（微生物与生化药学专业论文）大肠杆菌对有机溶剂的耐受性研究.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果内容。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 、? 作者签名：土 j 圩、 日期：加暑年弓月；f 日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天 津科技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 -1r 作者签名：土冲。圩 日期：z n 睁弓月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口( 请在方框内打“ ， ) ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密彳( 请在方框内打“ ) 。 作者签名：王辛厅、 导师签名：壬及 - - - r _ 一 日期：伽留年；月f 日 日期：力呀年岁月；je l 摘要 在有机溶剂水两相体系生物转化技术应用中，有机溶剂对细胞的毒害是其中的 重要障碍。研究有机溶剂对细胞的毒害及微生物对有机溶剂的耐受机制，对改造、选 育耐有机溶剂的菌株，增强在生物转化中的应用有着重大意义。本文以大肠杆菌 ( e s c h e r i c h i ac o l i ) k 1 2 为模式菌株，研究了在有机溶剂水两相系统中，有机溶剂甲 苯、四氯化碳、正己烷、邻苯二甲酸二乙酯对e c o l ik 1 2 生长和e c o l ik 1 2 细胞膜的 影响，初步探讨了e c o l ik 1 2 对有机溶剂的耐受机制。 通过研究甲苯、四氯化碳、正己烷、邻苯二甲酸二乙酯对e c o l ik 1 2 生长的影响 可以得到以下结果： e c o l ik 1 2 对四种l o g p 值不同的有机溶剂的耐性不同：对正己烷耐性较强，依 次是邻苯二甲酸二乙酯、四氯化碳，对甲苯的耐受性最弱。 大肠杆菌对不同浓度的有机溶剂耐受性不同：在1 5 、1 0 9 6 、0 3 ( v v ) 的甲 苯、四氯化碳、正己烷、邻苯二甲酸二乙酯存在下，可以看到明显的o d 值变化的差 异。 在0 3 的甲苯、四氯化碳等溶剂存在下，大肠杆菌存活率随作用时间延长而降 低，甲苯尤其明显。在添加0 3 的甲苯3 0 m i n 后，大肠杆菌的存活率仅为2 4 8 。 采用罗丹明1 2 3 ( r h l 2 3 ) 、二乙酸荧光素( f i ) a ) 荧光法测定在o 3 的甲苯、四 氯化碳等有机溶剂存在下，大肠杆菌细胞膜电位、细胞膜通透性的变化。结果发现在 添加0 3 的四氯化碳3 0 r a i n 后，r h l 2 3 和f d a 荧光强度下降了1 6 3 、3 4 5 ，即相 当于膜电位下降了1 6 3 ，膜渗透性增加了3 4 5 。当培养液中添加0 3 的甲苯时， f d a 荧光强度下降6 5 9 ；表明细胞膜完整性受到严重破坏。 用气相色谱法研究了大肠杆菌细胞膜脂肪酸组成的变化，发现在邻苯二甲酸二乙 酯、四氯化碳存在的情况下，细胞膜脂肪酸组成中饱和脂肪酸的含量增加。尽管甲苯 对大肠杆菌的抑制作用最强，但甲苯对膜脂肪酸组成影响却不明显。脂肪酸饱和度的 增加改变了细胞膜的流动性，增强了对有机溶剂的耐受性。 关键词：大肠杆菌；有机溶剂：细胞膜：脂肪酸：有机溶剂耐受性 a bs t r a c t t h et o x i ce f f e c t so fo r g a n i cs o l v e n t so nw h o l ec e l l sa r eas e r i o u sd r a w b a c kf o rt h e a p p l i c a t i o no ft h e s ec e l l si n at w o - l i q u i dp h a s eb i o r e a c t o r i nt h i sr e s e a r c h ，t h eo r g a n i c s o l v e n tt o l e r a n c eo fe s c h e r i c h i ac o l ik 1 2i nat w o - p h a s es y s t e mh a db e e ns t u d i e d e l e m e n t a r i l y t h er e s u l t so b t a i n e dw i l lb eu s e f u la sar e f e r e n c ef o rf u t u r es t u d i e so r g a n i c s o l v e n tt o l e r a n tm e c h a n i s mo f e c o i l s e v e r a lo r g a n i cs o l v e n t s ，s u c ha sn - h e x a n e ，d i r t h y lp h t h a l a t e ，c a r b o mt e t r a c h l o r i d ea n d t o l u e n e ，w h i c hm a y b eh a v ee f f e c to nt h ee c o l ik 1 2a r ed i s c u s s e dw i t ht h et u r b i d i t ya t6 6 0 b i n ( o d 6 面，c e l ls u r v i v a lr a t e sa n dt h ea l t e r a t i o n so fc e l ls h a p ea st a r g e t t h er e s u l t sa r e s u m m a r i z e di nt h r e ea s p e c t sa sf o l l o w s ： 田坞o r g a n i cs o l v e n tt o l e r a n c eo fe c o l ik 1 2i sd i f f e r e n tf o rt h e s eo r g a n i cs o l v e n t s e c o l ik 1 2s t r a i nc a nt o l e r a t en - h e x a n e ，l o wc o n c e n t r a t i o n so fd i r t h y lp h t h a l a t ea n dc a r b o m t e t r a c h l o r i d e ，r e s p e c t i v e l y t h eg r o w t hi n h i b i t i o nc a u s e db yt o l u e n ew a sv e r yo b v i o u s t h es u p p l e m e n t a r yc o n c e n t r a t i o no fo r g a n i cs o l v e n ti sa ni m p o r t a n ti n f l u e n c i n g f a c t o rf o re c o l ik 1 2 e c o l ik 1 2d i d n tg r o wi nt h ep r e s e n c eo f0 3 ( v v ) t o l u e n e t h e s u p p l e m e n t a r yc o n c e n t r a t i o n so fd i r t h y lp h t h a l a t ea n dc a r b o mt e t r a c h i o f i d ef o rr e s t r a i n i n g e c o l ik 1 2g r o w t hw c 他1 5 a n d1 0 ( v v ) ，r e s p e c t i v e l y ( 耖r o l u e n ei sh i g h l yt o x i cf o re c o l ik 1 2 t h ec e l ls u r v i v a lr a t e sw a s2 4 8 w i t h i n3 0 m i nw h e ne c o l ik 1 2g r o w ni nl bs u p p l e m e n t e dw i t h0 3 ( v v ) t o l u e n e t h ec e l lm e m b r a n ep o t e n t i a la n dp e r m e a b i l i t yw e r ee x a m i n e db ym e a s u r i n gt h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fc e l l sl a b e l e db yf l u o r e s c e i nd i a c e t a t e ( f d a ) a n dr h o d a m i n e 1 2 3 ( r h l 2 3 ) u s i n gt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t e r w h e nt h ec e l l sw e r et r e a t e dw i t h c a r b o nt e t r a c h l o f i d ef o r3 0m i n r h l 2 3a n df d ad e c r e a s e db y1 6 3 a n d3 4 5 ，i t i n d i c a t e dt h a tc e l lm e m b r a n ep o t e n t i a ld e c r e a s e d eb y1 6 3 a n dm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y i n c r e a s e db y3 4 5 t h ed e g r e s s i v ee x t e n to ff d ar e l a t i v ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw a s m a x i m a la n dd e s c e n d e d6 5 9 i nt h ep r e s e n c eo ft o l u e n ea f t e r3 0m i ni n c u b a t i o n f a t t ya c i dc o m p o s i t i o nw a sa n a l y z e du s i n gg a sc h r o m a t o g r a p h y c o m p a r e dw i t hn o s o l v e n t , t h es y n t h e s i so fl i p i d sc o n t a i n i n gs a t u r a t e df a t t ya c i d si nt h ep r e s e n c eo fd i r t h y l p h t h a l a t ea n dc a r b o mt e t m c h i o f i d eh a da ni n c r e a s e d e s p i t et h et o x i cp o t e n c yo ft o l u e n ea s ag r o w t hi n h i b i t o rf o re c o l ik 1 2 ，l i t t l ec h a n g e si nf a t t ya c i dc o m p o s i t i o nw e r eo b s e r v e d w h e ne c o l ik 1 2g r o w nw i t ht o l u e n e a l t e r a t i o n si nt h es a t u r a t i o nd e g r e eo ff a t t ya c i d s c h a n g e dt h ef l u i d i t yo fc e l lm e m b r a n e sa n dp r o v i d e de c o l ik 1 2w i t hap e r m e a t i o nb a r r i e r t oh y d r o p h o b i cc o m p o u n d sa n di nt h i sw a yc o m p e n s a t ef o rt h ee f f e c t sc a u s e db ys o l v e n t s k e yw o r d s ：o r g a n i cs o l v e n t s ，c e l lm e m b r a n e ，e s c h e r i c h i ac o l i ，f a t t ya c i d ，o r g a n i cs o l v e n t t o l e r a n c e 目录 1 前言m ”1 1 1 生物转化概述m 1 1 1 1 生物转化的概念”1 1 1 2 微生物生物转化m 1 1 1 3 生物转化在药物合成中的应用m 1 1 1 4 生物转化中的新技术、新领域2 1 2 有机介质中完整细胞生物转化“3 1 2 1 完整细胞生物转化的形式3 1 2 2 有机相催化的优势和缺点4 1 2 3 有机溶剂的选择4 1 3 有机溶剂对微生物的影响5 1 3 1 有机溶剂对细胞毒害机理的研究”5 1 3 2 细胞对有机溶剂耐受机理的研究及进展6 1 4 大肠杆菌对有机溶剂耐受性研究进展8 1 5 立题背景8 1 6 主要研究内容及思路9 2 材料与方法1 0 2 1 材料 2 1 1 菌株 2 1 2 培养基1 0 2 1 3 相关溶液 2 1 4 主要药品m 1 0 2 1 5 主要仪器m 1 1 2 2 实验方法m 1 1 2 2 1g c o k 1 2 的培养 2 2 2 有机溶剂添加时间对菌体生长的影响1 2 2 2 3 采用单染色法观察有机溶剂对大肠杆菌形态的影响1 2 2 2 4 采用活菌计数法考查有机溶剂对大肠杆菌存活率的影响1 2 2 2 5 脂肪酸的提取m “1 2 2 2 6 分析方法m m m 1 3 3 结果与讨论? 1 6 3 1 有机溶剂对e c o l ik 1 2 生长的影响m 1 6 3 1 1e c o l ik 1 2 的生长特性 3 1 2e c o l ik 1 2 的菌体形态1 6 3 1 3 有机溶剂对e c o k 1 2 生长的影响1 8 3 1 4 有机溶剂对王c o k 1 2 存活率的影响 3 1 5 有机溶剂对e c o k 1 2 菌体形态的影响2 l 3 1 6 有机溶剂对e c o k 1 2 代谢活性的影响 3 1 7 金属阳离子与e c o k 1 2 的有机耐受性2 4 3 1 8 小结2 5 3 2 有机溶剂对e c o l ik 1 2 细胞膜的影响” 3 2 1 有机溶剂对e c o l ik 1 2 细胞膜电位的影响2 6 3 2 2 有机溶剂对e c o l ik 1 2 细胞膜通透性的影响“ 3 2 3d 、结2 7 3 - 3 有机溶剂对e c o l ik 1 2 细胞膜脂肪酸组成的影响 3 3 1 正己烷对e c o l ik 1 2 细胞膜脂肪酸组成的影响2 8 3 3 2 邻苯二甲酸二乙酯对e c o l ik 1 2 细胞膜脂肪酸组成的影响3 1 3 3 3 四氯化碳对e c o l ik 1 2 细胞膜脂肪酸组成的影响3 3 3 3 4 甲苯对e c o l ik 1 2 细胞膜脂肪酸组成的影响3 5 3 3 5 小结”3 6 4 结论” 5 展望3 9 6 参考文献o “4 0 7 攻读硕士学位期间发表论文情况4 8 8 致谢- - - - - - - - - - - 4 9 n 5 0 1前言 1 1 生物转化概述 1 1 1 生物转化的概念 生物转化( 亦称为生物催化，b i o t r a n s f o r m a t i o n ，b i o c o n v e r s i o n , b i o c a t a l y s i s 等) ，指 利用酶或有机体( 细胞、细胞器) 作为催化剂实现化学转化的过程，是生物体系( 包括 细菌、真菌、植物组织、动物组织培养系或生物体系的酶制剂) 对外源性底物进行结 构性修饰所发生的化学反应。其实质是利用生物体系本身所产生的酶对外源化合物进 行酶催化反应。催化反应类型几乎包括所有的体外有机化学反应，如：羟基化、氧化、 脱氢、氢化、还原、水解、水合、酯化、酯转移、脱水、脱羧、酰化、胺化、异构化 和芳构化等。生物转化大多是在室温或中性环境中进行，具有无毒、无污染、低能耗、 高效率、高选择性等优点。生物转化还可以合成化学上难以合成的物质，特别是复杂 的天然活性物质。 1 1 2 微生物生物转化 生物转化包括微生物生物转化、植物培养物生物转化等，研究、应用较多的是微 生物转化。微生物生物转化法是利用微生物中特定的酶将人工合成的非天然化合物进 行生物转化，转化液经分离纯化可得所需产品的过程。微生物在生物催化的手性合成 中有着重要的用途，它能提供廉价和多样的生物催化剂酶，或以完整细胞直接进 行生物催化，后者又称为微生物生物转化。微生物可产生多种酶，能催化多种非天然 有机物发生转化反应，有些反应是化学法难以或不可能完成的化学反应。微生物生物 转化法的优点是不需要酶的分离纯化和辅酶再生，缺点是副产物可能较多，产物的分 离纯化比较麻烦。微生物生物转化法已在一些有机酸、氨基酸、核苷酸、抗生素、维 生素和甾体激素等方面实现了工业化生产。 1 1 3 生物转化在药物合成中的应用 1 1 3 1 手性药物的合成n 1 手性药物是指只含单一对映体的药物。手性是自然界的本质属性之一，作为生命 活动重要基础的生物大分子，如核酸、蛋白质、多糖等分别由具有手性的d - d n a 、 l - 氨基酸、d - 单糖构成，载体、酶、受体等也都具有手性，它们一起构成了人体内高 度复杂的手性环境。药物在进入体内后，其药理作用是通过与体内这些靶分子之间的 严格手性匹配和分子识别能力而实现的。立体结构相匹配的药物通过与体内酶、核酸 等大分子中固有的结合位点产生诱导契合，从而抑制( 或激活) 该大分子的生理活性， 达到治疗的目的。目前手性药物的生产主要分为化学法和生物学法。化学方法手性拆 分难度大，试剂昂贵，且造成资源浪费和环境污染，不利于工业化生产；生物转化法 较化学合成具有明显优势。生物转化实质是酶促反应，酶促反应具有化学选择性、区 域选择性和对映体选择性，利用酶的这些性质可以合成手性药物。合成手性药物的生 1 前言 物转化反应大致可分为两类：一类是把外消旋体拆分为两个光活性的对映体；另一类 是从外消旋体或前手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光学活性产物。 1 1 3 2 天然药物的合成 天然药物一般是指来源于植物、动物、微生物、海洋生物、矿物的药物。植物药 是天然药物的主要组成部分。我国天然药物的生产主要是从天然原料中提取或化学方 法合成，这样就会导致原始资源存量减少、破坏生态环境，而且提取和化学合成的程 序繁琐、效率低、成本高。而采用生物转化的方法则可以克服这些弊端。与传统方法 相比，生物转化有以下几个优势叨： ( 1 ) 生物转化可以为急需开发针对特定有效成分或组分的天然药物的生产技术提 供一条便捷途径，替代传统提取的方法。 ( 2 ) 就天然资源来讲，某种植物中不可能仅含有一种活性成分，往往有一些生源 关系相近或结构类似的化合物。单纯依靠从天然资源中提取分离费时、费力、浪费资 源。因此，可以以生物转化为途径，寻找合适的反应器，以期获得具有更好生理活性 的化合物。 ( 3 ) 生物转化属于绿色化学，能耗低，污染少，保护环境，符合可持续发展的要 求。 1 1 4 生物转化中的新技术、新领域 i i 4 1 双水相系统 双水相生物转化技术主要应用于不溶底物的转化或是有产物抑制的反应，因为它 可以将细胞限于一相而产物迅速萃取到另一相中，这样可以减少产物抑制或者缩短产 物在细胞附近的停留时间来阻止产物的降解，即使产物是高毒性或高度不稳定的，双 水相系统中的反应也是专一的，而且还可以使细胞回收，实现连续发酵，这将有可能 扩大到工业化水平。 1 1 4 2 分子定向进化技术 分子定向进化技术又称分子进化法、体外进化法和直接进化法。与自然进化不同 的是，定向进化技术是在人为引发条件下发生，并通过选择突变后的突变种群来保留 某一方向的进化而排除其他方向突变，整个进化过程完全是被事先定向的。酶的定向 进化是对酶进行修饰的最新方法，它不仅能使酶演化出非天然特性，还能定向进化某 一代谢途径，而且可以改善酶的稳定性、底物特异性、对映体选择性等，并在抗体库、 d n a 结合位点定向进化、抗辐射性等方面也有广泛的应用，极大地拓展了蛋白质工 程学的研究范围，为指导应用( 如药物设计等) 奠定了理论基础。分子定向进化技术已 被用于上百个酶的进化。如枯草杆菌蛋白酶e 在有机溶液中( 6 0 9 6 d 眦) 的活性提高了 1 7 0 倍；b 一内酰胺酶的耐抗菌素c e f o - - - t a x i m c 浓度提高了3 2 0 0 0 倍啷。 i i 4 3 酶和细胞的固定化技术 酶和细胞的固定化技术是指利用化学或物理的手段将游离的细胞或酶定位在有 天津科技大学硕士学位论文 限的空间中并保持其活性的一种手段。在生物转化系统的反应中，要求催化剂不但要 稳定而且能够重复使用，实现连续性操作。应用固定化技术不但可以满足这一要求， 而且可以提高催化剂的稳定性、有利于简化操作和产物的分离。在采用非水相介质的 生物转化中，可以利用酶和细胞的固定化，使生物催化剂在有机溶剂中发挥更高的催 化效率，并且使有机溶剂引起的酶变性抗性显著增强。l l a n e s 等h 1 研究了硅藻土固 定化分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u ms p ) n r r l b - 3 8 0 5 细胞对谷甾醇的侧链降解，考察了 不同的硅藻土材料和颗粒大小对转化率的影响。姜忠义喳1 等对催化剂的膜固定化技术 进行了研究。 除以上技术外，有机溶剂水两液相体系以及浊点系统在生物转化中的应用、基 因工程菌构建技术、超临界流体技术、抗体酶、反胶束酶、交联酶晶体等新技术和方 法的发展及完善，都大大推动了生物转化的研究和应用。尤其是非水相生物转化，目 前已成为人们研究的最大热点。 1 2 有机介质中的完整细胞生物转化 在非水相生物转化和涉及有机溶剂的环境生物技术中，许多过程都与有机溶剂和 细胞或酶的相互作用有关。在完整细胞生物转化过程中，有机溶剂对细胞的毒性则成 为有机相催化的重大障碍。1 9 8 4 年，z a k s 等阻1 报道了脂酶在有机相中的活性。1 9 8 9 年，a l i mi n o u e 等忉发现了一株可以在高浓度的甲苯存在下存活的假单胞茵 ( p s e u d o m o n a sp u t i 胁) ，这两个发现改变了细胞和酶在有机介质中不能存活和保持活 力的观点，从而引起了人们对有机溶剂毒害机理和细胞溶剂耐受性研究的关注。 众多研究方法和技术的出现及应用，极大推动了生物催化的研究和应用，尤其是 非水相生物催化，已成为目前本研究领域的热点研究方向之一。 利用完整细胞进行生物转化，利于解决辅酶再生的问题。在完整细胞中，不仅各 种酶比较丰富，并且有完备的辅助因子再生系统，实际上，完整细胞本身就是有别于 酶的生物催化剂。 1 2 1 完整细胞生物转化的形式 利用完整细胞进行生物转化，其形式可以分为几种： ( 1 ) 利用培养中的细胞。将底物加入到培养到一定时期的细胞培养液中，采用 单批次或流加的方式进行反应。 ( 2 ) 利用休眠细胞。把培养到一定时期酶活最高时的细胞处理为休眠态，细胞 不生长，但具有生长活性，细胞内部的大部分酶都保持了较高的活性。与生长细胞相 比，它们可以悬浮在各种溶剂包括有机溶剂中进行催化反应。这种方式在保持高催化 活性的同时，产物更易分离，可以避免其他代谢产物的产生，达到很高的细胞浓度。 ( 3 ) 利用干细胞。一定条件下，微生物细胞干燥脱水后，仍可保留酶的活性和 生长活性，脂酶、酸胺酶、氧化还原酶、蛋白酶和脱氢酶等都能经受细胞干燥脱水过 程。常用的制备方法是冷冻干燥法和丙酮干粉法。利用干细胞，制备简单，可以确保 1 前言 实验的重复性，另外在操作时，不需要无菌操作哺1 。 1 2 2 有机相催化的优势和缺点 有机溶剂体系可以分为三类叫：t k 有机溶剂( 可溶于水) ，双相系统，单一有机溶 剂体系。g e r a r das e l l e k 和j u l i a nbc h a u d h u d n 帕将其细划分为四类，并对每一种溶剂 体系进行了详细的阐述，即( 1 ) 含有小于2 0 ( 体积比) 有机溶剂的水溶液，( 2 ) 含有大 于2 0 ( 体积比) 有机溶剂的水溶液，( 3 ) 双相系统，水有机溶剂、有机溶剂水和水 有机溶剂水，( 4 ) 单一有机溶剂体系。严格讲，利用不含水的有机溶剂体系才称为有 机溶剂介质。 利用有机溶剂作为反应介质，除了能很好的解决底物的不溶性问题外，还有一些 催化上的其他优点，但不可否认，也存在一些缺点，其优缺点分述如下n 1 1 习： 利用有机溶剂作为反应介质的优点：( 1 ) 提高反应物质的溶解性；( 2 ) 影响反应的 选择性( 底物选择性、区域选择性、立体选择性) ；( 3 ) 降低水活度( 改变水解平衡) ； ( 4 ) 减少在水相中可能发生的副反应；( 5 ) 有利于产物的分离，提高得率；( 6 ) 非极性 溶剂中增强酶的稳定性。 利用有机溶剂作为反应介质的缺点：( 1 ) 对生物催化剂有毒性，降低活性；( 2 ) 要 求与传统催化的不同装置；( 3 ) 需要控制水活度；( 4 ) 增加了反应系统的复杂性。 1 2 3 有机溶剂的选择 两液相培养中，关键是确定合适的有机溶剂。其最重要的要求有两点，一是对细 胞不产生毒性且不影响细胞的生长；二是对代谢产物有较大的萃取能力，以发挥有机 溶剂的作用，减少有机溶剂在反应器中所占的体积。实际上高分配系数和好的生物相 容性往往不可兼得。 有机溶剂对微生物活性的影响( 称为抗菌性) 一般采用l 0 9 p ( 溶剂在辛醇和水 的混合物中的分配系数的对数) 来表示n 羽，一般l 0 9 p 值大于4 的有机溶剂对生物催 化剂活性无影响，因此是生物相容的；l o g l 值小于2 的有机溶剂对生物催化剂活性 影响很大，因此是生物非相容的；而l 0 9 p 值介于2 至4 之间的有机溶剂对生物催化 剂活性影响适中，可能是生物相容的，也可能是非生物相容的。l 0 9 p 值和有机溶剂 在微生物细胞膜的缓冲系统之间有一定的相关性，许多研究成果已经证实有机溶剂在 细胞膜内的积累是造成溶剂对微生物毒害作用的主要原因，有机溶剂溶解在膜内会破 坏膜的完整性，影响膜作为屏障和能量转换的功能n 蛔 用i j d g p 值来反映有机溶剂与生物相容性的关系己被大家广泛接受。严格讲，该 参数反映的是溶剂的疏水性，并不等于极性。但实际的研究表明，生物活性保持和 l o g p 值之间有一定的关系：l o g p 4 的溶剂，一般都适合作 为生物催化的介质。c o l j ai a a n e 等n 叼详细叙述了各种溶剂l 0 9 p 值的计算方法，并探 讨了一些机理。实际上可以这样理解，细胞在有机溶剂中实际是处于一种微水环境状 天津科技大学硕士学位论文 态，这种环境确保了该细胞基本活性或某些方面的活性，l 0 9 p 值越小，疏水性越差， 相反亲水性就越强，而过强的亲水性会将细胞的微水环境破坏，从而使细胞失活。 深入研究有机溶剂选择规律，确定细胞两液相培养合适的有机溶剂，一般认为n 刀： 一是根据有机溶剂的l 0 9 p 值初步确定一定数量的不同有机溶剂；二是在这些有机溶 剂中，测定代谢产物在有机溶剂和培养液中的分配系数，去掉分配系数小的有机溶剂； 三是研究在细胞两液相培养过程中，留下的不同有机溶剂对细胞生长和催化的影响。 因此要确定细胞两液相培养合适的有机溶剂是研究中难度很大的一项工作，所以有必 要根据细胞的生理生化特性和有机溶剂特性，对有机溶剂选择规律作深入的研究，探 索更简便、针对性更强的选择方法。 1 3 有机溶剂对微生物的影响 1 3 1 有机溶剂对细胞毒害机理的研究 许多有机溶剂对细胞有毒害作用n 蝴1 ，这也是应用微生物转化的一个重要障碍。 但有机溶剂对细胞毒害机理的研究还非常少，还不是非常透彻，广泛接受的观点是溶 剂对膜脂的作用，会引起细胞膜通透性的增加，使细胞膜的基本功能丧失，膜蛋白酶 失活，质子梯度破坏，运输系统崩溃，或者高浓度时直接使细胞裂解，从而将细胞杀 死。普遍认为，溶剂在膜中的积累直接导致了对膜的破坏，导致生理功能的丧失。一 旦溶剂溶解于细胞膜中，就会破坏膜的完整性。目前，还没有一种单一的技术可以非 常清楚的监测溶剂对膜结构的影响 从溶剂的深层次毒害机理来看，它在细胞膜中的浓度基本决定了毒性的大小。 h e i p i e p e r l 2 l 】等认为，膜中的实际浓度是引起细胞毒性的重要参数，i s k e n 等啪1 人的研 究证实，甲苯、乙苯、环己胺的存在引起假单胞菌( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) s 1 2 生物量 降低的程度依赖于它们在膜中的实际浓度，而和它们的结构不相关。对于某些有机溶 剂，是由它们的化学特性所决定的，一般来说疏水性的有机溶剂对微生物细胞毒性较 大，这往往与该溶剂的物理化学特征如分子表面积、分子量、极性等有关嘲。另外， 有机溶剂在膜中的浓度在一定程度上和其l d g p 值密切相关，也就是说，可以用这一 参数来表征有机溶剂对细胞的毒性。 1 3 1 1 有机溶剂种类对细胞毒性的影响 在两液相培养的微生物发酵中，许多研究者探索了有机溶剂的分子毒性，认为有 机溶剂的功g p 值能很好地表征有机溶剂对细胞的毒性影响，但得出有机溶剂对细胞 毒性随有机溶剂的l o g p 值变化规律不完全一样。h o c k n a l lmd 等嘲1 认为l o g p 4 的有机溶剂则无毒性；v c r m u em 等啪3 认为l o g p 5 的有 机溶剂则无毒性。b r u c el 等嗍认为l o g p 6 的有机溶剂则无毒性。这些研究者实验所用的有机溶剂有不同的饱和烃、 烯烃、氟代烃、醇、脂、醚和芳香烃等。 为了定量研究有机溶剂对生物催化剂活性的影响，l a n n cc 等口刀考察了1 0 7 种有 机溶剂的介电常数、偶极矩、氢键、极化强度和h g p 值等参数，认为只有i j d g p 值能 很好预测生物相容性。但这只是一个经验性的结论，l o g p 值相近的溶剂可能对微生物 的影响完全不同，如肠沙门氏菌( s a l m o n e l l ae n t e r i c a ) 和大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 可以在正己烷( 1 0 9 p ，3 5 ) 存在的环境中存活，却不能在环己胺( 1 0 9 p ，3 2 ) 存在 下保持活性。 1 3 1 2 有机溶剂处理条件对细胞毒害的影响 吴兆亮等囱舯1 在红豆杉细胞两液相培养中，研究了有机溶剂的加入时间对细胞生 长的影响，结果表明东北红豆杉、南方红豆杉，有机溶剂在细胞的生长对数期中期至 末期加入使细胞的湿重、干重和细胞水含量下降较小。因此为减少有机溶剂对细胞的 毒性，在培养过程中应在细胞的生长对数期中期至末期加入对细胞生长影响最小。吴 兆亮等在红豆杉细胞两液相培养中，也研究了有机溶剂的加入量对细胞生长影响，结 果表明东北红豆杉、南方红豆杉在有机溶剂油酸、邻苯二甲酸二丁脂存在时，随着有 机溶剂体积分数增加，细胞的湿重、干重和细胞水含量逐渐下降，有机溶剂对细胞毒 性增加。因此为减少有机溶剂对细胞毒性，有机溶剂加入量越少越好，但有机溶剂加 入量太少又起不到萃取作用，有机溶剂加入量需要有一个最佳值。 1 3 2 细胞对有机溶剂耐受机理的研究及进展 1 3 2 1 细胞对有机溶剂的耐受机理 非水相生物转化和涉及有机溶剂的环境微生物技术中，有机溶剂对微生物细胞的 毒性使相关的研究和应用受到制约，这些有机分子进入到细胞膜中，破坏膜的完整性、 增加膜的通透性，使细胞死亡；但在一些情况下，某些微生物可以通过自身的抗性机 制在有机溶剂中存活，而微生物对有机溶剂的耐受性主要取决于物理障碍、细胞膜水 平、主动泵出系统三个层次上相应的生理生化作用洲。 一些学者认为细胞要对有机溶剂产生抗性，就必须对抗由溶剂引起的细胞膜通透 性的增加，在该水平上，微生物主要通过h o m c o v i c o u sa d a p t a t i o n 机制( 简称h a 机 制) 嘲和膜脂中脂肪酸的异构化来实现，是对有机溶剂抗性反应的最简单的方式。这 种方式是微生物通过调整膜中脂肪酸的饱和度和脂酞基的长度来维持膜原有的流动 性：通过这种机制，微生物可以产生一定的抗性；在有机溶剂存在的情况下，微生物 可以非常迅速的通过特殊的方式，改变顺式脂肪酸和反式脂肪酸两者的比例，来对抗 细胞膜通透性的增加，特别是在微生物不支持脂肪酸从头合成的情况下，双键的异构 化机制可以使它适应高浓度的毒性。除了这些被动的机制外，有些微生物还有主动的 抗性机制，将有机溶剂从细胞膜中泵出来。 关于微生物在有机溶剂中的耐受机制目前有以下几种说法嗍： ( 1 ) 细胞质膜的适应机制：脂肪酸饱和度的改变，改变膜的透性和稳定性，适应 天津科技大学硕士学位论文 有机溶剂的存在。 。 ( 2 ) 外膜水平的适应机制：革兰氏阴性菌细胞壁有特有的外膜结构。一些离子能 增强外膜组成的稳定性和促使脂多糖组成的改变，从而提高对有机溶剂的耐受性。 ( 3 ) 有机溶剂的改变和排出：有一些微生物通过对有机溶剂的改变和降解或迅速、 及时的排出从而提高微生物对有机溶剂的耐性。 另外，研究发现革兰氏阴性菌对有机溶剂的耐受性比革兰氏阳性菌强一1 ，主要 因为革兰氏阴性菌有一个外膜结构，能够通过外膜脂多糖、脂肪酸的改变及膜上泵出 系统的调节，降低有机溶剂对细胞的毒害洲。与革兰氏阴性菌相比，革兰氏阳性菌缺 少这样一层外膜，所以只有少数几种革兰氏阳性菌表现一定的有机耐受性。 1 3 2 2 细胞对有机溶剂耐受机理的研究进展 尽管有机溶剂对微生物有毒害作用，但还是发现一些对有机溶剂有耐性的微生 物，研究较多的是假单胞菌( p p u t i d a ) 和大肠杆菌( e c o l i ) 。有学者从深海环境里分 离出对有机溶剂有耐性的革兰氏阳性菌，如一些杆菌类，l i n d s e ye h 0 1 等从油蝇幼虫体 内分离出有耐性的溶血性葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sh a e m o l y t i c u s ) 和肠球菌 ( e n t e r o c o c c u s ) 。另外，可以诱变一些本不耐有机溶剂的菌株来获得有耐性的突变株， 如大肠杆菌( ec o ) k 1 2 。大多数对有机溶剂有耐性的细菌是革兰氏阴性菌，只有少 数革兰氏阳性菌( b a c i l l u s , 尉t z o d o c o c c u s ，e n t e r o c o c c u s 等) 对有机溶剂表现出耐受性h h 蜘 郑晓东，梅乐和等在酵母对有机溶剂耐性的研究一文中阐述了酒精酵母比其他 酵母抗非极性溶剂的能力更强。酵母对有机溶剂的抗性不仅与溶剂的极性、毒性、剂 量范围有关，而且与酵母细胞膜的成分、生长培养基、温度等有关。当生长培养基中 的m 矿浓度提高两倍时，多数菌株对有机溶剂的抗性没有影响。温度对所检测酵母的 生长及对溶剂的抗性都有一定的影响。 a n a n d akg h o s h 等1 4 4 发现酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 在有机溶剂刺激 下i c t l p 大量表达，i c t l p 与磷脂酸的合成有关，磷脂酸又与磷脂的合成有关，而膜磷 脂的增加是酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 耐有机溶剂的机制之一。 j a c o br 掣4 5 l 对丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) a t c c8 2 4 与有机溶 剂耐受性相关的基因进行了系列研究，以便更好的理解有机溶剂耐性基因的调控表达 机制。 对有机溶剂耐受性较强的假单胞菌( p p u t i d a ) ，许多学者进行了大量研究，并得 到很多有价值的发现。h o l t w i c k 等【蛔认为膜脂肪酸的顺反异构化，增强了细胞膜的 强度，降低渗透性，从而改变假单胞菌对有机溶剂等逆境的适应能力。另外，磷脂合 成的增加、抗生的泵出系统等被认为有利于增强假单胞菌( p p u t i d a ) 对有机的耐受能 力 4 7 1 。e s t r e h ad u q u e 等【船l 认为假单胞菌( p p u t i d a ) 编码2 0 个e c f s ( e x t r a c y t o p l a s m i c s i g m af a c t o r s ) ，并研究了其中一个e c t - p p l 2 ，编码该e c f 的基因称为r p o t ，发现r p o t 在有机耐受性中扮演重要角色。 1 前言 还有学者研究了肠沙门氏茵( s a l m o n e l l ae n t e r i c a ) 的流出泵基因a c r b 和操纵子 m a r a 和s o x s ，得出结论认为肠沙门氏菌( s a l m o n e l l ae n t e r i c a ) 对环己胺的耐受性与 a c r b 基因有关【钾删。 1 4 大肠杆菌对有机溶剂的耐受机理研究进展 r i k i z o a o n o 掣5 1 】研究了有机溶剂耐性菌株e c o l ik 1 2 突变株的细胞表面特征，认 为e c o l ik 1 2 突变株有机溶剂耐性提高的细胞较亲本疏水性弱，可能是脂多糖增加的 原因，另外，突变株o m p f 合成受到抑制，o m p c 合成得到表达，发现表明有机溶剂 分子可以通过o m p fp o r i n ；o m p f 的缺失可以直接减少有机溶剂的通道数目也间接增 加细胞表面l p s 序列可用区域，从而改变e c o l ik 1 2 的耐性。 n o g u e h i 等【5 2 】人认为培养环境中氧浓度提高有利于增强e c o l i 对有机溶剂的