（特种经济动物饲养专业论文）蚕丝脱胶酶高产菌的筛选、鉴定及其产酶条件优化的研究.pdf

摘要 蚕丝脱胶酶高产菌的筛选、鉴定及其产酶条 件优化的研究 特种经济动物饲养专业硕士研究生张学松 指导教师徐水副教授 摘要 自古以来蚕丝被誉为“纤维皇后”。正是蚕丝独特的结构和氨基酸组成，蚕丝纤维表现出优 雅的光泽、舒适的手感，以及良好的吸湿、放湿和保温功能，使其一直以来作为纺织材料深 受人们的喜爱。蚕丝主要由7 5 舳的丝素和2 0 - - - - 2 5 的丝胶组成。生产过程中蚕丝通过 脱胶加工除去大部分丝胶彰显出独有的光泽和柔顺。 蚕丝脱胶的方法根据丝胶、油脂、蜡质等杂物的性质，脱胶时采用的处理剂不同，将蚕 丝的脱胶分为化学脱胶和酶脱胶( 微生物脱胶) 两类。目前蚕丝的脱胶主要采用化学法，这 类方法的主要缺点是脱胶不均匀，除油效果差，丝纤维的强度损失大，耗水、耗能、污染环 境，是一类资源高消费型工艺。酶脱胶的工艺流程在常温下进行，脱胶过程对丝素的损伤很 小，使蚕丝的优良品质能得到充分保护。酶用量少，且反应后释放的酶可继续催化另一反应； 处理产生的废水可生物降解，因此，减少了污染，节约了能源。酶脱胶后的丝纤维表面更光 洁、透明，丝鸣感更强。可以说，酶脱胶工艺是一种非常典型的对蚕丝的柔软、抛光和改善 服用性能的加工。酶脱胶弥补了蚕丝化学脱胶法的不足，使生丝品质发生了质的飞跃。 本研究以获得蚕丝脱胶酶高产菌为目的，以菌株产酶活力单位和蚕丝脱胶率为指标，从 丝厂周边土壤中分离、筛选得到一株对蚕丝具有显著脱胶能力的芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) ，编 号为s c w 2 - 1 。在此基础上，进行了菌株的鉴定、发酵条件的优化和菌株产活性物质的蚕丝脱 胶率试验等研究工作。主要结果如下： 1 蚕丝脱胶酶产生菌的分离、筛选及脱胶实验 从桑园和丝厂周边土壤中分离获得7 株具脱胶酶生产能力的菌株，分别命名为s c w l 1 、 s c w l - 2 、s c w l 一3 、s c w 2 - 1 、s y 4 2 、s y 6 - 1 和s y 6 - 2 ，其中s c w 2 1 、s y 6 - 1 和s y 6 - 2 三株菌株与其 它几株的产活性物质能力相比具有明显优势。对s c w 2 - 1 、s y 6 q 和s y 6 - 2 三株菌株进行蚕丝脱 胶检测，结果显示三株菌株所产活性物质对蚕丝都具有明显的脱胶作用，尤以s c w 2 1 菌株产 两南大学硕+ 学位论文 活性物质的脱胶效果最为显著。c w 2 - 1 菌株在发酵3 d 后所产活性物质脱胶能力最强，并随着 脱胶时间的延长，脱胶率成正比增长，在脱胶4 d 后到达丝胶完全脱尽。 2 s c w 2 1 菌株的鉴定 对s c w 2 - 1 菌株进行了形态学、生理生化及分子生物学的分类鉴定。形态特征、生理生化 特性检测结果表明，s c w 2 - 1 菌株为革兰氏阳性杆状细菌，有芽孢，不能运动的菌：在牛肉膏 蛋白胨固体培养基上培养2 4 h 后，菌体生长良好；1 6 sr d n a 序列分析显示其序列与苏芸金芽 孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) f j 4 6 2 6 9 7 1 序列1 6 sr d n a 的同源性高达9 9 。综合各项指标 鉴定的结果，鉴定该菌株属于芽孢杆菌属，命名为b a c i u us p s c w 2 1 。 3 s c w 2 i 菌株发酵条件的优化 对s c w 2 - 1 菌株产脱胶酶的发酵条件作了优化研究，得到培养基的最佳碳源为可溶性淀粉， 氮源为大豆粉，金属离子为c ，及最适温度为3 7 c 。初始p h 值为1 0 0 ，发酵时间为7 2 h 。 通过正交试验得到最佳发酵培养基各组分：可溶性淀粉3 ，大豆粉3 ，k i - 1 2 p 0 4 1 。 关键词：蚕丝脱胶菌蛋白酶 a b s t r a ( 了r s c r e e n i n g ，i d e n t i f i c a t i o na n d f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o no p t i m i z a t i o no fas i l k d e g g bacteriadegumming b a c t e r i a r a i s i n go fs p e c i a le c o n o m i ca n i m a l m a s t e r z h a n gx u e - s o n g s u | a s s o c i a t ea r o l 5x ushuipervisorg e s s o r a bs t r a c t t h es i l kh a sb e e nc o n s i d e r e da s “q u e e no ff i b e r s i n c ea n c i e n tt i m e s t h a n k st ot h e u n i q u es t r u c t u r ea n da m i n oa c i dc o m p o s i t i o no ft h es i l k , t h es i l kf i b e rn o to n l ys h o w s e l e g a n tl u s t e r , c o m f o r t a b l ef e e l ，g o o dm o i s t u r ea b s o r p t i o na n dl i b e r a t i o n , b u ta l s ok e e p w a r m i n g , a n di th a sb e e nw e l lr e c e i v e da sp o p u l a rt e x t i l em a t e r i a l sa ta l lt i m e s 皿es i l k c o n s i s t so f7 5 一8 0 f i b r o i na n d2 0 一2 5 s e r i c i n , w h e nm o s to ft h es c r i c i nw a s r e m o v e db yd e g u m m i n gd u r i n gt h es i l kp r o d u c t i o n , i tb e c o m e sm o r eg l o s s ya n d s m o o t h a c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n tr e g e n tu s e di nt h ed e g u m m i n g , t h es i l kd e g u m m i n gi s d i v i d e di n t o2 c a t e g o r i e s ，w h i c h a r ec h e m i c a l d e g u m m i n g a n d e n z y m e d e g u m m i n g ( m i c r o b i a ld e g u m m i n g ) a tp r e s e n t ，t h ec h e m i c a lm e t h o di sm a i n l yu s e di n s i l ki n d u s t r y , t h em a i nd i s a d v a n t a g eo fs u c hm e t h o d si su n e v e nd e g u m m i n g , i n e f f i c i e n t o i lr e m o v i n g , l o s so fs i l kf i b e rs t r e n g t h , w a t e re n e r g yc o n s u m p t i o na n de n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o n i t i sah i 【g h c o n s u m p t i o no fr e s o u r c e st e c h n o l o g y e n z y m ed e g u m m i n g p r o c e s s e sc a r r yo u ta tr o o mt e m p e r a t u r e ，t h ep r o c e s so fd e g u m m i n g c a u s e sl i t t l ed a m a g e o fs i l kf i b r o i n ，s ot h a tt h ef i n eq u a l i t yo fs i l kc a nb ea d e q u a t e l yp r o t e c t e d t h ee n z y m e o n l yr e q u i r e sas m a l ld o s a g e ，a f t e ro n er e a c t i o nt h er e l e a s e de n z y m ec a nc a t a l y z e a n o t h e r i na d d i t i o n ，t h ew a s t e w a t e ri sb i o d e g r a d a b l e t h e r e f o r e ，t h i si sal o wp o l l u t i o n a n de n e r g y s a v i n gm e t h o d f u r t h e rm o r e ，t h es i l kw h i c ht r e a t e dw i t he n z y m e d e g u m m i n gd i s p l a ym o r eb r i g h t ，c l e a n , t r a n s p a r e n ta n ds c r o o p i n g s o ，t h ee n z y m e d e g u m m i n gi sat y p i c a lp r o g r e s so fs i l ks o f t e n ，p l i s h i n g , a n di m p r o v e m e n to fc l o t h i n g n l 两南大学硕士学位论文 u s a g e ，i tm a k e su pf o rt h el a c ko fc h e m i c a ld e g n m m i n ga n db r i n g saq u a l i t a t i v el e a pi n t h eq u a l i t yo fr a ws i l k i no r d e rt oo b t a i nah i g h - e f f i c i e n c yb a c t e r i as t r a i no fs i l kd e g u m m i n ge n z y m e ，w e u s et h ee n z y m ea c t i v i t yu n i to fb a c t e r i as t r a i n sa n ds i l kd e g n m m i n gr a t ea sa ni n d e xt o i s o l a t ea n ds c r e e nas t r a i no fb a c i l l u ss p w h i c he x h i b i t sas i g n i f i c a n tc a p a c i t yo fs i l k d e g u m m i n gf r o mt h es o i la r o u n das i l kf a c t o r y , a n dn a m ei ta sb a c i l l us p s e w 2 - 1 o nt h i s b a s i s ，i d e n t i f i c a t i o no ft h es t r a i n , o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o na n ds i l k d e g u m m i n gr a t i ot e s to ft h ea c t i v es u b s t a n c ef r o mt h eb a c t e r i as t r a i na r ep e r f o r m e d r e s p e c t i v e l y t h em a i nf i n d i n g sa r ea sf o l l o w s ： 1 i s o l a t i o n ，s c r e e n i n ga n dd e g u m m i n gt e s to ft h ed e g n m m i n gb a c t e r i a w ei s o l a t e d7s t r a i n sf r o mt h es o i la r o u n dm u l b e r r yg a r d e na n ds i l kf a c t o r y , w h i c h w e r cn a m e ds c w l 一1 、s c w l 2 、s c w l - 3 、s e w 2 1 、s y 4 2 、s y 6 1a n ds y 6 - 2 t h ea c t i v e s u b e r s t a n c eo fs c w 2 - 1 ，s y 6 - 1a n ds y 6 - 2s t r a i n sa l ls h o w e dp a l p a b l ed e g n m m i n ga c t i v i t y t h es i l kd e g n m m i n gt e s tr e s u l t so fs c w 2 - 1 ，s y 6 - 1a n d3s y 6 - 2s t r a i n ss h o wt h a tt h e a c t i v es u b s t a n c ep r o d u c e db yt h et h r e es t r a i n sp l a yas i g n i f i c a n tr o l ei ns i l kd e g n m m i n g ， e s p e c i a l l ys e w 2 - 1s t r a i n sf e r m e n t a t i o np r o d u c e dt h em o s ta c t i v es u b s t a n c e s e w 2 1 s t r a i np r o d u c e dt h em o s ta c t i v es u b s t a n c ea f t e r3d a y sf e r m e n t a t i o n a n dt h e d e g u m m i n gi n c r e a s e da st i m ep a s s i n gb y t h es e r i c i nw e r ea l lr e m o v e da f t e r4d a y d e g u m m i n g 2 i d e n t i f i c a t i o no fs c w 2 1 w ee v a l u a t e dt h em o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a r b i o l o g i c a lc h a r a r c t e r i s t i co fs e w 2 - 1 a c c o r d i n gt ot h er e s e a r c h ，w ec o n f i r m dt h a tt h e s c w 2 1s t r a i nw a sg r a m - p o s i t i v e ，r o d s h a p e da n ds p o r ef o r m i n gb a c t e r i aw i t hn om o t i l i t y , a n di tg r o w e dw e l la f t e r2 4 hc u l t u r ei np e p t o n eb e e fe x t r a c ts o l i dm e d i u m h o m o l o g y a n a l y s i ss h o w e dt h a tt h es e q u e n c es i m i l a r i t yo fi t s1 6 sr d n a i s9 9 c o m p a r e dw i t h f j 4 6 2 6 9 7 1f r o mb a c i l l u st h u r i n g i e n s i s b a s e do nt h ea b o v er e s u l t s ，s c w 2 1b e l o n g e dt o b a c i l l u s p ，s ow en a m e di ta sb a c i l l us p s c w 2 - 1 3 f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no p t i m i z a t i o no fs c w 2 1 o p t i m i z a t i o no fs e w 2 - 1f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw a sc a r r i e do u ta n df i n do u tt h e b e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a sa sf o l l o w s ：s o l u b l es t a r c ha s t h ec a r b o ns o u r c e ， s o y b e a np o w d e ra st h en i t r o g e ns o u r c e ，k a l i u ma st h em e t a li o n , a n dt h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ei s3 7 c ，i n i t i a lp hi s1 0 0 ，f e r m e n t a t i o nt i m ei s7 2 h o r t h o g o n a lt e s t i v a b s t r a ( 1 d e t e m i n e dt h eb e s tc o m p o n e n t si s3 s o l u b l es t a r c h ，3 s o y b e a nm e a la n d1 k h 2 p 0 4 k e y w o r d ：s i l kd u g u m m i n gb a c t e r i ap r o t e a s e v 独创性声明 学位论文题目：蚕丝腹照酶直芒菌的筮造! 鉴定拯墓亡酶釜住 优化的研究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：签字日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：d 不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月 日签字日期：年 月 日 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 蚕丝的结构 蚕丝，是熟蚕结茧时分泌丝液凝固而成的连续长纤维，也称“天然丝”。它与羊毛一 样，是人类最早利用的动物纤维之一。自古以来蚕丝被誉为“纤维皇后”。正是蚕丝独特的 结构和氨基酸组成，蚕丝纤维表现出优雅的光泽、舒适的手感，以及良好的吸湿、放湿和保 温功能，使其一直以来作为纺织材料深受人们的喜爱【l , 2 1 。 蚕丝是一种天然蛋白质纤维，主要由丝素和丝胶组成1 3 】，另含有极少量的色素、无机物和 油脂等，见表1 1 。蚕丝内部为丝素，外包丝胶，由表1 2 可知，丝素和丝胶的含量因蚕丝种类 不同而异。通常丝素约占7 5 ，丝胶约占2 5 。由表1 3 可知同粒蚕茧不同层次的茧丝成分也是 不同的。 表1 1 茧丝的物质组成h t a b l e l 1t h em a t e r i a lc o m p o s i t i o no fs i l k 1 表1 2 不同品种的茧丝成分比较裂4 1 t a b l e1 2c o m p a r i s o no fd i f f e r e n ts i l ks p e c i e s c o m p o s i t i o n 4 】 桑蚕茧丝 柞蚕茧丝 2 0 3 0 1 2 1 3 7 0 一8 00 6 1 oo 8 1 5 8 4 9 8 5 3 中国茧丝2 1 7 8 7 4 3 0 不同品种 日本茧丝2 1 4 6 的桑蚕茧 欧洲茧丝2 4 0 3 7 4 4 8 7 1 5 9 0 6 4 2 韶 3 0 1 3 3 0 1 3 3 1 7 5 1 0 4 1 0 5 1 0 8 两南大学硕十学位论文 表1 3 同粒蚕茧不同层次的茧丝成分变化情况【4 i t a b l e l 3c o m p o n e n t so fs i l kf i b e ri nd i f f e r e n tc o c o o nl a y e r s 【4 1 1 1 1 丝胶的结构 丝胶存在于茧丝的外围，性状与动物胶相似，故称为丝胶。丝胶与丝素不同，性脆而缺 乏弹性，它覆盖了丝素的光泽。丝胶在蚕体内对丝素的流动起到润滑剂的作用，在茧丝中对 丝素起到保护和胶粘作用【5 , 6 1 。桑蚕食桑成熟蚕后，经生物化学作用，由中部绢丝腺合成和分 泌液状丝胶，约占茧层质量的2 0 - 3 0 ，除了少量蜡质、碳水化合物、色素和无机成分外，主 要成分为丝胶蛋白( 通常称为丝胶) ，约占7 0 - 8 0 。 丝胶是一种球状蛋白，相对分子质量为1 4 , - 一3 1 4 万一由1 8 种氨基酸组成，见表1 4 。其中丝 氨酸( s e t ) 、天门冬氨酸( a s p ) 和甘氨酸( g l y ) 含量较高，相对质量分别达到3 3 4 3 、1 6 7 1 和1 3 4 9 t s l 。 2 表1 4 丝胶蛋白的氨基酸含量【4 1 1 r a b l e1 4a m i n 0a c i d n t e n to fs e r i c i n l 4 j 第一章文献综述 侧 链 稍 亲 水 酪氨酸 色氨酸 脯氨酸 r y r 哪 p r o n 2 9 1 1 8 o 3 6 0 8 0 4 2 5 中性 中性 中性 羟脯氢酸h y p r o 1 5中性 丝胶的二级结构以无规卷蓝为主，并含有部分8 构象，几乎不含a 螺旋结构。接近丝素的 内层丝胶中含b 结构的比例相对外层丝胶来说要高，但外层丝胶在环境条件特别是湿度的影响 下，部分无规卷曲能向b 结构发生不可逆转化【9 l 。通过对丝胶基因s e r l 进行序列分析，确定其9 个外显子中有2 个外显子含有由1 1 4 个核苷酸( 相当于3 8 个氨基酸残基) 为重复单位组成的构 造。该重复构造中丝氨酸密码子约占4 0 ，8 ，其编码的肽极有可能形成b 折叠和b 转角，因此推 测丝胶中也可能含有类似于丝素的结晶斟加，1 。 对丝胶的组成，因研究的角度不同，采用的方法和手段不同，因此得到的结果也不尽相同。 多年来，入们对丝胶是单一蛋白质，还是由几种蛋白质复合而成的问题见解不一【1 冽。金子 英雄例用盐析方法分离丝胶得到易溶性的a 与难溶性的b 两种丝胶，因而提出a 、b 丝胶论。清 水正德瞄】提出控制不同的时间，将茧层加水煮沸，分离出三种溶解性不同的丝胶。小松计一在 清水正德工作的基础上，运用紫外分光光度法进行分析，提出茧丝中存在四种丝胶( 分别称为 丝胶i 、) 的观点。丝胶i 在茧丝的最外层，丝胶最靠近丝素，各层丝胶含量的 比率大致为丝胶i ：丝胶：丝胶( r e + i v ) = 4 ：4 ：2 ；随着丝胶i 到丝胶的顺序，丝胶极性 氨基酸的含量依次逐渐减少、结晶度逐渐增大、溶解性逐渐降低。涉川明朗吲从组织学的角 度将丝胶区分为3 种。分别称为内、中、外层丝胶。其中分子量约1 5 8 万 - 1 7 7 万的丝胶蛋白 分布在外层，分子量约2 2 0 万2 5 7 万的丝胶蛋白分布在中层，分子量约1 2 6 万的丝胶蛋白则 在内、中、外层均存在，分子量低于1 2 6 万的丝胶蛋白分布在内层。蒲生卓磨等阳将中部丝腺 切成5 个部分，从各部分抽出蛋白质，进行凝胶电泳，分离出相对分子量不同( 8 3 0 万) 的5 种多 肽。从基因表达的角度来看，目前已有5 种丝胶基因被克隆和部分测序，共分离到由这5 种丝胶 基因转录的9 种m r n a ，因此丝胶可能含有9 种多肽【勰刎。 3 西南大学硕+ 学位论文 1 1 2 丝素的结构 丝素蛋白是蚕丝的主体，约占蚕丝质量的7 0 - 8 0 ，是一种无生理活性的天然生物大分 子，由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸等1 9 种氨基酸以多缩氨键连接而成，见表1 5 。蚕丝 素蛋白的相对分子质量很高，约为3 6 万3 7 万删。家蚕丝素蛋白是由重链( h 链) 、轻链( l 链) 【3 1 1 及p 2 5 糖蛋白f 3 2 】组成的复合体。 表1 5 丝素蛋白的氨基酸含量【4 i t a b l e1 5a m i n oa c i dc o n t e n to ff i b r o i n 4 1 蚕丝素蛋白结构是由结晶区和非结晶区2 部分组成。结晶区主要由侧链较小的氨基酸残基 组成，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸共占8 5 ，三者摩尔比为4 ：3 ：1 ，且按一定序列排列成 4 第一章文献综述 较为规则的链段【3 3 1 ；而带有较大侧基的苯丙氨酸( p h e ) 、酪氨酸( t y r ) 、色氨酸( t r y ) 等 主要存在于非晶区域【弘翊。蚕丝素蛋白分子构象可分为2 类，即s i l l 【i 型和s i l k i i 型：s i l ki 型 分子链是按a 螺旋和b 平行折叠构象交替堆积而成的，其晶胞属于正交晶系：s i l k i i 型呈反平 行b 折叠( b s h e e t ) 3 6 7 】层状结构。随着渗透压的增加，丝素蛋白分子聚集在一起形成s i l ki 结 构，随着渗透压的进一步增加，s i l ki 结构转变为具有b 哳叠的结构，即s i l k1 1 。蚕丝素蛋白以b 折叠为基础，形成直径大约为l o n m 的微纤维，无数微纤维密切结合组成直径大约为m m 的细 纤维，大约1 根细纤维沿长轴排列构成直径大约为帕1 即m 的单纤维，即蚕丝素蛋白纤维i 3 s 。 研究还表明s i l ki 结构包含水合作用，而转变成s i l ki i 后则不存在水合作用，s i ri 结构是丝素 蛋白无规结构转变为s i l k i i 结构的中间结构。r e 百m l v 等人p 9 1 又发现了存在于蚕丝素溶液一空 气界面上的一种新的蚕丝素结晶形态，称之为s m 【】叮型，其晶体结构与聚甘氨酸i i 相似，属六 方晶系，肽链的立体构象为8 折叠螺旋。在s i l ki 型、s i l k 型和s i l l 【型中，s i l ki i 型是蚕丝 素蛋白的主要晶型，是蚕丝素蛋白具有高弹性模量和强度的主要原因。s i l ki 型和s i l k 型蚕 丝素蛋白可通过丝素蛋白溶液去除溶剂结晶后获得删。 1 2 蚕丝脱胶方法的比较 蚕丝的加工工艺包括脱胶、缫丝、染色或印花和修整，其中脱胶是最重要的步骤。蚕丝 蛋白的组成主要是由丝素、丝胶和少量蜡质，其中丝素、丝胶由于氨基酸组成上存在差异， 表现出不同结构和不同性质。丝胶中以天门冬氨酸和丝氨酸居多分别是1 9 6 2 和3 3 3 1 ，丝 胶中氨基酸分子结构较大，分子间排列松散构成球形蛋白，同时又含有大量的亲水基团，所 以易吸水膨润溶解【4 1 1 。丝素以甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸含量最高分别是4 1 8 1 、2 7 0 3 、1 2 4 5 ， 氨基酸分子相对较小，结构排列紧密，易形成结晶区，多片层结构，所以亲水性弱。蚕丝脱 胶的原理即利用丝素丝胶性质的不同，除去包裹于丝素表面的大部分丝胶，使蚕丝柔软、有 光泽，在众多纺织纤维中体现出独具的商业价值。 蚕丝脱胶的方法根据丝胶、油脂、蜡质等杂物的性质，脱胶时采用的处理剂不同，将蚕 丝的脱胶分为化学脱胶和酶脱胶两类。 1 2 1 化学脱胶 目前蚕丝的脱胶主要采用化学法，这类方法的主要缺点是脱胶不均匀，除油效果差，丝 纤维的强度损失大，耗水、耗能、污染环境，是一类资源高消费型工艺【4 2 】。化学脱胶具体分 为碱脱胶、皂碱脱胶【4 3 】和酸脱胶三种脚l 。 1 2 1 1 碱脱胶 由于丝胶具有两性性质，加之丝胶蛋白质偏酸性，所以，丝胶在碱性溶液中吸收碱而膨 化溶解，并起水解作用，变成可溶性的氨基酸盐，同时碱也能使纤维上的油脂皂化和中和成 5 两南大学硕+ 学位论文 脂肪酸。因而，用碱脱胶既可脱胶，又可除去油脂。碱脱胶作用强、时间短、成本较低。但 若工艺上处理不当容易损伤丝素。降低丝纤维的强伸度，从而造成炼丝的手感粗糙、光泽、 柔软度较差。 碱脱胶温度一般控制在9 5 一9 8 c ，p h 值在9 1 0 左右。用于脱胶的碱应该对丝纤维的强度、 伸度、光泽的影响要小，脱胶效率高，生产中常用的有碳酸钠( n a 2 c 0 3 ) 、硫酸钠( n a 2 s 0 3 ) 、 氢氧化钠( n a o h ) 、磷酸钠( n a 2 p 0 4 ) 、碳酸氢钠( n a h c 0 3 ) 等【4 5 l 。 在碱脱胶过程中，随着丝胶的水解，溶液中的氨基酸逐渐增加，p h 值减小，脱胶效率减弱。 因此。工艺上必须不断加碱以维持脱胶液p h 值的稳定。但用加碱方法控制p h 值较难掌握，如 果碱液浓度过大，则会损伤丝纤维。为此在生产中，一般用肥皂作缓冲剂，极少单独采用碱 来脱胶。 1 2 1 2 皂碱脱胶 肥皂是一种高级脂肪酸的盐类，在水解时可生成游离碱。由于肥皂有这一特性，常把它 和碱起用于蚕丝的脱胶，当脱胶溶液p h 值减小时，由肥皂分解出的游离碱可起缓冲作用， 便于控制脱胶液的p h 值。肥皂具有表面活性性质，能减小溶液中介质问界面张力，而有助于 脱胶均匀。同时还有乳化作用，能去除丝纤维上的油脂。 皂碱脱胶是一种传统的蚕丝脱胶方法，也是目前生产中主要的蚕丝脱胶方法。它主要是 使丝胶溶胀后再去除。皂碱脱胶后得到的丝纤维。其手感柔软滑爽，富有弹性，光泽好，但 脱胶时闻长，不适用于平幅脱胶。且脱胶后的白色织物易泛黄。皂碱脱胶中，肥皂易与硬水 中的钙镁离子形成皂化物粘附于纤维上，影响纤维的品质和后期加工。 1 2 1 3 酸脱胶 蚕丝的主要成分是蛋白质，过高的碱处理对蚕丝有很大的破坏作用。由于丝胶的两性性 质，酸也可作为脱胶剂，丝胶在酸性溶液中同样能水解成氨基酸，而且，蚕丝在酸性处理条 件下较为安全。 用酸脱胶时，脱胶液的p h 值一般在1 8 - 2 5 时效果最好，采用硫酸或盐酸作为脱胶剂，酸 的浓度较低，在0 0 1 5 - 0 0 2 m o l l ( 0 0 1 5 0 0 2 n ) ，脱胶液温度为9 5 9 7 c ，处理时间在0 - 5 0 m i n 之间。 酸脱胶不易控制，p h 值过高过低都会损伤纤维，且p h 值不易调节删。脱胶时不能除去油 脂杂质，成本较高。蚕丝脱胶后色泽也不太理想，而且生产中有挥发性刺激气味，损伤皮肤、 衣服和设备，因此，生产中极少使用。但由于酸对油脂无乳化作用，对于茧类原料初练用酸， 复练用皂碱，可以避免蛹体中蛹油渗出而染污茧层，也不易生成钙镁皂，脱胶后纤维强力好， 纤维长，制成率高。 1 2 2 酶脱胶 6 第一章文献综述 酶是生物体的细胞分泌出来的，能离开生物体而独立存在，具有特殊的催化作用。它是 一种由生物体合成，又可脱离生物体而存在的球形蛋白质。酶对纤维的作用主要具有两方面 的专一性，即结合的专一性和催化专一性。 根据酶作用最适p h 值不同，把蛋白酶分为酸性、中性和碱性三类。不同类型的酶，脱胶 工艺条件不同，脱胶效果也不同。m l g u l r a j a n i 选用碱性、中性、酸性三类共8 种蛋白酶对丝 线进行脱胶，发现用动物来源的胰蛋白酶和胃蛋白酶脱胶后练减率最低，仅为4 ，其他酶脱 胶后练减率达到2 4 。其中碱性蛋白酶脱胶均匀完全，中性蛋白酶次之，酸性蛋白酶最差；从 脱胶后丝线的强力、手感和光泽来看，碱性蛋白酶最好【4 7 删。 1 2 2 1 酶脱胶的原理及方法 酶脱胶的原理是利用蛋白酶能先与丝胶生成中间物，然后再经水解放出原来的酶，使丝 胶中肽键断裂而水解。适当的蛋白酶可促使丝胶迅速水解，而对于丝素影响较小，不损伤纤 维。 用酶对蚕丝进行脱胶一般分三步进行，即先用纯碱和表面活性剂前处理，使丝胶膨润、 软化，从而使酶容易发生作用。之后进行酶处理，使丝胶分解( 水解) 去除，而不使丝素遭 到损伤，这是利用酶催化的高度专一性。尽管丝素和丝胶都是蛋白质，但组成和结构不同， 前者属线状蛋白质，后者属球状蛋白质，选用的蛋白酶只能使球状蛋白质水解，不能使线状 蛋白质水解，这样达到去除丝胶( 脱胶) 保护丝素的目的。酶处理后，要进行充分水洗，去 除水解产物，最终达到脱胶的目的。 1 2 2 2 酶脱胶的影响因素 酶脱胶中通常考察的影响因子有：酶的用量、脱胶温度、时间、p h 值和浴比等。 t ns o n w a l k a r 以生丝为材料进行酶脱胶，对脱胶的条件进行了优化，得到的最适脱胶条 件是：蛋白酶用量为2 5 9 l ，脱胶温度5 0 c ，脱胶时间为6 0 m i n ，脱胶液p h 值为9 ，浴比为 1 ：4 0 【4 9 】。 mlg u l r a j a n i 用真菌蛋白酶脱胶时发现，酶的浓度和脱胶温度对脱胶的影响较大，时间 对脱胶的影响相对较小，脱胶时间1 h 已足够，延长时间并不能提高脱胶效果【取5 。也有研究表 明，脱胶后的练减率与酶的浓度和作用时间是线性相关的，增加酶浓度，练减率增加；练减 率相同时，增加酶的用量可以减少处理时间隅卯j 。ml g u l r a j a n i 选用8 种蛋白酶对丝进行脱 胶，发现除一种酶的浓度与练减率呈线性相关外，其余的均属二次方程式关系嗍。 1 2 2 3 酶脱胶的优势和不足 酶脱胶的工艺流程需要的条件( 温度、p h 值等) 较温和，脱胶过程对丝素的损伤很小 使蚕丝的优良品质能得到充分保护。酶脱胶后的丝纤维表面更光洁、透明，丝鸣感更强【5 2 1 。 7 西南大学硕七学位论文 量鲁曼量量曼量量曼暑鼍量曼量曼量曼i _ i 皇曼曼曼曼皇曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼量量曼曼曼曼量量 酶用量少，且反应后释放的酶可继续催化另一反应；处理产生的废水可生物降解，因此，减 少了污染，节约了能源。可以说，酶脱胶工艺是一种非常典型的对蚕丝的柔软、抛光和改善 服用性能的加工。酶脱胶弥补了蚕丝化学脱胶法的不足，使生丝品质发生了质的飞跃。目前， 用于脱胶的蛋白酶主要是植物蛋白酶( 如：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶) 以及动物蛋白酶( 如： 胰蛋白酶) 。上述酶类虽有较好的脱胶效果，但其受来源限制，成本高，故很难真正应用于生 产1 5 扪。 1 3 蚕丝酶脱胶的研究现状 蚕丝脱胶酶最初是植物来源酶( 木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶) 和动物来源酶( 胰蛋白酶、 胃蛋白酶) 等 5 4 一卯。由于以上这些酶受来源限制，使用成本较高，在生丝加工的实际生产中 未能得到广泛应用。研究发现：自然界中有大量细菌能分泌碱性蛋白酶，加之微生物具有种类 多，繁殖快，能分泌的胞外酶易收集等特点。所以，人们希望将微生物来源的蛋白质酶用于 生丝生产。随着微生物酶的开发，一些微生物来源的蛋白酶逐渐用于丝的脱胶。由于微生物 酶来源广、种类多，且效果好于动物和植物蛋白酶，因此目前蚕丝的脱胶多用微生物来源的 酶 5 6 - 绷。 2 0 0 5 年，a n n a m a r i as e v e s 5 9 肄人发现，土壤中的细菌能大量在未脱胶的茧丝上生长繁殖， 而对丝素的利用能力较弱。再次证实了微生物能用于脱胶的设想。又有报道枯草芽孢杆菌属 的c a r l s b e r g 和b n p 等能用于蛋白质水解。g i u l i a n of r e d d i 6 0 1 等人分别比较碱性蛋白酶( 3 3 7 4 _ l 2 5 ，g c8 9 7 - h2 4 ) 、中性蛋白酶( 3 2 7 3 - c1 9 ) 和酸性蛋白酶( e 口42 3 1 8 ) 的脱胶效果。 结果表明，作用1 h ，脱胶效果：3 3 7 4 - l ，g c8 9 7 h 3 2 7 3 c e ( = 3 42 3 1 8 其中酸性蛋白的 反应条件接近丝胶等电点，溶解后的丝胶极易再次附着在丝素表面，弱化脱胶效果。 s o o - j i nk i l n ，m i n k y o u n gc h a ，e u nt a e xo h 等人的研究发现，有些微生物产生的蛋白酶 有助于改善纤维品质的。如b a c i l l u ss p s j 1 2 1 ，处理后的蚕丝表面更加光滑，更有光泽，但机 械性能并未下降。当延长酶蚕丝的处理时间到4 8 h ，亦使印染效果加强【n l 。 从缫丝废液中分离获得的p r o t e a s ep 在p h - - 8 4 ，4 3 9 7 ，酶与底物的比为3 ：1 0 0 的条件 下，丝胶的最大水解率能达到1 4 4 3 ，丝胶蛋白质收率为8 2 ，大量得到的分子量为 2 5 0 - 4 0 0 0 d a 多肽表现出很好的抗菌性和阻酪氨酸酶能力嘲。这为蚕丝在非服饰方面的利用提 供了新方法。 以上酶的发现往往通过筛选，因为环境因素而发生自然突变得菌株，该方法虽然简单有 效但周期较长针对性不强。实际研究中也通过人工诱变的方法来提高突变率，缩短筛选时间。 施安辉，靖林，张文千就采用紫外线诱变育种的方法获得产酶量显著提高并能分别作用丝胶 和丝素的诱变株米曲霉c v - 8 1 和芽孢1 1 菌株【矧。 目前已用于蚕丝脱胶的酶主要有z s 7 2 4 、s 1 1 4 、1 3 9 8 中性蛋白酶：2 0 9 、2 7 0 9 碱性蛋白酶 和胰酶【6 4 j ，见表1 6 。 8 第一章文献综述 表1 6 部分蚕丝脱胶酶工艺参数吣6 4 1 t a b l e l 6t h et r e a t m e n tp r o c e s sp a r a m e t e r so fs i l kd e g u m m i n ge n z y m e 9 第二章引言 第二章引言 2 1 研究的目的与意义 蚕丝由7 5 的丝素和2 3 丝胶以及少量蜡、碳水化合物、色素和无机成分等构成。丝胶 包裹于丝素外层对丝素起保护和胶粘作用。通过精炼除去丝胶，蚕丝才能彰显其特有的光泽 和柔滑，在众多纺织纤维中体现出独具的商业价值。 蚕丝精炼的方法主要包括化学精炼法和酶精炼法。化学精炼具体分为碱精炼、皂碱精炼 和酸精炼三种。碱精炼成本低，但炼丝的手感粗糙、光泽、柔软度较差：皂碱精炼中，肥皂 易与硬水中的钙镁离子形成皂化物粘附于纤维上，影响纤维的品质和后期加工；酸精炼不如 碱精炼，p h 值过高过低都会损伤纤维，且p h 值不易调节。 酶精练的工艺流程在常温下进行，精练过程对丝素的损伤很小，使蚕丝的优良品质能得 到充分保护。酶精炼后的丝纤维表面更光洁、透明，丝鸣感更强。可以说。酶精练工艺是一 种非常典型的对蚕丝的柔软、抛光和改善服用性能的加工。酶精炼弥补了蚕丝化学精炼法的 不足，使生丝品质发生了质的飞跃。 目前，用于脱胶的蛋白酶主要是植物蛋白酶( 如：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶) 以及动物 蛋白酶( 如：胰蛋白酶) 。上述酶类虽有较好的脱胶效果，但其受来源限制，成本高，故很难 真正应用于生产。微生物具有种类多、繁殖快、培养条件易控、产酶周期短等优势，故已有 科研工作者尝试利用微生物来源的蛋白酶进行蚕丝脱胶，然而相关研究工作至今未见系统报 道。本研究旨在从环境微生物中分离筛选出脱胶酶的高产菌株，获得工作p h 值范墨较宽、脱 胶时间短、脱胶率较高、对丝素损伤小、最终能广泛应用于实际生产的脱胶酶，并探索该脱 胶酶脱胶的最佳工艺条件 可持续发展已成为当今社会发展的主题。开发无污染、低成本、高效率以及能够提高生 丝品质的精炼工艺，将为该蚕丝产业的发展提供一个全新的平台，同时为2 1 世纪的“丝绸之路” 提供一个新的诠释。 2 2 主要研究内容 2 2 1 蚕丝脱胶酶产生菌的分离、筛