t e l yb yb l o t t i n go nh y b e n d 矿m e m b r a n e 2 4 0a n d1 8 0c l o n e sf r o mf o r w a r da n dr e v e r s el i b r a r yw e r es e q t t e n c e da c c o r d i n gt od o tb l o th y b r i d i z a t i o ni n f o r m a t i o n ；2 3 2e s t si nf o r w a r dl i b r a r ya n d1 6 2e s t si nr e v e r s el i b r a r yc a nb ef u r t h e ra n a l y z e ds e p a r a t e l y t h es e q u e n c es i m i l a r i t ya n a l y s i si ng e n b a n kb yb l s t xa n db l s t x ns h o w st h a t2 1 5e s t se n c o d ef o rp r o t e i n s ( 9 2 7 o ft o t a l2 3 2 ) ，1 7e s t sh a dn om a t c h si n2 3 2e s t s 1 2 0e s t se n c o d ef o rf u n c t i o n a l l yk n o w np r o t e i n sa n d9 5e s t sf o rh y p o t h e t i c a l ，p u t a t i v ea n du n k n o w np r o t e i n sa m o n g2 1 5e s t s ；a n di nr e v e r s el i b r a r y ，1 3 4e s t se n c o d ef o rp r o t e i n s ( 8 2 7 o ft o t a l1 6 2 ) 2 8e s t sh a dn om a t c h s 1 0 4e s t se n c o d ef o rf u n c t i o n a l l yk n o w np r o t e i n sa n d3 0e s t sf o rh y p o t h e t i c a l ，p u t a t i v ea n du n k n o w np r o t e i na m o n g1 3 4e s t s t h e s eb e s tm a t c h e dp r o t e i ns e q u e n c e sa r ef r o m3 2s p e c i e s ，3 0 3 f r o ma r a b i d o p s l sf a l i a n a , 1 5 8 f r o mo r y z as a 6 v a ，7 9 f r o mt r i t i c u t na e s t i v u m , 1 - 3 f r o mp h y s c o m i t r e l l ap a t e n si nf o r w a r dl i b r a r y ；b u ti nr e v e r s el i b r a r y ,1 9 8 f r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n a ，1 2 7 f r o mo r y z as a t i v a ，1 1 6 f r o mp h y s c o m i t r e l l ap a t e n s , 5 8 f r o mn i c o t i a n at o b a c u m e s tc o n t i ga n a l y s i ss h o w st h a tt h e r ea r e1 2 6n o n r e d u n d a n te s t si nf o r w a r dl i b r a r y , o u to f1 2 6e s t s ，1 0 6e s t sa r es i n # e t o n s ，2 0e s t sa r ec o n t i g s ；a n dt h a ti nr e v e r s el i b r a r y ，t h e r ea r e1 0 n o n r e d u n d a n te s t s ，9 0e s t sa r es i n g e t o n s ，1 6e s t sa r cc o n t i g s a c c o r d i n ge s ta n a l y s i s ，i tw a ss u p p o s e dt h a ta b a ，c a z + a n ds o m ek i n a s e sp l a yar o l eo fs i g n a lt r a n s d u c t i o ni nc o l da c c l i m a t i o n ；s o m et r a n s c r i p t i o nf a c t o r ss u c ha sh o ts h o c kp r o t e i n ，a p 2d o m a i nb i n d i n gp r o t e i n ，m y b ，m y cf a m i l yp r o t e i n s ，b z i pr e g u l a t et h e i rd o w n s t r e a mc o l d i n d u c eg e n ee x p r e s s i o n ；t h ec h a n n e lp r o t e i ns u c ha si o nc h a n n e lp r o t e i n ，w a t e rc h a n n e lp r o t e i n ，m e m b r a n ec h a n n e lp r o t e i n ，r a bp r o t e i np l a yar o l eo ft r a n s m e m b r a n et r a n s p o r t ；o m e g a - 6f a t t ya c i dd c s a t u r a s ep r o t e c t sm e m b r a n ef r o mc o l ds t r e s si n j u r y ；s o m ee n z y m e ss u c ha sm a n g a n e s es u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，p e r o x i d a s e ，h y d r o p e r o x i d er e d u c t a s e , l g l u t a t h i o n el y a s er e l i e v ec e l lt o x i nt w h i c ha r ca ta l lt i m ep r o d u c e di nc o l ds t r e s s ；u b i q u i t i ns y s t e mb r e a ku pt h ed e n a t u r e dp r o t e i n s l e ap r o t e i n sb i n dw a t e ra n df a c i l i t a t et h ee n z y m ea c t i v i t y t h ee x p r e s s i o na n a l y s i so fl b a3 - l i k e dc o r l 6 6g e n eb yr t - p c ra n dn o r t h e r nb l o ts h o w sc o r l 6 6u i ag e n ei ss l i s h t l yu p r e g u l a t e da t1 2 hi nc o l ds t r e s s ，d i s t i n c tu p r e g u l a t e da t2 4 1 3a n d4 8 h ，l l pt op e a ka t4 8 h ，a n dd o w na t7 2 h k e yw o r d s ：p h y s c o m i t r e u ap a t e n s ；c o l ds t r e s s ；s s h ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) ；e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) ；l e a ( 1 a t ee m b r y o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n ) ：g e n ee x p r e s s i o n第一章文献综述植物时时刻刻都同周围环境进行着物质、信息和能量的交流。环境中与植物相关的因子多种多样，且处于动态变化之中，植物对每一个因子都有一定的耐受限度。一旦环境因子的变化超越了这一耐受限度，就形成了植物逆境胁迫。植物在其生长发育过程中。遭遇逆境胁迫是不可避免的。干旱、高盐及低温是最主要的影响植物生长和发育的逆境胁迫因素。这些逆境胁迫都会引起不同程度的缺水胁迫，进而引起植物的各种生理生化及形态变化，如细胞膜组分的变化、气孔的关闭等，严重时会导致植物的死亡。低温胁迫是植物经常道遇的一种逆境胁迫，为了适应、抵抗低温胁迫，植物在长期的进化过程中，形成了相应的应答保护机制。随着细胞生物学、分子遗传学和分子生物学等理论与技术的飞速发展，对植物抗寒性的研究已经从传统的对植物进行抗寒锻炼从而筛选培育作物抗寒品种转入到植物抗寒的分子机理的研究上。但近年来的分子生物学研究表明，植物抗寒性并不是由单一基因控制的，更多的时候是通过一簇密切相关基因共同作用的，虽然一些抗寒相关基因已被克隆，但全面揭示植物的抗寒机理还有待调整思路和研究方法。随着人类基因组计划( h g p ) 的顺利进行，植物分子生物学也全面进入功能基因组时代。两种模式植物拟南芥和水稻全基因组序列的测序已经完成，大豆、玉米、小立碗藓的全基因组正在测序中，将来会对越来越多的重要农作物全基因组进行涌序这将会有大量的测序数据与信息，再加上强有力的计算机处理系统，迫使我们不能停留在原有技术水平和思路上进行基因的分离分析，这就是后基因组时代：基因组学的研究从结构基因组学( s t r u c t u r a lg e n o m i c s ) 、比较基因组学( c o m p a r a t i v eg e n o m i c s ) 过渡到功能基因组学( f u n c t i o n a lg e n o m i c s ) 。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息，系统地研究基因的功能它以高通量、大规模实验方法及统计学与计算机分析为特征，并相应产生了一系列的实验技术手段，促进了植物分子生物学的研究。表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) 技术即是功能基因组学的一种重要方法，被广泛应用于研究特定时期和特定发育阶段的组织细胞功能机制和新基因的发掘等。l 植物抗寒的分子生物学研究进展植物的新陈代谢和生长发育主要受遗传信息及环境信息的调节控制，遗传基因决定个体发育的潜在模式。环境信息影响遗传基因的时空表达植物固生于一定的环境，无法回避环境温度尉烈交化的影响。要维持生存、保证种族的延续，必需适应多变的温度环境。植物如何通过细胞感受逆境信号，传导低温刺激，激活一系列分子途径并调控相关基因表达和生理反应以适应低温环境并获得抗寒性，已成为现代植物生物学研究的热点1 1 植物抗寒性获得的途径植物在个体发育中遭遇低温时，往往会发生相应的性状变异，获得在生物学中称为的获得性状( a c q u i r e dc h a r a c t e r i s t i c s ) 。如果该获得性状只在细胞生理反应和表现型上表现，与基因活化及蛋白质合成无直接关系，如仅是激活酶和引起细胞运动反应等，该性状不可遗传。称之为短期反应( s h o r t t e r mr e s p o n s e s ) ：如果该获得性状表现为基因型的变化，与基因活化与蛋白质合成直接相关，如泌盐器官建成，光形态建成及向轴性形态建成等等，该性状可遗传性传递给后代，称之为长期反应( 1 0 n g t e r mr e s p o n s e s ) 长久的较为稳定的环境变化。会使高频转录产生的r n a通过逆转录方式形成c d n a , 最后整合到d n a 上。从而有遗传物质的增量记录到d n a 遗传信息库中，在遗传上强化其性状或产生新性状植物在低温胁迫下。获得抗逆性( 包括抗寒性) 的模式可归纳如图1 1 所示( 参见缪颖等，2 0 0 1 ) 厂藤圃l 和形态建成i1 ：二：i图1 1 逆境下细胞抗逆性获得的细囊分子生物学机制模型( 缪颖等2 0 0 1 )f i gl _ 1t h er e s i s t a n c em o l e c u l a rm o d e la c q u i n di np l a n t sf r o mm i uy i n s ，2 0 0 11 2 植物抗寒过程中细胞的物质及动态变化植物在遭受低温胁迫时，体内必然要产生相应的代谢产物防止低温对细胞的伤害，同时，细胞本身的结构组成也会发生适应性变化。1 2 1 膜脂组成变化与抗寒性的关系细胞膜的流动性和稳定性是细胞乃至整个植物体赖以生存的基础研究表明，植物冷害首先发生在细胞膜系统，而膜系统损伤首先是冷冻引发的严重脱水所致。2低温引起植物胞内或胞外结冰，由于胞外冰点较高且有一些灰尘和冰核细菌作冰核，所以胞外先于胞内形成冰晶。冰晶溶液比液态溶液的水势低得多，并且温度越低水势差值越大，因而胞内的水分通过质膜流出，导致细胞严重脱水。l y o n s ( 1 9 7 3 ) 根据细胞膜结构功能与抗冷性的关系，提出著名的“膜脂相交冷害”假说。认为温带植物遭受零上低温时只要降到一定的温度，生物膜首先发生膜脂的物相变化，这时膜脂从液晶相变为凝胶相，膜脂的脂肪酸链由无序捧列变为有序，膜的外型和厚度也发生变化，可能使膜发生收缩，出现孔道或龟裂，因而膜的透性增大，膜内可溶性物质、电解质大量向膜外渗漏，破坏了细胞内外的离子平衡，同时膜上结合酶的活力降低，酶促反应失调。表现出呼吸作用下降，能量供应减少，植物体内积累了有毒物质。l y o n s 认为植物遭受冷害后出现的种种代谢变化都是次生或伴生的，而冷害的原初反应是发生在生物膜的类脂分子上。当膜脂发生降解时，就会发生组织受害死亡，因此，l y o n s 将膜脂降解作为冷害不可逆的生理指标。温带植物遭受零上一定的低温时，膜脂从液晶相变为凝胶相，细胞膜无法行使其正常功能，而膜脂相变转换的温度与膜脂脂肪酸的不饱和程度密切相关如果膜脂中所含的脂肪酸饱和度大，膜腊相交温度相应升高；反之，则降低。因此，围绕着不饱和脂肪酸与植物低温的耐性之间是否存在因果关系曾作了大量的研究。s t e p o n k u s ( 1 9 8 4 ) 将研究结果总结为：( 1 ) 冷敏感植物与抗冷植物相比，饱和脂肪酸含量较高；( 2 ) 在冷驯化过程中，植物细胞不饱和脂肪酸含量升高；( 3 ) 与以上实脸结果相反，认为植物的抗冷性与不饱和脂肪酸含量无关。近年来，应用生物技术，使植物耐冷性与膜腊脂肪酸饱和度的关系的研究取得了突破性的进展( s o m e r v i l l e ，1 9 9 5 ；n i s h i d ae t a l 。1 9 9 6 ；m u r a t a ，1 9 9 7 ) 。其中一个是对蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) d e sa ( d e s a t u r e da ) 基因与其抗冷性关系的研究。l o s ( 1 9 9 3 ) 等发现蓝细菌( s y n e c h o c y s t i sp c c 6 8 0 3 ) 的d e sa 在环境温度由3 6 下降到2 时，该基因的表达在lh 内就增加1 0 倍，返回3 6 后的3 0m i n 内，其表达又恢复到原来水平v i g h ( 1 9 9 3 ) 等报道刺激d e s a 表达是由于低温首先降低了膜脂的流动性，刺激d e s a 的转录，使膜脂不饱和度增加，从而增加膜脂的流动性w a d a ( 1 9 9 0 ) 等将抗冷蓝细菌( s y n e c h o c y s t 话) 的d e s a 导人不抗冷的蓝细菌a n a c y s t i sn i d u l a n s 中，后者膜脂脂肪酸的不饱和度增加，相应地其光合作用在5 下不受明显抑制另一项是叶绿体膜上磷脂酰甘油( p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l 。p g ) 的脂肪酸( 饱和或不饱和) 合成差异对植物冷敏感性的影响在叶绿体中存在着两种酰基脂化酶，即甘油- 3 磷酸酰基转移酶( g l y c e r o l - 3 p h o s p h a t ea c y l t r a n s f e r a s e ) 和单酰基甘油3 磷酸转酰酶( m o n o a c y l g y c e r o l - 3 - p h o s p h a t ea c y l t r a n s f e r a s e ) 前者只负责甘油c 1位上的脂化，后者只负责c 2 位上的脂化( f r e n t e ne ta l ，1 9 8 3 ) 。叶片p g 合成过3程中，其c 1 、c 2 位上的转酰基酶分别对脂肪酸具有选择性。而决定冷敏感植物与抗冷植物叶片p g 分子差异的关键是甘油3 磷酸转酰酶在c 1 位上对酰基载体蛋白( 1 8 ：1 和1 6 ：0 a c y lc a r r i e dp r o t e i n s ，a c p ) 的选择性? 在抗冷植物中，c - 1位转酰酶对c 1 6 ：o 和c 1 8 1 具有同样的选择性，而在冷敏感植物中，则主要选择c 1 6 ：o ：对于c 2 位转酰酶，在抗冷和不抗冷植物中没有选择性差异。都较易选择c 1 6 ：o ( m u r a t a ，1 9 8 3 ，1 9 8 4 ) 。拟南芥因含有高比例的顺式不饱和脂肪酸而较抗冷，而因含低比例不饱和脂肪酸的南瓜则对冷敏感。m u r a t a ( 1 9 9 2 ) 等将南瓜和拟南芥的甘油3 磷酸转移酶基因分别转人烟草，转化株中除磷酸甘油组成有大幅度度改变外，其他腊类的脂肪酸组成没有明显变化。导入南瓜相应酶基因的烟草，磷脂酰甘油的顺式不饱和脂肪酸含量由转化前的6 4 下降到2 4 ，转化株的冷敏感性增加：而导人拟南芥酶基因的烟草，则不饱和脂肪酸上升到7 2 ，且其冷敏感性下降。第三个是三烯朦肪酸( 18 ：3 和1 6 ：3 ) 在植物抗冷性中作用的研究，这来源于一系列三烯脂肪酸合成有缺陷的拟南芥突变体( f a d ) 对低温的反应。f a d 7 突变体由于三烯脂肪酸含量的下降。变得对冷更为敏感，将能够对f a d 7 突变起到互补作用的叶绿体m 3 脂肪酸去饱和酶的基因导人烟草，转化株的1 8 ：3 和1 6 ：3含量升高而相应的1 8 ：2 和1 6 ：2 含量下降，转化株的抗冷力得到了提高( k o d a m ae ta l ，1 9 9 4 ) 膜脂降解与植物抗冷力关系的证据主要来源子对磷脂酶d ( p h o s p h o l i p a s ed ，p l d ) 的研究p l d 是催化膜脂分解的主要酶之一，冷胁迫增加了由p l d 介导的膜磷脂的分解( p i n h e r oe ta l ，1 9 9 7 ；r y ne ta l ，1 9 9 4 ) z h o u ( 1 9 9 7 ) 等将编码p l d 和反义p l d 的基因分别转入烟草，转反义p l d 转化株抗冷力获得提高，而转p l d转化株抗冷力下降以上的结果表明植物抗冷力的提高与膜脂高比例的不饱和脂肪酸含量成正性关系，膜腊的氧化分解致使植物抗冷力降低。1 2 2 细胞抗氧化能力与植物抗寒性的关系抗冷植物比冷敏感植物具更高水平的抗氧化能力细胞抗氧化系统包括酶促和非酶促清除活性氧的系统，酶促系统包括：过氧化氢酶( c a t ) ，超氧化物岐化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o x ) 、谷胱苷肽还原酶( g r ) ；非酶促清除活性氧的系统包括：还原型谷胱苷肽( g s h ) 、抗坏血酸( a s a ) 、胡萝卜素( c a r ) 、维生素e 、甘露醇等有研究表明，冷敏感植物在冷胁迫( c h i l l i n gs t r e s s ) 条件下。细胞中活性氧的产生加速，而清除活性氧的能力下降。导致活性氧水平的提高( b o w l e re ta l 。1 9 9 2 ；w a d ae t a l ，1 9 9 0 ；p r a s a d e t 口1 9 9 4 ，1 9 9 7 ；何若辑，1 9 9 5 ；曾韶西等，1 9 9 1 ) 高水平的活性氧可能加速了膜腊过氧化和膜蛋自间的聚合，从而破坏膜结构功能因此，冷害条件下活性氧引起的伤害也是冷害的重要原因之一另一方面，有研究证明冷驯化提高了细胞内抗氧化酶活性和内源抗氧化剂含量，相应削弱了由冷害引起的膜4蛋白和膜脂过氧化，提高了植物的抗寒力( p r a s a d 。1 9 9 6 ；b r i d g e re ta l ，1 9 9 4 ：h a u s l d e me ta l ，1 9 9 4 ：f o y e re ta l ，1 9 9 4 ：曾韶西等。1 9 9 4 ；王以柔等，1 9 9 5 ) 。另外植物不同的抗冷力也是与其细胞内具有不同水平的抗氧化酶活性和内源抗氧化剂含量相关的( 李美茹等，1 9 9 5 ：曾韶西等，1 9 9 7 ) 。p r a s a d 等( 1 9 9 4 ) 用氨基三唑( a m i n o t r i a z o l e ，一种c a t 专一性抑制剂) 抑制c a t 活性，则消除了冷驯化提高玉米幼苗抗冷力的效果，可见c a t 在玉米苗冷驯化过程中起着很重要的作用因此，细胞的抗氧化能力是与植物的抗冷性呈正相关的。由于抗氧化系统是植物细胞重要的防御系统，人们广泛开展了氧自由基与植物抗冷性关系机理的研究，想进一步阐述低温下植物受伤害或抗冷植物适应低温的机理。从理论上讲，应用遗传工程技术转抗氧化酶基因或提高抗氧化剂的含量，便能直接研究抗氧化酶、抗氧化剂与植物抗冷力表达调控的关系。g u p t a ( 1 9 9 3 )等报道使外源c u z ns o d 在烟草叶绿体中超表达，从而增加了烟草抵抗低温引发光抑制的能力但是c a m p ( 1 9 9 6 ) 等发现外源f e s o d 在烟草叶绿体中超表达，对低温引发的光抑制无抗性。s l o o t c n ( 1 9 9 5 ) 等也报道m ns o d 在叶绿体中超表达，也不能增加其对低温下光抑制的抵抗能力，c h a l n n o n g p o l l ( 1 9 9 7 ) 等将转反义c a t 基因导人烟草，该转化株的c a t 活性只有野生型的1 0 ，发现该转化株增加了对甲基紫精( m v ) 、盐、0 3 的敏感性，但对冷的敏感性不变。m o r i t a( 1 9 9 7 ) 等将胞质a p x ( 即a p x a 和a p x b ) 基因转人烟萆细胞，获得在胞质中超表达的a p x a 和a p x b 转化株，冷胁迫时，转a p x a 转化株的a p x a 的m r n a 量不变，在恢复生长时，a p x a 的m r n a 水平下降；但转a p x b 转化株的a p x b 的m r n a 水平在冷胁迫时下降，而在恢复时则上升。上述的实验得到正反两方面的研究结果，可见尽管利用基因工程技术转抗氧化酶来提高植物抗冷力已取得令人可喜的效果，但距通过转抗氧化酶定向操纵植物抗冷性的目标还有相当多的问题需要解答。下面的几个实验结果更加体现了转基因研究细胞抗氧化能力与植物抗冷力关系的复杂性程度f o y e r ( 1 9 9 4 ) 等讨论了抗氧化酶基因的研究进展，指出在植物中超表达抗载化酶具有正、中或负的效应。g u p t a ( 1 9 9 3 ) 等发现转c u z ns o d基因的转化株，除s o d 活性升高外，清除h 2 0 2 的a p x 活性也升高。c a m p( 1 9 9 6 ) 等发现外源f c s o d 在叶绿体中超表达的烟草转化株对由于m v 在光照下产生的0 2 。有清除作用，具有保护质膜和光系统i i ( p s ) 的作用；而转m ns o d株，m ns o d 在线粒体定位表达，m ns o d 仅保护质膜，对叶绿体无保护作用，推测这是由于f es o d 和m ns o d 对不同膜具有不同亲和性引起的。转f es o d株在盐胁迫下，可能干扰了盐信号传导途径，因为盐胁迫使对照株的细胞质f cs o d ，叶绿体c u z ns o d 。a p x ，脱氢抗坏血酸还原酶和g r 活性增加，而转化株则抑制了细胞质和叶绿体中c u z ns o d 活性，从而提高了叶绿体a p x 同工酶5活性。这可能是由于f e s o d 降低叶绿体0 2 的含量，而0 2 。或0 2 反应后的衍生分子是诱导c u z ns o d 的信号分子。由于各种抗氧化酶存在细胞中的不同部位，其作用特性也就有差异，其催化反应后的代谢产物又相互制约，同时各种植物抗氧化胁迫的机制不一定相同，因而活性氧代谢这个复杂过程的特性也不尽相同。1 3 植物抗寒基因表达的调控1 3 1 植物抗寒的功能基因植物的抗寒能力是长期进化的结果。当外界温度下降时，植物感受低温信号，引起许多基因表达的变化。至今，利用差别筛选c d n a 文库、突变体筛选等技术分离到了许多冷诱导基因( 表1 1 ) ，并鉴定了其中一些基因的功能，这些基因包括植物抗寒功能蛋白基因及转录水平调控的基因。这些功能蛋白包括以下几类：第一种是一类水通道蛋白，如主要内在蛋白( m i p )等。这类蛋白质可以形成选择性的水运输通道，提高细胞膜的透水性，便于水分摄入，从而使脱水胁迫下的细胞保持一定的膨压，以维持正常的生命活动。第二种是保护生物大分子及膜结构的蛋白质，如抗冻蛋白及胚胎发生晚期丰富蛋白( l e a )等这类蛋白质多具有保守的序列单元，含较多的极性氨基酸残基，它们一般具有热稳定性、不易交性、可创造一种起保护作用的水相环境，防止其他蛋白质进一步变性，甚至能帮助已交性的蛋白质复性；第三种是合成渗透保护物质( 如脯氨酸、甜菜碱及多元醇等) 的关键酶类，如脯氨酸合成酶等。这类酶可通过诱导渗透保护物质的生物合成来降低细胞的渗透势，提高植物的抗胁迫能力；第四种是具保护作用的蛋白酶类，如巯基蛋白酶( t h i o lp r o t e a s e ) 等此酶可降解变性蛋白质，为新蛋白质的合成储备原料；第五种是具有解毒作用的酶类，如超氧化物歧化酶( s 0 d ) 等植物在逆境因素的作用下会产生高度反应性氧自由基0 l o s ) ，而此酶类可抵御由r o s 所引起的氧化损伤和致死效应。从而提高植物抗胁迫能力。关于低温下脯氨酸、甜菜碱等渗透保护物质对细胞的保护作用研究的比较广泛，比较低温明化与不驯化或具有不同驯化能力植株的代谢变化和结构组分是研究植物抗寒能力的重要方法。x i n ( 2 0 0 0 ) 等通过比较发现低温驯化过程中有许多生理生化变化( 图1 2 ) 。但在如此多的变化中，很难区分哪些变化使植物产生了抗寒力。因此，植物抗寒性是一个数量性状( x i ne ta l ，2 0 ：t h o m a s h o w ，1 9 9 9 ) 。例如自由脯氨酸含量的变化，番茄积累脯氨酸的体细胞突变体中，脯氨酸积累与其抗寒性提高一致( d e | a u n c y ，1 9 9 3 ) ；4 c 驯化野生型拟南芥檀株。脯氨酸增加l o 倍，这充分说明了脯氨酸在植物抗寒中的作用但是拟南芥低温驯化中脯氨酸水平的增加却发生在抗寒性提高之后( w a n n e re ta l ，1 9 9 9 ) ，还发现有一些突变体与不驯化的野生株一样具有很低的脯氨酸水平。但是却具有抗寒能力( x i ne ta l ，2 ( ) 0 0 ) 6表1 1 已分离鉴定的植物冷诱导基因t a b l e1 1t h ei d e n t i f i e dc o l d - r e g u l a t e ds c n e sf r o mp l a n t s拟南芥大麦苜蓿欧洲油菜小麦水稻马铃薯番茄菠菜r d 2 9 at d 2 9 bc o r 7 8c o 蹦6c o r 4 7c o r l 5 bl t i 7 8i t i l 4 0l t i 3 0l t i 4 5r a b l 8k j n 2c o r l 5 ai t i 6 5c c r 2c c r lr c l lr a 2f a d 8l 【i n lb i t 4b l t 4 2b l t 4 9h v lb l t 8 0 1b l t 4b i t l 4 2b l t l 4 1a d b 6b i t l 0 1b l t l 0 1 2b i t 6 31 5 9b l t l 4m 轴d s m 2 0 7 5c b l 5 c m l 7c 蛆1 8s m 笠o ls m 2 8 m 扯a ca d hb n l l 5b n l 9b n 2 6b n c 2 4 ab n c 2 4 bb n 2 8p e p 强c o r 3 9w c o r 4 1 0w c s l 2 0w c s 抛w c 6w c s l 9p b c l 2 1p b c 4 4 2p b c $ 9 1p b c 6 0 1a 1 3c 毪l c i 7c 1 4 c 1 7 c 1 9峭c a p l 6 0b r 2 h s c 7 0低温胁迫、干旱胁迫、脱落酸诱导、盐胁迫低温胁迫、干旱胁迫、脱落酸诱导低溢胁遗、干旱胁迫、脱落酸诱导低沮胁迫、干旱胁迫、脱落酸诱导低沮胁迫、千旱胁迫、盐胁迫低沮胁追、干早胁迫低沮胁迫低量胁迫、脱落酸诱导低沮胁迫、干旱胁迫、脱落酸诱导低沮胁迫、脱落璇诱导低沮胁迫低疆胁迫未知低沮胁迫、干翠胁迫、脱落酸诱导低沮胁迫低曩胁迫低沮胁迫、干覃胁迫、脱落酸诱导低江胁迫低沮胁追未知低沮胁追、干旱胁迫、脱落酸诱导低胁追未知低置赫迫、千翠胁迫、脱落酸诱导未知低誓謦追、干旱胁迫黑麦d t l 4 1 2d t l 4 2 1低沮胁追除脯氨酸的积累与其抗寒性之间的关系密切以外，可溶性糖在植物的冷7驯化方面同样起重要作用在冬天，温带植物叶子和种子中的蔗糖及棉子糖半乳糖苷系列寡糖的增加伴随着淀粉的减少在北半球的云杉中，1 月份蔗糖、棉子糖和水苏糖的库大小及相对转换比6 月份高2 1 0 0 倍( k a n d l e re fa l ，1 9 8 0 ) ；在寒冷季节，圈l 2 植物在低温捌化过程中的物质和变化( 引自x i n 等，2 0 0 0 )f i 9 1 2 m a t e r i a la n gc h a n g e s d u r i n g p l a n tc o l da c c l i m a t i o n ( f r o mx i ne t 时2 0 0 0 )针时树累积大量的棉子糖和水苏糖，某些针叶树中棉子糖和水苏糖的增加与低温相一致( h i n e s l e ye ta l ，1 9 9 2 ) ；当云杉树暴露在低温下时，其根中的棉子糖含量增加( w i c m k e ne ta 1 1 9 9 3 ) ；筋骨革、苜蓿和连翘中棉子糖的水平夏天最低而秋天和冬天最高( b a c h m a ne ta l ，1 9 9 4 ；f l i n ne ta l ，1 9 9 5 ；c a s t o n g u a ye ta l ，1 9 9 5 ) ；藻类受到冷激后，同样发现棉子糖的累积( s a l e r n o 甜a l , 1 9 8 9 ) ；在甘蓝叶子的抗冻害细胞中。解除抗冷锻炼导致蔗糖和棉子糖含量的下降，叶绿体中的表现特别显著( s a n t a r i u se t4 f ，1 9 7 7 ) 。体外实验表明塘能保护类囊体免遭冷冻伤害，对分予基团来说，棉子糖比蔗糖和葡萄糖更有效。这些结果显示，叶和种子中蔗糖及棉子糖的累积可能对冷驯化作出了贡献。可溶性蛋白的含量与植物的抗冷性之间