（病原生物学专业论文）黑曲霉木聚糖酶在同源宿主中的分泌性表达及酶学特性研究.pdf

摘要 木聚糖酶( x y l a n a s e ) ，又称b d 一1 ，4 一内切木聚糖酶，是降解木聚糖的 关键酶，它能水解木聚糖主链上的b 一1 ，4 一糖苷键，将木聚糖降解为低聚糖 和木糖，广泛应用于饲料、造纸和食品医药等行业，具有广阔的应用前景。但 木聚糖酶的单位产量较低，是限制木聚糖酶应用的主要因素之一。本研究应用 同源高效表达策略，在丝状真菌表达系统中构建高产的黑曲霉木聚糖酶基因工 程菌。 本课题首先从黑曲霉菌( a s p e r g i l l u sn i g e r ) t s l 菌株中提取总r n a ，以其 为模板运用r t p c r 的方法成功克隆出6 7 8 b p 的木聚糖酶x y n b 基因，将该基因片段 插入融合蛋白基因表达载体p y g l 2 葡萄糖淀粉酶编码基因的下游，融合之处设 计内胰蛋白酶( k e x 2 ) 加工位点，构建融合表达质粒p y g l 2 一x y n b 。测序结果 表明，该木聚糖酶基因序列与a n i g e ri b t - 9 0 木聚糖酶( g e n b a n ka c c e s s i o n a y 5 3 6 6 3 9 ) 基因序列具有9 9 4 的同源性，有4 个碱基的差异，仅一个碱基的突 变导致氨基酸改变，编码的蛋白质序列同源性达9 9 5 。随后运用原生质体转 化法将p y g l 2 一x y n b 转化尿嘧啶缺陷型宿主黑曲霉菌m 5 4 ，获得重组菌株。 s d s p a g e 结果表明，重组木聚糖酶在转化菌株中获得了高效分泌性表达，其分 子量约为2 1 k d 。在1 木聚糖为诱导物的培养条件下，重组菌分泌的木聚糖酶酶 活有明显提高，最高酶活达5 0 7i u m l ，分别是原始出发菌和宿主菌的6 7 倍和 3 8 9 倍。对获得的转化子进行连续传代培养结果表明，重组菌生长特性十分稳 定，具有良好遗传稳定性。重组菌最佳产酶时间为培养后7 2 h ，最适反应p h 为5 2 ， 属酸性木聚糖酶：最适反应温度为5 0 ，在5 0 - 6 0 之间热稳定性较好，6 0 保温3 0 m i n 后残余酶活为6 3 9 5 。 本实验首次运用同源表达的策略，将黑曲霉木聚糖酶基因在同源丝状真菌 中表达。研究结果表明，木聚糖酶在重组黑曲霉中获得了高效分泌性表达。重 组菌发酵周期短，产酶活性高，具有重要的应用前景，为酸性木聚糖酶的广泛 应用奠定了一定基础。 关键词：酸性木聚糖酶黑曲霉同源表达酶学性质 a b s t r a c t x y l a n ，c o m p o s e do fp o l y s a c c h a r i d ec o n t a i n i n g1 3 一l ，4 - 1 i n k e dd x y l o p y r a n o s i d e r e s i d u e s ，i s o n eo ft h e m a j o rc o m p o n e n t so fp l a n tc e l lw a l l s e n d o - 1 3 - 1 ， 4 - x y l a n a s e ( e c 3 2 1 8 ) d e g r a d e s t h eb a c k b o n eo f b - 1 ，4 - l i n k a g e s o f x y l o s e x y l a n a s ei sw i d e l ya p p l i e di na n i m a lf e e d ，m e d i c i n e ，f o o dp r o c e s s i n ga n dp a p e r m a n u f a c t u r i n g h o w e v e r , t h el o wy i e l do fx y l a n a s eb e c o m e sal i m i t i n gf a c t o rt ot h e u s eo fx y l a n a s ei nv a r i o u si n d u s t r i e s t h ea i mo fm ys t u d yi st oc o n s t r u c tah i g hl e v e l x y l a n a s er e c o m b i n a n ti nf i l a m e n t o u sf u n g a le x p r e s s i o ns y s t e m t h ee d n ae n c o d i n gt h ea c i d i cx y l a n a s ef r o mo d g i n a la n i g e rt s1w a s a m p l i f i e db yr t - p c ra n dc l o n e di n t ot h ee u k a r y o f i ce x p r e s s i o nv e c t o rp y g 1 2u n d e r t h ec o n t r o lo ft h eg l a ap r o m o t e r t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r et r a n s f o r m e di n t o p y r gd e f i c i e n ta n i g e rm 5 4h o s ts t r a i nb yp r o t o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nt e c h n o l o g y t h i s h o m o l o g o u se x p r e s s i o ns y s t e me x p r e s s e dx y l a n a s ea c t i v i t yo f5 0 7i u m lw h i c hw a s m e a s u r e di ns h a k e f l a s kc u l t u r e sc o n t a i n i n gl x y l a n t h i sa c t i v i t yw a s6 7 - f o l da n d 3 8 9 - f o l dh i g h e rt h a nt h ea c t i v i t yf o rt h eo r i g i n a ls t r a i na n dh o s ts t r a i nr e s p e c t i v e l y t h em a x i m u mx y l a n a s ea c t i v i t yw a so b t a i n e da f t e rc u l t u r i n gf o r7 2h o u r sa n dt h e x y l a ni n d u c e de n z y m a t i ca c t i v i t yw a s3 9 4 - f o l dh i g h e rc o m p a r e dt on o n - i n d u c e d c o n d i t i o n 1 1 1 eo p t i m u m p ho f r e c o m b i n a n tx y l a n a s ew a s a t5 2 w h e r e a st h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ew a sa t5 0 0 ca n dr e m a i n e dm o r et h a n6 3 9 5 a c t i v i t ye v e na f t e r i n c u b a t i o na t6 0 0 cf o r3 0 m i n i t st h ef i r s tt i m et h a th i g hs e c r e t i n ge x p r e s s i o ns y s t e mw a sc o n s t r u c t e du s i n ga h o m o l o g o u se x p r e s s i o np r o c e s si nf i l a m e n t o u sf u n g u s t h ep r o m i s i n gr e s u l t s a c h i e v e di nt h i ss t u d ym a yh a v eag o o di n d u s t r i a lp e r s p e c t i v ee s p e c i a l l yi nt h ea n i m a l f e e d k e y w o r d s ：a c i d i c x y l a n a s e a s p e r g i l l u sn i g e rh o m o l o g o u se x p r e s s i o n e n z y m i cp r o p e r t i e s i i 缩写词 a m p a p b i s a c y b p b s a d n a d n t p d t t e b e c o l i e d t a g l a a l b m e s o d p a g e p b s p c r p e g p i p e s r n a s d s t a e t c a t e m e d t r i s 缩写词表 英文中文 a m p i c il1 i n氨苄青霉素 a m m o n i u mp e r s u l f a t e过硫酸铵 b i s a c r y l a m i d e双丙烯酰胺 b a s ep a i r ( s ) 碱基( 对) b o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核苷酸 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e脱氧核苷三磷酸 d it h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e t h id i u mb r o m id e 溴化乙锭 e s c h e r ic h i ac o li大肠埃希菌 e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 g l u c o a m y l a s e e n c o d i n gg e n e葡萄糖淀粉酶 l u r i a b e r t a n im e d i u ml b 培养基 2 - m o r p h o l i n ee t h a n es u l f o n i ca c i d2 一吗啡啉乙磺酸 o p t i c a ld e n s i t h光密度值 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l in e 磷酸盐缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链反应 p o l y e t h y l e n eg l y c o l聚乙二醇 p i p e r a z i n e n ，n 一b i s 一( 2 一 哌嗪一n ，n 一双( 2 一乙 e t h a n e s u l f o n i ca c i d ) 磺酸) r i b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 s o d i u md o d e c y ls u lf a t e 十二烷基硫酸钠 t r i s a c e t a t e ( b u f f e r ) t r i s 乙酸电泳缓冲液 t r i c h l o r o - - a c e t i ca c i d三氯乙酸 n ，n ，n ，n 一 n ，n ，n ，n 一四甲基 t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e乙二胺 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e三羟甲基氨基甲烷 t r is - h c l d e p c p c i t r i s h y d r o c h l o r i d et r i s 一盐酸 d it h y lp y r o c a r b o n a t e 焦磷酸二乙酯 p h e n o l 、c h l o r o f o r m 、is o a m y la l c o h o l 苯酚氯仿异戊醇混合物 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位 论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开 发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的 法律责任由本人承担。 签名：新孑务踊 d l 卯6 年5 月c 乡日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提 供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国 家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目 的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活 动。 学位论文作者签名：丕7 佛缃 莎叻6 年5 月p 6 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在一年解密后适用本授 髀0 力愀彦撇一虢爱f 浼桶 泖多年5 月莎多日出刀6 年6 月o ) 6 日 第1 章前言 第1 章前言 木聚糖( x y l a n ) 是一种多聚五碳糖，由主链和侧链构成。它的主链由多个b - - d - p 比喃型木糖残基通过b - 1 ，4 一糖苷键相连而成，侧链上主要是多种不同大小 的短取代基如乙酰基、葡萄糖醛酸基、l 一阿拉伯糖残基、阿魏酸等。这些侧链 基团与植物细胞中其它几种结构性多糖如木质素、纤维素、果胶等以共价或非共 价键连接，组成植物细胞的细胞壁，占细胞干重的3 5 。木聚糖是植物半纤维素 的重要组成部分，富含于玉米芯、麦麸、米糠、秸秆、甘蔗渣等农业副产物中， 是一种重要的可再生资源i l j 。 木聚糖酶是一组可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的复合酶系。木聚糖分子结 构复杂，含有许多不同的取代基，因此，木聚糖的生物降解就需要一个复杂的酶 系统中各种酶共同作用，才能将其转化为基本单糖。其中，木聚糖酶 ( x y l a n a s e ，e c 3 2 1 8 ) 又称1 3 一d 一1 ，4 一内切木聚糖酶，是木聚糖降解酶系中 最关键的酶，同时也是目前人们研究最多了解最深入的木聚糖降解酶。该酶以内 切的方式水解木聚糖主链上的b d 一1 ，4 一木糖苷键，产生木寡糖和木糖【2 、3 】。 水解侧链的酶主要有a - l 一阿拉伯呋喃糖苷酶，a 一葡萄糖醛酸酶等，对这些 酶的研究相对较少。 b d l ，4 一内切木聚糖酶在自然界中分布十分广泛。在海洋及陆地细菌、 海洋藻类、真菌、酵母、反刍动物瘤胃细菌、甲壳动物、陆地植物组织和各种无 脊椎动物中都存在该酶。己报道的能产木聚糖酶的微生物有细菌、链霉菌、曲霉 菌、青霉菌、木霉菌等。人们研究和应用最多的是细菌、曲霉菌和木霉菌产的木 聚糖酶，尤其是丝状真菌木霉属和曲霉属中的木聚糖彰训。 不同来源木聚糖酶分子结构差异很大，有的为单区域酶，只含有催化结构域 ( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) ，有的为多区域酶，除催化区域外还含有纤维素结合域 ( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 、木聚糖结合域( x y l a n - b i n d i n g d o m a i n ，x b d ) 和连接序列( l i n k e rs e q u e n c e ) 掣副。在理化性质方面，不同生 物来源的木聚糖酶差异也很大，细菌产生的木聚糖酶热稳定性一般强于真菌所产 生的木聚糖酶，尤其是目前倍受关注的嗜热菌。真菌中，曲霉、木霉等都能产生 木聚糖酶，曲霉所产木聚糖一般偏酸性，最适p h 值大多在2 - 6 之间，活性通常 高于细菌木聚糖酶i z j 。 在自然界中，木聚糖酶具有相当广泛的生物学功能。首先，土壤微生物分泌 的木聚糖酶，通过生物降解作用，参与土壤中植物残体的分解，促进可利用碳资 源的释放，构成地球碳循环的重要一环。其次，对于反刍动物来说，植物细胞壁 第l 章前言 结构中的半纤维素占反刍动物口粮的4 0 9 6 ，通过瘤胃微生物群产生的木聚糖酶分 解半纤维素的木聚糖酶，获取能量。 此外，木聚糖酶还具有多方面的潜在应用价值，木聚糖酶可广泛用于食品、 饲料、医药、造纸、纺织等行业【6 】。在饲料工业中，添加木聚糖酶可充分破坏植 物细胞壁，大大提高饲料的利用率；在纸浆造纸工业中，传统的纸浆漂白使用氯 气和二氧化氯等，排放的废水中含有大量有毒、强致癌致畸物，造成严重环境污 染，使用木聚糖酶对纸浆进行预处理可大大降低含氯化合物的用量，有效降低环 境污染；在食品工业中，木聚糖酶降解各种天然食物中的半纤维如甘蔗渣、玉米 芯等，得到水解产物低聚木糖，该糖甜度是蔗糖的4 0 ，难消化、低热卡不易 导致肥胖，可制成不同甜度的食品作为糖尿病或肥胖症患者的甜味剂；面包生产 过程中应用木聚糖酶水解面粉中的木聚糖可有效改善面包的质地，提高松软度和 延长保质期。对木聚糖酶及其基因的研究引起了国内外科学工作者的广泛关注， 目前已成为酶学研究领域中的一个重点对象。 应用于不同领域的木聚糖酶所需具备的理化性质是有差别的，木聚糖酶的酶 学性质决定了其在应用上的潜力及应用领域。例如，瑞氏木霉、变铅青链霉菌所 产木聚糖酶偏碱性，因此多用于纸浆造纸工业【7 】；而在饲料工业中所需要的是在 酸性到中性的条件下均能维持高活性的酸性木聚糖酶，饲用木聚糖酶作用场所是 在动物的胃肠道中，需要木聚糖酶在p h2 5 5 5 的条件下具有较高酶活性。一 般真菌产的木聚糖酶都是在酸性条件下活力得到最大发挥，其中丝状真菌黑曲霉 所产木聚糖酶的最适p h 值范围多在2 6 的酸性区域，多为酸性木聚糖酶，这一 特性尤其适合于饲料工业，而且丝状真菌产木聚糖酶的水平一般比酵母和细菌 高，所产木聚糖酶为胞外酶，便于酶的分离提取。 研究表明，富含于饲料中的木聚糖是一种重要的抗营养因子，难以被单胃动 物消化，同时还能结合大量的水，使采食动物消化道中食糜的体积增大、粘度增 加，从而降低了消化道中内源性消化酶对食糜的消化作用，阻碍了营养物质，尤 其是脂肪和蛋白质的消化吸收，使饲料的利用率大大降低。饲料中如果添加木聚 糖酶，就可显著降低木聚糖分子大小，将其分解成较小聚合度的低聚木糖，从而 改善饲料性能，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。m a r q u a r d t 等在以 小麦或燕麦为基础的肉鸡饲粮中添加含木聚糖酶的酶制剂，饲料转化率分别提高 了6 0 2 和2 3 0 ，汪敬等在饲料中添加富含木聚糖酶的酶制剂，使2 3 3 8 k g 的生 长猪日增重和饲料转化率提高7 8 和4 3 。由此可见，木聚糖酶在饲料资源开 发和提高廉价副产品的利用率方面具有重要作用，应用前景广阔。 我国是一个养殖业大国，饲料产量位居世界第二。然而我国饲料资源并不丰 富，利用生物技术提高饲料的利用率，特别是低质饲料的利用率，极为重要。农 2 第i 章前言 业部第1 0 5 号公告制定的允许使用的饲料和饲料添加剂品种目录上，已将木 聚糖酶列入饲料级酶制剂。 目前，木聚糖酶的生产和应用主要集中在国外，欧洲国家的饲料中9 0 以上 添加了木聚糖酶，木聚糖酶在饲料中的应用效果已得到公认。国内也有一些饲料 厂生产木聚糖酶，但由于产量低成本高，多限于自用，大规模的应用尚未实现。 到目前为止，我国对该酶的研究偏重于产酶天然优良菌株的筛选、诱变、酶的纯 化、性质分析及其作为饲料添加剂应用效果的探讨等方面。很多单位如华中农业 大学、东南大学、山东大学、中国农科院广东畜牧研究所等筛选到的黑曲霉f 2 7 ， a 3 、里氏木霉、耐碱性芽抱杆菌a 3 等菌株，都是传统的筛选诱交的成果，具有 良好的产酶性能并在发酵中加以应用，如陈红歌【s l 等通过筛选得到高产木聚糖酶 黑曲霉菌株，经过优化产酶条件得到木聚糖酶酶活达3 7 5 2i u m l 。但多年的试 验表明，从自然界筛选优良菌株，工作量巨大，劳动成本高，而且筛选的优良菌 株或是优良菌株的突变株特别是高产真菌，在进行发酵时存在酶系不单一，容易 回复突变等诸多问题。木聚糖酶在饲料行业中的应用仍面临产量低、成本高、耐 热性及抗酸性酶难于获得等问题，阻碍了木聚糖酶的广泛应用。随着对产木聚糖 酶菌株的分子生物学和遗传学的深入研究，利用基因工程手段，构建高表达优良 性能木聚糖酶的工程菌，为木聚糖酶的发展提供了另一条有效的技术途径。 目前，已有近百种不同菌株的木聚糖酶基因被克隆或表达出来，其中细菌 来源的木聚糖酶克隆较多，而真菌来源的木聚糖酶克隆很少。这些研究多采用大 肠杆菌为宿主菌【9 1 0 】，也有的以酵母、木霉等真核生物为受体细胞1 1 1 1 。为了进一 步提高表达水平，人们还在不断尝试新的基因、新的表达系统，并使用具有高效 表达启动子的载体构建新型高效表达基因工程菌。 曲霉菌表达系统属于丝状真菌表达系统，传统上一直用于食品和工业用酶的 生产。在外源蛋白表达方面，丝状真菌作为基因工程的受体菌具有优越于大肠杆 菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 和酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 系统的独特优点 1 2 1 ，大肠杆菌在高表达外源基因时容易产生包涵体，且缺少一些真核细胞的翻 译后修饰机制，所以大肠杆菌作为表达宿主很难直接得到有活性的蛋白。酵母合 成的蛋白虽然可以外泌但分泌能力较弱，且往往产生过度糖基化，因此表达高等 真核生物基因时，产生有活性的蛋白质比较困难。丝状真菌作为生产外源蛋白的 表达系统可弥补细菌及酵母的不足，首先，丝状真菌具有很强的外分泌蛋白的能 力，其次，丝状真菌能对合成的真核蛋白较正确地进行各种翻译后加工，包括肽 链的剪切和糖基化等，加之丝状真菌糖基化形式较酵母更类似于高等真核生物， 发酵工艺及下游加工技术成熟，可避免许多原核表达系统重组蛋白生产相关工艺 专利的限制，具有良好的工业生产基础u 叭。 3 第l 章前言 黑曲霉菌( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 是一种不产生黄曲霉毒素的安全丝状真菌， 已被美国f d a 和世界卫生组织认定为是安全的生产菌株，为表达医用蛋白质的优 先可接受的宿主菌，因此，运用它作为外源基因的表达系统受到国内外研究人员 的很大重视。黑曲霉菌表达系统在表达外源蛋白时表达的外源性蛋白有较好的糖 基化特性，分泌途径中存在分子伴侣，常能帮助蛋白正确折叠l l4 。，因此黑曲霉 菌能分泌出有真正活性的成熟蛋白。但曲霉菌表达系统在表达外源性蛋白时，真 菌源性外源性蛋白产量较高，非真菌源性的异源性蛋白质产量水平相对低下。可 能是在异源表达的过程中目的蛋白容易发生错误折叠或者容易被内源蛋白酶降 解，为尽量避免这些不利因素以提高表达量，国内外一些研究者采用同源表达的 策略，取得了一些可喜的成果，2 0 0 3 年a s t h e r t l 5 j 利用同源表达的策略将黑曲霉来 源的阿魏酸酯酶f a e a 基因在黑曲霉菌中进行表达，优化培养条件，表达量较原始 菌株提高2 4 5 倍，达l g l ；2 0 0 4 年a n t h o n yl e v a s s e u r 1 6 j 利用同样的方法表达黑曲 霉菌b r f m l 3 1 的阿魏酸酯酶f a e b 基因，表达量同样提高1 6 倍；国内中科院刘伟 丰u7 j 等人亦采用同样的策略将短小芽孢杆菌耐碱性木聚糖酶基因在同源宿主中 表达，重组菌最高产酶活性较原始菌提高了8 7 。 本实验室曾通过紫外线照射致突变法【l8 j 获得乳清酸核苷一5 一磷酸脱羧酶 ( p y r g ) 基因缺陷株黑曲霉m 5 4 ，同时从黑曲霉菌a t c c l 2 0 4 9 野生型菌株的基因文 库中克隆到了p y r g 基因，构建了含该基因的曲霉菌表达质粒载体p y g l 2 1 1 9 1 ，在 此基础上构建了以p y r g 基因为选择性标记，该基因缺陷株黑曲霉m 5 4 为受体菌的 表达系统。本课题在上述工作的基础上，运用同源表达的策略，从黑曲霉菌t s l 中克隆出适合饲料工业应用的酸性木聚糖酶基因，再在同源宿主黑曲霉菌m 5 4 中进行表达，以期获得可高效表达木聚糖酶的基因工程菌。 4 第2 章仪器和材料 2 。1 仪器及物品 第2 章仪器和材料 超净工作台 台式离心机 i 5 0 i 7 0 奥林巴斯倒置相差显微镜 m e g f u g e l o r 高速冷冻离心机 b i o f u g e l 5 r 高速冷冻离心机 p c r 仪 7 5 6 m c 紫外分光光度计 z f - 9 0 型多功能暗箱式紫外投射仪 m i l l i - q 纯水制各装置 m e t tl e ra e 2 4 0 电子天平 s h z - b 水浴恒温振荡器 f d 2 0 1 稳压电泳仪 d y c z 一2 4 d 型垂直板电泳槽 1 0 0 1 1l 微量进样器 2 2 菌株和质粒 e c o l id h 5q ： 黑曲霉t s l ： 黑曲霉m 5 4 ： p y g i 2 表达质粒： 5 上海净化设备厂 h e r a e u s 公司 o l y m p u s 公司 h e r a e u s 公司 h e r a e u s 公司 b i o m e t r a 公司 b e c k m a r l 公司 上海顾村电光仪器厂 m i l l i p o r e 公司 m e t t l e r 公司 上海跃进医疗器械厂 上海医用分析仪器厂 北京市六一仪器厂 上海高鸽工贸有限公司 由同济大学生物化学教研室提供 同济医院皮肤性病实验室提供， 作为酸性木聚糖酶基因的来源 由本实验室构建保存，是一种尿 苷缺陷菌株，作为本试验的表达 宿主 由本实验室构建保存 第2 章仪器和材料 2 3 试剂及溶液 2 3 1 主要试剂 1 t r i z o l 试剂 2 d e p c 3 r n a s ei n h i b i t o r 4 d n a s ei 5 p c i 6 逆转录酶 7 e xt a q p y r o b e s td n ap o l y m e r a s e 8 。d n am a r k e r 9 质粒小量提取试剂盒 1 0 h p a i 和x b a i 限制性核酸内切酶 1 1 t 4 d n a 连接酶 1 2 胰蛋白胨 1 3 尿嘧啶核苷 1 4 l y w a l l z y m e 1 5 b s a 1 6 d s o r b i t o l 1 7 p e g 6 0 0 0 1 8 丙烯酰胺 1 9 甲叉双丙烯酰胺 2 0 过硫酸铵 2 1 考马斯亮蓝 2 2 s d s 2 3 t e m e d 2 4 低分子量蛋白m a r e k e r 2 5 木聚糖 2 6 木糖 2 7 3 ，5 一二硝基水杨酸 2 8 酒石酸钠 2 9 酚 3 0 无水亚硫酸钠 6 i n v i r o g e n 公司 a m r e s c o 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 s i g m a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 u g e n e 公司 m b i 公司 m b i 公司 o x o i d 公司 s i g m a 公司 广东工业微生物研所 华美公司 a m r e s c o 公司 m e r c k 公司 a m r e s c o 公司 a m r e s c o 公司 a m r e s c o 公司 a i i l r e s c o 公司 a m r e s c o 公司 a m r e s c o 公司 m b i 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 国药集团 国药集团 国药集团 国药集团 第2 章仪器和材料 2 3 2 培养基及主要溶液配制 1 0 1 的d e p c 水：取d e p c 试剂l m l 溶于1 l 去离子水中，3 7 保温1 2 h ， 1 2 1 高压灭菌1 5 m i n 。 2 1 琼脂糖凝胶：琼脂糖4 0 0 m g ，双蒸水3 9 2 m l ，5 0 x t a e o 8 m l ，混匀 加热至溶解，稍冷却后加入朗1ug ，插梳倒板。 3 5 0 ) t h e 电泳缓冲液：称取t r i s2 4 2 9 ，n a e e d t a 2 h e o3 7 2 9 ，加冰醋 酸5 7 1 m l ，用蒸馏水定容至l o o m l 。 4 l b 液体培养基：细菌培养用胰化蛋白胨1 0g ，细菌培养用酵母提取物5g ， n a c l1 0g ，加去离子水至8 0 0m l ，搅拌，使溶质完全溶解，用5mn a o h ( 约0 2 m 1 ) 调节p h 值至7 4 ，加入去离子水至总体积为1l ，1 5 磅灭 菌2 0m i n 。 5 l b 固体培养基：l b 液体培养基按照1 5 的浓度加入琼脂粉，1 5 磅灭菌 2 0m i n ，置室温下待温度降至5 0 左右时倒板，或按5 0 1 0 0ug m l 的 浓度配制含氨苄青霉素的平板，置于4 保存。 6 0 5m o l 1 的p i p e s ( p h 6 7 ) ：将1 5 1gp i p e s 溶于8 0m 1 双蒸水中， 用5m o l lk o t t 调p h 值至6 7 ，最后定容至1 0 0m l ，0 2 2l lm 孔径滤膜 过滤除菌，分装后于- - 2 0 保存。 7 i n o u e 转化缓冲液：将m n c l 2 4 h 2 01 0 8 8g ，c a c l 2 2 h 如2 2g ， k c l1 8 6 5g ，溶于8 0 0m l 双蒸水中，然后加2 0m l0 5 m o l l 的p i p e s ( p h 6 7 ) ，加双蒸水定容至ll 。0 2 2um 孔径滤膜过滤除菌。分装后于 - - 2 0 保存，用前冰上预冷。 8 2 5 x m ns a l t s ：称取固体硝酸钠3 7 5g ，氯化钾3 2 5g ，磷酸二氢钾 9 5g ，加双蒸水至2 5 0m l 。 9 1 0 0 0xt r a c ee l e m e n t s ：按顺序加入双蒸水8 0m l ，七水合硫酸锌2 2g ， 硼酸1 1g ，四水合氯化锰0 5g ，七水合硫酸亚铁0 5g ，六水合氯化 钴0 1 7g ，五水合硫酸铜0 1 6g ，钼酸钠0 1 5g ，e d t a 二钠5 9 ( 忽略 沉淀和颜色变化) 。煮沸，冷却到6 0 ，用浓氢氧化钾调p h 到6 5 ，冷 却到室温，加双蒸水至1 0 0m l 。 1 0 a c mv i t a m i n s ：称取对氨基苯酸4 0 0 m g ，盐酸硫胺5 0 m g ，生物素l m g ，肌 醇4 0 0 m g ，尼克酸l o o m g ，泛酸钙2 0 0 m g ，吡哆醇2 5 0 m g ，核黄素l o o m g ， 溶解在双蒸水中，定容至1 l 。 11 t r a c ee l e m e n t s ：称取十水合硼酸钠4 0 m g ，五水合硫酸铜4 0 0 m g ，六水 合三氯化铁8 0 0 m g ，二水合硫酸锰8 0 0 m g ，七水合硫酸锌8 9 ，钼酸钠8 0 0 m g ， 溶解在双蒸水中，定容至l l 。 7 第2 章仪器和材料 1 2 a c ms a l t s ：称取氯化钾2 6 9 ，七水合硫酸镁2 6 9 ，磷酸二氢钾7 6 9 ，t r a c e e l e m e n t s5 0 m l ，溶解在双蒸水中，定容至1 l 。 1 3 5 0 x m g s 0 4 ：称取m g s 0 4 7 h 2 06 5g ，加d dh ：o 至2 5 0 m l ，高压灭菌。 1 4 1 mp h o s p h a t eb u f f e r ：称取十二水合磷酸氢二钠2 4 5 3 2 9 ，二水合磷酸二 氢钠4 9 1 4 9 ，溶解于适量双蒸水调p h 至6 5 ，定容至l o o m l ，高压灭菌， 4 。c 保存。 1 5 1 m 柠檬酸一柠檬酸钠b u f f e r ：称取柠檬酸钠2 6 9 1 9 ，柠檬酸1 7 8 6 9 ， 加适量双蒸水溶解，调p h 至6 5 ，定容至l o o m l ，高压灭菌，4 保存。 1 6 a c m ( s ) n p ：称取可溶性淀粉l o g ，蛋白胨2 9 ，酸水解酪素1 5 9 ，氯化铵 5 9 ，加适量双蒸水溶解，量取a c ms a l t s2 0 m l ，a c mv i t a m i n sl o m l ，1 m p h o s p h a t eb u f f e r5 0 m 1 ，1 m 柠檬酸一柠檬酸钠b u f f e rlo o m l ，充分混 匀调p h 至6 5 ，加双蒸水定容至1 l ，高压灭菌，4 。c 保存。 1 7 州+ u r ib r o t h ( 含尿嘧啶) ：取2 5 x m ns a l t s1 6m l ，1 0 0 0 x t r a c e e l e m e n t s0 4m l ，葡萄糖6g ，酸水解酪素0 4g ，尿嘧啶核苷o 4g ， 溶解在适量双蒸水中，用浓n a o h 调p h 到6 5 ，加双蒸水至3 9 2m l ，高 压灭菌后，加8m l 无菌的5 0 x m g s 0 4 。 1 8 洲+ u r ib r o t h ( 不含尿嘧啶) ：取2 5 x m ns a l t s1 6m l ，1 0 0 0 x t r a c e e l e m e n t s0 4m l ，葡萄糖6g ，酸水解酪素o 4g ，溶解在适量双蒸水 中，用浓n a o h 调p h 到6 5 ，加双蒸水至3 9 2m l ，高压灭菌后，加8m l 无菌的5 0 x m g s 0 4 。 1 9 菌丝体洗液：称取4 4 4g 七水硫酸镁，溶解于适量双蒸水，定容至3 0 0 m l ， 高压灭菌，4 保存。 2 0 删b u f f e r ：称取m g s o 。7 h ：05 9 1 5g ，m e s0 8g ，加双蒸水1 5 0 m l 溶 解，调节p h 值到5 8 ，再加双蒸水定容至2 0 0 m l 。高压灭菌，室温保存。 2 1 n mb u f f e r ： 称取n a c l2 9 2 5 9 ，m e s2 1 3 2 9 ，加双蒸水4 0 0 m l 溶解，调 节p h 值到5 8 ，再加双蒸水定容至5 0 0 m l 。高压灭菌，室温保存。 2 2 1 y v a ll z y m e ：新鲜配置，称取0 2g 溶解于酶稀释液中，先后通过0 4 5 um 和0 2 2i im 滤膜滤过除菌。 2 3 b s a ： 新鲜配置，在酶稀释液中的浓度为1 2m g m l ，0 2 2pm 滤膜滤过 除菌。 2 4 酶稀释液：称取氯化钠3 5 9 ，氯化钙0 1 1 9 ，蔗糖1 9 溶解于l o o m lp h5 8 的磷酸盐缓冲液中，高压灭菌，4 保存。 2 5 s t c - 称取山梨醇6 5 6g ，t r i sb a s e0 3 6g ，c a t l 2 2 h 2 02 2g ，先溶 于2 5 0m l 双蒸水中，用浓h c l 调p h 值至7 5 ，再用双蒸水定容至3 0 0m l ， 8 第2 章仪器和材料 高压灭菌，4 保存。 2 6 洲+ s o r b 琼脂平板：2 5 m ns a l t s 4 0m l ，1 0 0 0 t r a c ee l e m e n t slm 1 ， g l u c o s e1 0g ，s o r b i t o l2 1 8 6 4g ，先加入d d h 2 09 0 0m l ；浓n a o h 调 p h 值至6 5 ；加入1 5g 琼脂；加双蒸水至9 8 0m l ；高压灭菌，加入无菌 的5 0 m g s 0 42 0m l ，冷却后倒板。 2 7 3 0 ( w v ) 丙烯酰胺溶液：戴口罩手套在通风柜中称取丙烯酰胺2 9 9 ， n n 、一亚甲双丙烯酰胺1 9 ，加热溶解于6 0 m l 双蒸水，定容至l o o m l ，0 4 5 um 滤膜过滤，置棕色瓶，4 保存。 2 8 1 5 mt r i s h c l ( p h 8 8 ) 溶液：称取t r i s1 8 1 6 5 9 ，溶解于7 0 m l 双蒸水， 用浓h c l 调p h 至8 8 ，加双蒸水定容至l o o m l 。 2 9 o 5 mt r i s h c l ( p h 6 8 ) 溶液：称取t r i s6 0 5 9 ，溶解于7 0 m l 双蒸水，用 浓h c l 调p h 至6 8 ，加双蒸水定容至l o o m l 。 3 0 1 0 s d s 溶液t 戴口罩帽子在通风柜中称取电泳级s d sl o g ，溶解于9 0 m l 双蒸水，加热至6 8 助溶，用浓h c l 调p h 至7 2 ，再加双蒸水定容至 l o o m l 。 3 1 1 0 过硫酸铵溶液：称取过硫酸铵o 1 9 ，溶解于l m l 双蒸水，临用新配。 3 2 5 t r i s 一甘氨酸电泳缓冲液：称取t r i s1 5 1 9 ，甘氨酸9 4 9 ，s d s5 9 ， 溶解于7 0 0 m l 双蒸水中，再定容至1 l 。 3 3 2 x 凝胶加样缓冲液：量取o 5 mt r i s h c l ( p h 6 8 ) 2 m l ，甘油2 m l ，1 0 s d s4 m l ，0 1 溴酚蓝0 5 m l ，2 一巯基乙醇l m l ，双蒸水2 5 m l 混匀， 一2 0 保存。 3 4 s d s - - p a g e 染色液：称取0 2 5 9 考马斯亮蓝r 2 5 0 ，溶解于4 5 m l 无水乙醇， l o m l 乙酸，4 5 m l 双蒸水的混合液中，用w h a t m a n l 号滤纸过滤，置棕色 瓶备用。 3 5 s d s - - p a g e 洗脱液t 量取无水乙醇4 5 m l ，乙酸l o m l ，双蒸水4 5 m l ，混匀。 3 6 1 2 分离胶( 1 0 m 1 ) ：双蒸水3 3 m l ，3 0 丙烯酰胺溶液4 m l ，1 5 m t r i s h c l ( p h 8 8 ) 2 5 m l ，1 0 s d s0 1 m l ，1 0 a p0 1 m l ，t e m e d4i jl 。 3 7 5 浓缩胶( 5 m 1 ) ：双蒸水3 ，4 4 m l ，3 0 丙烯酰胺溶液0 8 3 m l ，0 。5 m t r i s h c l ( p h 6 8 ) 0 6 3 m l ，1 0 s d s0 0 5 m l ，1 0 a p0 0 5 m l ，t e m e d5u l 。 3 8 1 木聚糖溶液：精确称取1 0 0 0 0 9 木聚糖纯品，溶解于8 0 m lp h5 5 的 磷酸盐缓冲液中，水浴加热至溶，冷却后转入l o o m l 容量瓶中，定容至 刻度，4 保存，3 d 内使用有效。 3 9 1 木糖标准溶液t 称取预先于1 0 5 干燥至恒重的木糖1 0 0 0 9 ，精确至 9 第2 章仪器和材料 0 0 0 0 1 9 ，溶解于适量双蒸水，再定容至l o o m l ，即为1 浓度的木糖标 准溶液。 4 0 d n s 试剂：称取3 ，5 一二硝基水杨酸6 9 ，氢氧化钠2 0 9 ，酒石酸钠1 8 2 9 于5 0 0 m l 双蒸水中，充分搅拌，再加入酚5 9 ，无水亚硫酸钠5 9 ，加热搅 拌使完全溶解至澄清，放至常温冷却并定容至1 l ，置棕色试剂瓶，暗处 保存一周后使用。 l o 第3 章方法 第3 章方法 3 1t riz ol 提取黑曲霉菌t s l 总r n a 用接种环接种黑曲霉菌t s l 于a c m n p 固体斜面培养基，3 0 培养 4 5 d ，待斜面长满黑色孢子后，用l m l0 1 t w e e n 2 0 冲洗斜面， 将孢子悬液转入a c b t n p 液体培养基，3 0 ，2 0 0 r p m ，培养2 4 h 。 用滤纸过滤a c m n p 培养液中的菌丝体，后用菌丝体冲洗液冲洗2 次，双蒸水冲洗2 次收获新鲜菌丝体，充分脱水后放入