（光学专业论文）利用光谱技术研究xrays与hep2细胞的相互作用.pdf

郑州大学硕士学位论文中文摘要 摘要 光谱技术是一种高度灵敏的检测手段，是精确地分析和了解物质结构、成 分及其含量行之有效的方法，适合于对生物分子和细胞状态以及分子所处微环 境的物理化学特性进行研究，目前国内外利用光谱技术在物理、化学、生物医 学工程、食品等众多领域都做出很多有意义的成果。x - r a y s 是一种短波长的电 磁波，与肿瘤细胞作用后会引起细胞内蛋白质、脂类、核酸等生物大分子的损 伤与修复，同时还会启动肿瘤细胞内的某些凋亡机制，诱导肿瘤细胞自然凋亡。 因此x - r a y s 一直被广泛应用于肿瘤的放射治疗，但就临床上来讲，目前在肿瘤 的放疗的放射剂量上还没有一个十分科学的依据，往往依据于医生的经验，有 较大的主观性。本文对经过受不同剂量x - r a y s 照射的人上皮样喉癌细胞( h e p 2 ) 及其培养过该受照细胞的培养基( r p m l l 6 4 0 + 1 0 胎牛血清) 的吸收光谱进行了 研究，利用流式细胞术对经不同剂量x - r a y s 照射的h e p 2 细胞进行了检测，旨 在利用光谱技术来反映不同剂量的x r a y s 与h e p 2 细胞的相互作用的特性，揭 示这一相互作用与x - r a y s 的照射引起细胞凋亡的关联性，进而试图为临床 x - r a y s 放射治疗喉癌提供最佳剂量的参考。 论文从以下四个方面展开试验研究工作，并得出了以下重要结论： 1 、研究了受不同剂量x - r a y s 照射后继续培养2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 的h e p 2 细 胞的紫外吸收光谱，分析了其中蛋白质的紫外吸收特性。结果表明：( 1 ) h c p 2 细胞受不同剂量x - r a y s 照射后继续培养不同时间，它们的吸收谱不同，这一方 面与细胞生长周期有关，另一方面与x r a y s 的照射有关；( 2 ) 受照细胞继续培 养4 8 h 时的吸收谱更具有特征性，此时间点相对于对照组位于2 5 2 n m 附近的吸 收带都有不同程度的红移现象，x - r a y s 的照射延缓了癌细胞正常的细胞周期， 对细胞的增殖起到的抑制作用；( 3 ) 不同剂量的x - r a y s 对h e p 2 细胞内蛋白质 ( 氨墓酸) 、核酸的伤害及修复程度不同，其程度可以通过细胞紫外吸收光谱的 变化得到反映。 2 、研究了受不同剂量x - r a y s 照射的h e p 2 细胞的f h r 光谱。结果表明： 1 4 5 4e l n 。1 谱线逐渐蓝移1 - 3 e m 11 4 0 0t i l l - 1 谱线逐渐红移1 - 3 e r a ，2 8 4 7 锄d 谱线逐渐蓝移4 8 锄，s g y 剂量组蓝移最大为8 c l n - 1 。表明这些谱线对应的基 郑州大学硕士学文论文中文摘要 团构象的改变。另外在所设定的各剂量组癌细胞吸收光谱中，吸收峰强度比 1 1 6 5 4 1 1 5 4 2 、1 1 4 5 4 1 1 4 0 0 、h g s s 1 2 s 4 7 变化明显，其中均以8 g y 剂量组最为明显，根据 相关文献，表明该剂量组细胞的癌化程度最小。从而初步断定，在所设计的各 剂量中，8 g y 效果最好。 3 、研究了受不同剂量x - r a y s 照射后继续培养2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 的h e p 2 细胞 的培养基r p l v l l l 6 4 0 ( 含1 0 胎牛血清) 的紫外吸收光谱，分析了其中蛋白质 的紫外吸收特性。结果表明：经x - r a y s 照射后的h e p - 2 细胞在继续培养的过程 中，其培养基的紫外吸收光谱随时间变化明显，这与细胞消耗培养基中的氨基 酸成分、向培养基中排泄代谢物及细胞的凋亡与坏死有关，对于照射组，后一 因素起到主导作用。而细胞的坏死与凋亡与x r a y s 的照射剂量密切相关。 4 、利用流式细胞技术、采用a n n e x i nv f t r c 腰i ( a n n e x l nv - f l u o r e s c e i n i s o t l f i o c y n a t e p r o p i d i n ei o d i d e ) 双染法初步的检测了h e p 2 细胞在受不同剂量的 x - r a y s 照射后继续培养4 8 h 时的凋亡率，结果表明：x - r a y s 明显引起了h e p - 2 细胞的凋亡，总的凋亡率与剂量呈依赖关系，以1 2 g y 剂量组最大为 ( 2 0 7 9 3 _ + 0 1 3 3 ) ，但并非线性，单位剂量凋亡率( 凋亡率剂量) 以2 c j y 组的最 高。在2 g y 到8 g y 剂量范围内，x - r a y s 诱导的凋亡率变化不大，在这个剂量范 围，总的凋亡率几乎处于一平台。晚期凋亡率与剂量基本上也程依赖关系，也 并非线性，早期凋亡率以1 2 g y 最大，单位剂量凋亡率仍以2 g y 组最高。 关键词：光谱，x 射线，喉癌细胞株，培养基，流式细胞仪 郑州大学硕士学位论文英文摘要 s p e c t r o s c o p yi s a ne f f e c t i v em e t h o di na n a l y z i n gs t r u c t u r e , c o m p o n e n ta n d c o n t e n to fs u b s t a n c e sd u et oi t sh i g hs e n s i t i v i t y i ti sa l le f f e c t i v et o o lf o rs t u d i n gt h e s t a g e so ft h eb i o m o l e c u l e sa n dc e l l s x - r a y si sak i n do fs h o r tw a v ee l e c t r o m a g n e t i c w a v e s ，w h e nt h ec a r c i n o m a t o u sc e l l sw e r ei r r a d i a t e db yt h ex - r a y s ，t h ep r o t e i na n d t h en u c l e i ca c i dw i l lb ed a m a g e do rr e p a i r e d ，a tt h es 锄et i m e t h ex - r a y si r r a d i a t i o n w i l li n d u c es o m em e c h a n i s mo fa p o p t o s i s s ox - r a y si su s e dt oe l i t et h em a l i g n a n t t u m o r si nc l i n i c b u tt ot h ec l i n i c , t h e r ei sn ov e r ys c i e n t i f i cd o s er e f e r e n c ei nt h e x - r a y st h e r a p y , t h ed e s i g no ft h ex - r a y sd o s ei sa l w a y sa c c o d i n gt ot h ee x p e r i e n c eo f t h ed o c t o r s ，i ti sv e r ys u b j e c t i v e i nt h i st h e s i s ，w ec o l l e c t e dt h ea b s o r p t i o ns p g c t r ao ft h eh e p - 2c e l l sw h i c h i r r a d i a t e db yt h ed i f f e r e n td o s eo fx - r a y sa n dt h ec u l t u r em e d i u m ( 1 0 f o e t a lc a l f s e r u m ) c u l t i v a t e dt h ec e l l sf o r2 4 h 、4 8 ha n d7 2 hr e s p e c t i v e l yb ys p e c t r o p h o t o m e t e r o nt h eo t h e rh a n d , t h ea p o p t o s i so ft h eh e p 一2c e l l sw h i c hi r r a d i a t e db yt h ed i f f e r e n t d o s eo fx - r a y sa n dc u l t i v a t e df o r2 4 hw a ss t u d i e d f o r mt h s e so u t c o m e s w e 仃i c dt o f i n do u tt h em l e so ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ex - r a y sa n dt h eh e p 2c e l l sw i t ht h e s p e c t r o s c o p yt e c h n o l o g y , a n dt r i c dt of r e do u tt h eb e s tx - r a y sd o s ef o rt h et h e r o p y o fl a r y n xc a r c i n i m at ot h ec l i n i c t h i st h e s i si n c l u d e sf o u rp a r t s ，a n ds o m ei m p o r t a n tc o n c l u s i o n sa r ed r a w n ：i n t h e1 s tp a r t , t h ei n f l u e n c et oh e p 2c e l l s u v - a b s o r p t i o ns p e c t r aa f t e rt h eh e p - 2c e l l s i r r a d i a t e db yx - r a y sa n dc u l t i v a t e df o r2 4 h 、4 8 ha n d7 2 hw a sr e p o r t e d i ts h o w e dt h a t , ( 1 ) t h e r ew e r ev i s i b l ed i f f e r e n c e sa m o n gt h e s ea b s o r p t i o ns i 3 吧c t l ao ft h eh e p 一2c e l l s i r r a d i a t e db yd i f f e r e n td o s e o fx - r a y sa n dc u l t i v a t e df o r2 4 h 、4 8 ha n d7 2 h r e s p e c t i v e l y , w h i c hr e l a t e dt on o to n l yt h ec e l lc y c l eb u tt h ei r r a d i a t i o no f t h ex - r a y s ， ( 2 ) t h es p c t r aa tt h et i m eo f4 8 ha f t e rt h ec e l l si r r a d i a t e da n dc u l t i v a t e di sm o r e c h a r a c t e r i s t i c , ( 3 ) t h ep r o t e i na n dt h en u c l e i ca c i dw i l lb ed a m a g e da n dr e p a i r e d i n d u c e db yx - r a y s ，w h i c hc a nb er e f l e c t e df r o mt h es p e c t r a i nt h e2 n dp a r t ，f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( r r m ) w a su s e dt o s t u d yt h eh e p 一2c e l l si r r a d i a t e db yx r a y sw i t hd i f f e r e n td o s e c o m p a r e dw i t ht h e 郑州大学硕士学位论文英文摘要 c o n t r o lg r o u p t h ec o n t e n t so fp r o t e i n , n u c l e i ca c i da n d 纽ti nt h eh i g h e rd o s eg r o u p s w e md e c r e a s e do b v i o u s l y a n dw ef o u n dt h a tt h ec o n t e n t sa n df r a m e w o r k so fp r o t e i n , n u c l e i ca c i da n d 缸w e r ec h a n g e dm o s ti n t e n s e l yi nt h e8 g yd o s eg r o u p a l lo ft h e r e s u l t sm a yo f f e rs o m ee x p e r i m e n t a le v i d e n c e si ns e a r c ho ft h eo p t i m u m i r r a d i a t i o n a ld o s eo fx - r a y i nt h e3 r dp a r t , t h eu v - a b s o r p t i o ns p e c t r ao ft h e h e p 2 c e l l sc u l t u r e m e d i u m ( 1 0 f o e t a lc a l fs e r u m ) a f t e rt h eh e p 2c e l l i r r a d i a t e db yx - r a y sa n d c u l t i v a t e df o r2 4 h 、4 8 ha n d7 2 hr e s p e c t i v e l yw e r ec o l l e c t e d f r o mt h er e s u l t sw e f o u n dt h a tt h e r ew e r ev i s i b l ed i f f e r e n c e sa m o n gt h e s ea b s o r p t i o ns p e c t r a i ts h o w e d t h a tt h ec o n t e n to fe a c ha m i n oa c i dh a sa l r e a d yc h a n g e d t h a ti s d u r i n gt h eg r o w i n g c o u i s eo fc u l t i v a t i n gc a n c e rc e l l s ，t h et r y p t o p h a na n dc a s e i nw e r en o td e p l e t e d e q u i v a l e n t l y a n dt h e r ew e r es o m ei m p o r t a n tr e l a t i o n sb e t w e e nt h ea b s o r p t i o n s p e c t r aa n dt h ec e l l s a p o p t o s i sa n dn e c r o s i si n d u c e db yx - r a y s t h i sw i l lb ea f o u n d a t i o nf o rt h eb e s tx - r a y sd o s es t u d yf o rt h el a r y n xc a r c i n o m a i nt h e4 t hp a r t , t h ea p o p o t o s i sw a sm e a s u r e db yt h ef l o wc y t o m e t r yw i t h a n n e x i nv - f i t c p i ；i ts h o w e dt h a t ，t h ex - r a y sc a ni n d u c et h eh e p - 2c e l l sa p o p t o s i s o b v i o u s l y , t h ea p o p t o s i sr e l i e do nt h ex - r a y sd o s eb u tn o tl i n e a r t h ea p o p t o s i sr a t i o o ft h e1 2 g yd o s eg r o u pw a st h eh i 【g h e s t ，i tw a s ( 2 0 7 9 3 _ + 0 1 3 3 ) b u tt h eh i g h e s t0 f t h ea p o p t o s i sr a t i oo f1 g yd o s e ( a p o p t o s i sr a t i o d o s e ) w a st h e2g yd o s ed r o u p t h e a p o p t o s i so ft h ed o s eg r o u pf r o m2 g y t o8 g yw a s c h i n g e dn o tm a r k e d l y k e yw o r d s ：s p e c t r u m x - r a y sh e p - 2c e l l s c u l t u r em e d i u mf c m i v 郑州大学硕士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景及选题意义 喉癌，是头颈外科常见的恶性肿瘤，由于环境污染加剧其发病率目前有明显 增长趋势，男性明显高于女性，据资料统计男女之比为8 4 2 5 6 ：1 ，易发年龄 为5 0 7 0 岁【1 1 。与其他恶性肿瘤一样，喉癌的发生是多种因素共同作用的结 果，这些因素包括：吸烟、饮酒、空气污染、病毒感染、遗传因素、性激素等。 尽管近年来喉癌的手术技术有了明显的提高、晚期喉癌的治疗仍是临床医生必 须面对的一大难题1 2 喉癌的治疗主要是放疗、手术或二者综合治疗，临床根 据设备及技术条件，结合病变部位及扩展范围而选择适当的治疗方式。术前放 射治疗是中晚期喉癌综合治疗的主要措施之一，喉癌放射治疗剂量多少为宜。 各家意见不同。为了寻求喉癌放射治疗最佳剂量。国内外学者做了大量的研究。 目前，喉癌x r a y s 放射治疗量一般为6 0 7 0 g y 6 7 周，且对正常组织损伤较 轻一直沿用至今。大量的临床结果表明，在4 0 5 0 天内照射6 0 7 0 g y ，对正 常组织不造成严重损伤。术前喉癌的放射治疗量应掌握在怎样的范围，怎样才 能既可以提高喉癌术前放射治疗的效果，又不影响放射治疗后手术的可能，仍 是一个值得研究的问题。 恶性肿瘤的发生发展与细胞凋亡及增殖调节的失控密切相关，其中凋亡的 改变对喉癌发生发展与治疗均有重要作用 3 1 。x - r a y s 是一种短波长的电磁波， 波长范围0 0 0 1 1 0 r i m ，有极强的穿透能力、电离能力和荧光效应，与生物体作 用时还有明显的生物化学效应，x - r a y s 与肿瘤细胞作用后会引起细胞内蛋白质 与核酸的损伤与修复，同时还会启动肿瘤细胞的某些凋亡机制，使肿瘤细胞自 然凋亡，剂量较大时则会直接杀死肿瘤细胞。近年来一直广泛应用于肿瘤的放 射治疗【4 】。 细胞由细胞膜、细胞质和细胞核构成，癌细胞与正常细胞的基本成分是一 样的，都由蛋白质、核酸、糖类和脂类等生物大分子组成，只是各成分的组成 比例和分子的空间物理化学排列( 构型与构象) 有所差异 5 1 。这些生物大分子又 有各自复杂的分子能级结构，当光予与其相互作用时，分子有选择性的吸收光子 能量引起分子中价电子能级间的跃迁产生吸收光谱。通过对不同放射剂量组细 郑州大学硕士学位论文 第一章绪论 胞的吸收光谱的采集和研究，可以发现其中的差异性与规律性，进而从分子水 平揭示了这些细胞中的某些生物大分子的含量、构象发生了变化。结合细胞凋 亡率的测定，有望利用光谱技术来探究喉癌细胞的最佳x - r a y s 放射剂量，可以 达到方便、快捷、准确、经济实惠。这种方法未见国内外的报道。 1 2 国内外光谱技术在生物医学方面的应用现状 1 2 1 国内外红外吸收光谱在生物医学方面应用发展与现状 1 8 0 1 年，w i l l i s m h e r s c h e l 发现了红外辐射现象，自此，红外辐射技术如红 外光谱分析已成为化合物、混合物、复合材料鉴别与表征的常用手段。1 9 1 1 年， c o b l e n t z 提出运用红外光谱对生物物质的分析具有十分重要的应用价值，到2 0 世纪4 0 年代，色散型光谱仪的诞生为生物化学家研究生物分子的红外光谱图与 其生化结构的关系提了有利的工具。5 0 、6 0 年代，在生物医学界兴起了利用红 外光谱对核酸、蛋白质、糖、脂类等生物大分子的研列6 7 】的热潮。但直到近十 年来，红外光谱才真正的广泛用于生物体系特别是肿瘤细胞或组织的分析，其 原因是生物体系比较复杂，分子种类多，而且含有大量的化学基团，这些基团 的红外吸收光谱相互重叠成十分复杂的吸收带；另外，水的吸收带有非常强， 常常掩盖了生物分子的吸收带，使得红外光谱在生物化学的应用陷入了困境。 直到7 0 年代，由于计算机技术、数据处理技术的快速发展，诞生了f o u f i e 变换 红外光谱仪，它极大地提高了信噪比、缩短了测量时间，而且很容易的使重叠 峰分开，水的吸收峰也很容易从样品谱中扣除，使得红外光谱技术在生物医学 上的应用又一次得到迅猛的发展。傅立叶变换红外光谱仪在生物样品研究中具 有以下几个优点：1 ) 能在分子水平上直接了解所研究分子或体系的结构，得到基 因生物功能信息，新化学键的形成及类型，以及环境对生物样品的影响；2 ) 红外光 谱样品用量少，不破坏样品结构，即可研究样品的表面结构，又可研究样品的整体 结构；3 ) 经过计算机数据处理，水的吸收峰从样品谱中扣除，重叠的吸收峰经过傅 立叶去卷积可分开寿，傅立叶去卷积技术是从重叠谱带中获取隐含信息( 结构， 含量) 的有效方法傅立叶变换红外光谱仪的发展实现了由化学领域发展到分子 生物学和临床医学研究领域，从离体分析发展到在体无损分析 s l 。 1 9 9 1 年以意大利的b e n e d e t t i 和加拿大的w o n g 等【9 】为首对细胞或组织样 2 郑州大学硕士学位论文第一章绪论 品的红外光谱进行的研究，以及其他大多数人的研究工作中多以组织的匀浆、 细胞和组织切片等样品进行透射红外和显微红外光谱等方法的研究【协1 3 】。国 内自1 9 9 5 年以来，以北京大学化学与分子工程学院的吴瑾光、徐怡庄、凌晓峰 等，西安交通大学第一医院的石景森、王建生等及中国科学院化学研究所的赵 莹、徐端夫等为代表的研究人员研究了多种离体正常和肿瘤组织的红外光谱、 手术室旁b jj , l l q | 离体新鲜组织样品的红外光谱。这一研究工作积累到一定数量的 病例后，首次实现了肿瘤组织红外光谱的在体原位检测。将红外光谱法拓展到 临床应用研列1 删。韩伟等【2 1 1 利用傅里叶变换红外光谱法检测了正常组织细胞 和宫颈癌患者的癌变细胞，与妇女普检中5 3 例样品的病理诊断结果进行对比， 得出结论：该方法能在分子水平上揭示癌变细胞与正常细胞的明显差别，通过谱 图解析可直接阐明引起谱图变化的主要原因和细胞癌变的可能机理。 霍红、胡祥掣捌利用红外光谱技术研究了人体正常乳腺组织、良性肿瘤和 乳腺癌组织，并进行比较，试验中发现：癌组织中蛋白质的某些氨基酸残基的 v ( c - - o ( h ) ) 谱带位置明显向高波数位移，表明组织中该基团中的氢键大部分被 破坏蛋白质分子的氢键化的v ( n - l - 1 ) 谱带位置向低波数位移，且谱带形状也有所 改变，说明n h o = c 氢键化程度增强核酸的磷酸二酯基团的v i | 0 力收强度明 显增强，反映癌细胞内d n a 相对含量增加；位于9 7 0c m d 附近的懈0 3 1 增加，提 示细胞中磷酸化蛋白含量增加而胶原蛋白的特征谱带强度减弱，说明其相对含 量的减少。 张莉，王健生等【2 3 l 研究了正常与癌症肺组织的傅里叶变换红外光谱的差异， 对比了肺癌与癌旁正常组织红外光谱中的相对峰高对比1 1 4 6 叽l 枷，1 1 2 4 胡1 3 1 0 和 i l o s o 1 1 1 6 0 , 发现i l “讥1 5 5 0 ，i l o s o 1 1 1 高于正常组织以及1 1 4 6 0 1 1 4 0 0 , 1 1 2 4 0 1 1 3 1 0 低于正常 组织视为癌变组织提出用红外光谱法鉴别癌变肺组织时，应该综合考虑，即当 1 1 6 4 3 1 1 5 s o , 1 1 4 6 0 1 1 4 c c ，i l 棚1 3 l o 及1 1 0 s o 1 1 1 这4 组指标中有3 个符合癌变判据时， 可以诊断该组织为癌变组织 近年来( 2 0 0 1 2 0 0 7 年) 国外科技工作者在这方面也做出了很多的成绩。 j a g a n n a t h a n r 等 2 4 1 基于显微红外光谱的研究，利用显微傅立叶变换红外光谱研 究了正常结肠组织、息肉结肠瘤及结肠癌组织样品的傅立业变换红外光谱，并 直接与常规的组织病理学分析结果进行对比，数据分析表明：在总共1 0 0 次测量 3 郑州大学硕士学位论文第一章绪论 中，正常结肠组织的显微傅立叶变换红外光谱在很宽的光谱范围，其吸收强度 明显高于息肉结肠瘤及结肠癌组织的光谱强度。更为详细的分析表明：息肉结 肠瘤及结肠癌组织中糖类、磷酸盐和肌氨酸的含量比正常组织中的总体含量都 有所降低 c m k r i s h n a 等嘲利用显微傅立业变换红外光谱和拉曼光谱研究了正常、 良性及恶性卵巢组织，这些组织都经过福尔马林的固定。对其拉曼光谱的研究 发现：正常组织中蛋白质的含量要明显的高于病态组织中蛋白质的含量，而 瑚峨及油脂的含量相对明显较低；在病态组织中，恶性组织中的蛋白含量最低 而d n a 、油脂的含量则最高，对其红外光谱的研究更是证明了这一点。试验中 还发现：正常卵巢组织和良性卵巢组织的傅立业变换红外光谱和拉曼光谱更具 有相似性，而恶性卵巢组织的这两种光谱与之则有较大的差异。文中的研究结 果揭示了利用福尔马林固定的卵巢组织进行卵巢癌的光学病理学研究的可行 性，而且指出利用光谱技术对卵巢癌的早期诊断有着重要的意义。 另外，s b w h i t c 等闭利用显微傅立业变换光谱技术对单个处于增殖状态的 宫颈癌上皮细胞( h a l a 细胞) 进行了细胞周期的研究，采用免疫组化染色的方 法观察细胞形貌及细胞d n a 合成情形进而来判别细胞所处的增殖周期，然后 采集处于不同细胞周期细胞的近红外光谱，研究发现：h a l a 细胞在g 1 和g 2 期 的近红外傅立叶变换光谱存在较小的差别，但结果表明这已经足够能直接快速 的来区分出这两个细胞周期，尽管这两个细胞周期的细胞的光谱很相似，正如 他们在先前的文献中所阐述的闭。处于s 期细胞的光谱相对而言就较难以区分， 原因是在这个时期内，细胞内部存在大量的不同成分，尽管如此，利用红外光 谱对细胞周期的研究还是很有效的。 1 2 2 国内外紫外可见光谱在生物医学方面应用现状 紫外分光光度计在有机分析的四大仪器( 紫外分光光度计、红外光谱仪、 核磁和质谱仪) 中是最价廉的仪器，进行紫外光谱法测定快速、方便，紫外图谱简 单，易识别，干扰峰少，紫外可见吸收光谱提供的信息主要涉及化合物中所含的 共轭体系或羰基、硝基等生色团以及与它们直接关联部分的结构，芳香族氨基酸 残基在蛋白质分子中的位置。目前国内外利用紫外及可见吸收光谱在物理、生 4 郑州大学硕士学位论文 第一章绪论 物化学、医药、食品等很多领域都做出很多有意义的成果【复”1 1 。 一直以来，紫外可见光谱广泛应用于药物分析过程中，药物分析对于药物质 量的检验与控制、生物体液中有关药物含量的测定以及药代动力学的研究均起着 重要的作用。由于许多药物结构中具有吸收紫外或可见光的基团，或这些基团能 与某些试剂、离子等发生颜色反应，从而很容易被检测，因此分光光度法在药物 分析中得到了普遍应用旧，运用紫外可见光谱进行药物分析常见有以下几种方式 ( 1 ) 直接的紫外可见分光光度法；( 2 ) 利用显色反应的紫外可见分光光度法； ( 3 ) 层析分离技术和紫外可见分光光度法的结合使用；( 4 ) 紫外可见分光光度 法的一些最新技术。例如用一阶导数分光光度法测定其中扑尔敏的含量，不仅可 消除其它成分的干扰，而且回收率高，操作简单【3 3 1 ，用二阶导数u v - v i s 法测定硫 酸阿托品注射液p 卅，三波长吸光度比值法，不经分离直接测定氢氯噻嚷和赖诺普 利的含量【期。m a r t i n 3 6 1 等研究了与硫酸反应生成曲恩汀的动力学分光光度法同 时测定尿液中的螺内酷和坎利酸内酯，应用偏最小二乘法处理动力学分光光度法 数据等。 近年来运用紫外可见光谱结合荧光光谱研究物质间的相互作用也是一个 很热的课题。石燕掣韧应用紫外光谱法和荧光光谱法研究了麦塔喇红与蛋白质 相互作用，m r 和b s a 之间的紫外光谱表明，在低浓度时，m r 与b s a 之间形 成了一种配合物，使得m r 的吸收光谱红移。同时表现在低浓度时m r 的荧光 发生碎灭，而且荧光峰红移，m r 对b s a 的荧光影响也证实了m r 与b s a 之 间形成了一种配合物。利用紫外光谱法可以证明，两者之间的结合符合s c a t c h a r d 模型，存在两类结合，结合数分别为8 4 和1 1 1 ，结合常数分别为1 1 x 1 0 6 m o l l l 和1 5 x 1 0 5 m o l 1 l 。张根成掣捌用同样的方法研究了桔皮苷与牛血清白蛋白相互 作用，也获得了一定的结果。 阙青民等【3 9 】采用紫外光谱和荧光光谱法，在生理条件下( p h - - 7 4 ) 对恩诺 沙星( e n r ) 与小牛胸腺脱氧核糖核酸陋d n a ) 的作用方式进行了研究。证实了 恩诺沙星通过嵌插方式和静电结合方式与d n a 发生相互作用。实验表 明，d n a 能猝灭恩诺沙星的内源性荧光，d n a 与恩诺沙星的相互作用为静态猝 灭过程，其结合常数为2 7 3 1 0 5m o l d l 结合位点数为1 1 2 。从分子水平上研 究药物小分子与d n a 大分子的作用机理，有助于人们对药物与d n a 相互作 5 郑州大学硕士学位论文第一章绪论 用方式及其在体内吸收的理解。 张朝红等【柏】用紫外光谱和荧光光谱研究3 - - 丁基锡( t b t ) 化合物与脱氧核 糖核酸( d n a ) 的相互作用。结果表明t b t 与d n a 的作用方式和程度取决于时 间、浓度、酸度和离子强度等因素。p h 值以及n a c i 浓度较低时t b t 主要与 d n a 的磷酸基团静电作用，使d n a 构象发生变化；p h 值以及n a c i 浓度较 高时则主要与d n a 的碱基结，对d n a 双螺旋结构有一定影响。而且, t b t 与 d n a 作用时间越长，则减色越明显。为进一步在分子水平上研究有机锡对生物 的影响提供了一定的理论依。 m s i t o h y 等【4 1 l 成功的利用紫外可见光谱研究了酯化乳清蛋白( a 乳白蛋白 和b 乳白蛋白) 与d n a 之间的相互作用。 国内外运用紫外可见光谱技术对细胞及细胞培养基的分析报道相对较少。郑 州大学的葛向红，赵元黎等【4 2 】首先对应用分光光度技术测定癌细胞吸收光谱的 试验条件进行了探讨，通过三种不同试验条件的比较，最终得到了有意义的结论： 参比池中采用2 8m l 蒸馏水+ o 1m l 血清+ o 1m lp b s 缓冲液时，能得到癌细 胞具体、准确的信息，并且重现性较好，峰位及峰值强度的方差分别0 6 0 9 9 、 0 0 2 3 8 。该研究小组应用分光光度技术测定了肿瘤细胞在培养过程中的紫外吸收 光谱【4 3 】以及细胞培养基的紫外吸收光谱。其研究结果表明：相同培养天数的 c n e 细胞和h c l a 细胞，两者的吸光度在2 0 0 3 0 0 n m 处均有特征性的谱线，另 外发现它们的吸光度有差异且它们各自的吸光度与细胞的培养天数无正比关 系，反映出不同的肿瘤细胞谱线模型不同，预示不同癌症的转移进程存在差异。在 肿瘤细胞培养的过程中，培养基中芳香族氨基酸中各种氨基酸如色氨酸和酪氨酸 的含量发生变化。一者来说癌细胞在生长过程中对色氨酸和酪氨酸的消耗不是 按等量比的，实验也说明h e l a 和a 呃在生长过程中，对r p m i l 6 4 0 培养基和 d m e m 高糖培养基中氨基酸的消耗是不同的。再者，实验中也发现癌细胞在生 长期中所检测的培养基中氨基酸含量高于参比池中未培养过细胞的培养基的氨 基酸含量。以及在细胞生长后期培养基中氨基酸含量的回升有可能是细胞的代 谢物及部分凋亡细胞的作用。体外培养细胞的代谢物是哪些物质有待于进一步实 验研究，这些代谢物是否和体内癌细胞的代谢物有相关关系也有待于进一步实 验研究。 6 郑州大学硕士学位论文第一章绪论 m b c r c u 等【4 5 】利用基于一个薄p + n 结的紫外可见光探测仪研究了磷酸缓冲溶 液( p b s ) 中的酵母细胞的紫外可见吸收光谱。所研究的酵母细胞的密度范围为 6 ：0 6 2 x 1 0 s c e l l s m l ，这些酵母细胞的吸收带为与2 5 0 - 5 0 0a m , 其主要吸收带位于 3 1 0 a m 、3 5 0 u r n 、4 0 0 r a n 和4 2 7 n m 附近。实验中发现，随着细胞浓度的增加，位于 4 2 7 n m 附近的较宽吸收带明显的发生红移，但这一红移与细胞的浓度增加并不是 线性的，当细胞浓度大于5 x 1 0 7 c c l l s m l 时存在一个红移饱和度。 由以上的说明不难看到，紫外可见光谱技术可以用来监测物质相互作用的 结果。因此当x - r a y s 与肿瘤细胞相互作用时，肿瘤细胞内部的蛋白质、核酸等生 物大分子的结构、含量、构象会发生改变，那么与这些生物大分子的相关光谱就 会发生相应的变化。利用光谱技术来捕捉这些变化，就是本文的一个出发点。另 外，当与x - r a y s 作用过的肿瘤细胞在继续培养的过程中，由于其代谢受至l j x - r a y s 的影响，其对培养基中成分的改变与对照组是不同的，这一不同也一样可以通过 光谱反映出来，这是本文研究的另一个出发点。 1 , 2 3 国内外拉曼光谱在生物医学方面的应用现状 拉曼效应是一种由分子和晶格振动导致的非弹性散射。早在1 9 2 3 年， a s m c k a l 4 6 1 就已经在理论上预言了这种效应。1 9 2 8 年印度科学家c v r a m a n 4 r l 与ks k d s h m a n 首先在液体中观察到这种现象。在他们的论文发表后不久， 1 a n d b e r g 和m a n d c r s t a m 【镛】就在俄国报道了他们在石英中观察到频率发生改变 的光散射现象；并且c 曲枷e s 【4 9 l 和r o c a r d 5 0 l 在法国也证实了拉曼和k r i s h m a n 的观察结果。 2 0 世纪6 0 年代前，因为光源能量密度小，单色性差等条件限制，拉曼散 射的应用受到限制，6 0 年代后随着激光器的应用，拉曼散射的应用越来越广泛。 早在二十世纪6 0 年代末至7 0 年代初，拉曼光谱就开始被用于生物医学方面的 研究。但是发展却非常缓慢，其原因有二：1 ) 生物体自身的强荧光背景降低了 拉曼光谱的信噪比；2 ) 拉曼光谱具有散射截面低、散射光强弱的缺点，这使得 获得清晰的生物样品的拉曼光谱变得困难重重。9 0 年代后，近红外拉曼光谱技 术、紫外共振拉曼光谱技术以及表面增强拉曼光谱技术的发展，有效地克服了 生物组织的强荧光背景，提高了拉曼光谱的信噪比，十年来，由于这些技术在 7 郑州大学硕士学位论文 第一章绪论 生物医学上的广泛应用，拉曼光谱技术在生物医学方面的应用有了长足发展。 国外有关文献巧1 埘1 报道：近红外拉曼光谱技术可以区分正常组织、癌前病 变组织及癌组织，在诊断子宫癌、结肠癌等方面很有成效。s o h j i 等啷3 使用近 红外拉曼光谱技术研究了人体肺组织( 正常、非正常组织) ，并取得了很好的成 果。 m o n i k a g n l a d e e k a 等人冈光谱比较正常皮肤、良性皮损、恶性皮损的分 子结构在拉曼光谱中，蛋白质的二级结构可以通过含有肽键的酰胺分子谱带振 动反映出来，谱带的改变反映了蛋白质的构造和脂质分子结构上的变化，据此 研究良恶皮损中特殊分子变异 m a h a d e v a n 等人【5 刀用红外傅立叶变换光谱仪在体外测定了宫颈组织的拉曼 光谱，对正常的宫颈组织、宫颈炎症组织和癌前病变组织的光谱进行了分析， 结果表明：利用8 个峰的峰强度就能把癌前病变和其他良性病变给区分出来， 灵敏度为8 2 ，特异度为9 2 。 w i e l a n dh 等人娜1 尝试着用近红外拉曼光谱技术来研究龋齿，其研究结果表 明：1 0 7 0 e r a 1 、5 8 7 c m 1 、4 3 2 c m 1 、9 6 0 c m d 等处的拉曼峰是源于牙齿中所含的 羟磷灰石，9 6 0c l n 1 处的强拉曼峰对应着磷酸盐对称伸缩振动。2 9 4 0c l n - 1 、1 6 7 0 锄、1 4 5 3 锄、处的拉曼峰源于有机胶原物质。计算发现：根据磷酸盐( 9 6 0 c m d ) 、有机物( 1 6 7 0 c m - 1 ) 以及( 1 9 0 0 c m 。1 ) 的峰值可以来区分龋齿。 国内近些年来在这方面的研究也出现了很多成果，但利用拉曼光谱研究组 织细胞的报道相对其它类型的光谱在这方面的研究还比较少。李伟红等1 5 9 】在国 内率先利用傅立业变换拉曼光谱研究恶性肿瘤，他们测定了正常腮腺组织及恶 性肿瘤组织的傅立业变换光谱，结果表明：正常组织在2 7 0 0 e m 1 - 3 0 0 0 e m d 之间 具有强的c h 伸缩振动谱带，而相应的癌组织在此区域的强度相对较弱。处于 1 7 5 0 e m 1 处的谱带被指认为c = o 的伸缩振动，正常组织在此处的光谱强度明显 高于癌变组织。 郭萍等【删按正常人和不同种类癌症患者进行分类，用激光拉曼光谱分别对正 常人、鼻咽癌患者、肝癌患者和慢性白血病患者四类受试者的血清在o 一2 0 0 0 e r a 1 范围进行测试。结果表明：同类患者中不同受试者血清的激光拉曼光谱特征峰 值大小虽然不同，但光谱图特征基本一致。不同种类癌症患者血清的激光拉曼光 8 郑州大学硕士学位论文 第一章绪论 谱图存在较大差异，在各类癌症患者血清的激光拉曼光谱图特征峰附近，正常人 血清均没有拉曼光谱特征峰。 姚辉璐等【6 1 】用激光光镊拉曼光谱技术研究了不同物种的血红细胞的拉曼光 谱，采用一个波长为7 8 5 n m 的半导体激光束来囚禁血红细胞和激发血红细胞的 拉曼光谱。结果显示不同物种血红细胞的拉曼光谱在1 6 0 3c m 1 苯丙氨酸和色氨 酸的c = c 平行振动模及1 6 1 6 c m 1 酪氨酸和色氨酸的c = c 拉伸模有明显的差 异，这可以用来作为不同种血红细胞鉴定的特征标记，表明光镊拉曼光谱技术可 以成为血红细胞分析的有效手段。对于单个细胞的拉曼光谱的研究，国内闰循 领等做了不少工作，并取得了一定成果陋叫 郑州大学的赵元黎等唧】使用r e n i s h a w 显微共焦拉曼光谱仪检测了2 4 例 乳腺肿瘤组织病理片的拉曼光谱。通过对浸润性导管癌、乳腺增生、纤维腺瘤 等乳腺疾病的拉曼光谱分析，找出了不同乳腺疾病的病理片拉曼光谱的的差异， 把相对峰强比1 1 6 1 0 ，i l 蹦是否大于1 0 1 5 作为判断是否癌变的标准，乳腺增生和 纤维腺瘤细胞的符合率为7 8 5 7 ，癌细胞的符合率为7 7 7 8 ，提出1 1 6 1 1 5 2 5 有可能作为乳腺肿瘤细胞分类的准则之一。 1 2 4 本论文主要内容 从国内外的研究现状来讲，光谱技术已广泛的应用于生物医学方面的研究， 而且取得了一定的成果。但近年来国内外利用光谱技术在生物医学方面的研究 大多集中于癌症的诊断，试图利用光谱技术实现癌症的早期诊断。这些光谱技 术多应用于肿瘤组织、正常组织的分析对比以及正常人与癌症患者体液、代谢 物等的光谱分析对比，试图找出规律应用于临床。光谱技术最重要的是能从分 子水平揭示分子结构、构象的改变，是研究物质间相互作用的理想工具，利用 这一工具在研究生物大分子与其他物质之间的相互作用以取得了不少的成果。