（生物化学与分子生物学专业论文）characterization+and+genetic+mapping+oftwo+staygreen+mutantsdst6+and+dst7in+arabidopsis.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t i na na t t e m p tt o s c r e e ns t a y g r e e n m u t a n t si na r a b i d o p s i sin t h e a b s e n c eo f 1i g h t ，t w om u t a n t s d i s p l a y i n g t h ec h a r a c t e r i s t i c s o f b r a s s i n o s t e r o i d sm u t a n t s ，d s t 6a n dd s t 7 , w e r ei s 0 1 a t e d t h e ya l l h a da p r o l o n g e d 1if e s p a n t h em u t a n td s t 6c a r r i e das i n g l er e c e s s i v em u t a t i o n u s i n gm o l e c u l a r 窟e n e t i cm a r k e r s ，t h em u t a t i o n w a sm a p p e dt ot h eb o t t o mo fc h r o m o s o m ei i ， w h i c hw a sa r o u n dt h er e g i o no fd e t 2 ，o n eo f t h eg e n e sk n o w nt oc a u s e b r a s s i n o s t e r o i d sm u t a t i o n t h ea n a l y s i so fc d n aa n dg e n o m i cs e q u e n c eo f d e t 2i nd s t 6r e v e a l e daf r a m e s h i f t i n gi n s e r t i o n t h e s er e s u l t ss u g g e s t t h a td s t 6i sap u t a t i v en e wa l l e l eo fd e t 2 i na d d i t i o n ，d s t 6 e x h i b i t e d a ni n c r e a s e dt o l e r a n c et op a r a q u a t i n d u c e d o x i d a t i v es t r e s sa n de x t r e m e l y l o wl e v e l so fz e a t i na n dz e a t i nr i b o s i d ec o m p a r e d 亩i t h t h ew i l d t y p e p l a n t s t h em u t a n td s t 7 d i s p l a y e da ni n t e r m e d i a t ep h e n o t y p eb e t w e e nd s t 6 a n d c o l 一口i ta l s oc a r r i e das i n g l er e c e s s i v em u t a t i o nw h i c hw a sm a p p e dt o 5 2c mc e n t r o m e r icr e g i o no nc h r o m o s o m e1 1 1 p u t a t i v ed s 占d s t 7d o u b l e m u t a n t e x h i b i t e da n e x t r e m e l y d w a r f p h e n o t y p ea n dc o m p l e t ei n f e r t i l i t y ，w h i c hi sp r o b a b l yt h ec o n s e q u e n c eo f ac r o s st a l kb e t w e e nd i f f e r e n tp a t h w a y st h a tt h e t w om u t a n t sw e r ei n v o l v e d 1 n k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i s ；d s t 6 ；d s t t ；d e t 2 ； g e n e t i cm a p p i n g ； b r a s s i n o s t e r o i d ；s e q u e n c i n ga n a l y s i s ：o x i d a t i v es t r e s s ：d o u b l e m u t a n t 摘要 摘要 在黑暗条件下筛选拟南芥滞绿突变体时，得到两株突变体，出 研口d s t t , 均 表现出典型油菜素变异和长寿的特征。遗传分析表明d s t 6 和如钧是单基因隐 性突变。 利用简单序列多态性标记，将d s t 碇位于2 号染色体的底部。粗定位的结果 和形态学特征表明出 阿能是一个幽f 礴位基因突变株。通过对d s t o 冲d e t 2 基 因的测序分析，发现一个引起移码的单碱基插入突变，证明了d s t 6 n 能是一个 新的幽蕊位基因突变株。另外，在出坩中内源玉米素和玉米素核苷的含量非 常低。以野生型为对照，d s t 6 表现出了抗甲基紫精诱导的氧化胁迫的能力。 d s t 7 的表型介于野生型和d s t o 珀c j 中间，被定位于2 号染色体的着丝粒区域。 待鉴定的d s t 6d s t 7 双突变体表现出了d s t 6 和d s t 7 表型的叠加效应，极 端矮小，完全不育。这种极端的表现型可能是由于d s t 研出t 7 突变体所涉及的 不同信号代谢途径交互作用的结果。 关键词：拟南芥：d s t 6 ；d s t t ；d e t 2 ；图位克隆：油菜素甾体：序列分析 氧化胁迫；双突变体 一2 p r e f a c e p r e f a c e a r a b i d o p s i s t h a l i a n ajsa l l i m p o r t a n t m o d e l p l a n ts p e c i e s f o r i d e n t i f y i n gg e n e sa n dd e t e r m i n i n gt h e i rf u n c t i o n s a sa m o d e lf l o w e r i n g p l a n ts y s t e m ，i th a sm a n ya d v a n t a g e s ，i n c l u d i n g as h o r tg e n e r a t i o nt i m e ， s m a l ls i z e ，l a r g en u m b e ro fo f f s p r i n g ，a n dar e l a t i v e l ys m a l ln u c l e a r g e n o m e m o s tp r o m i n e n t l yt h ec o m p l e t es e q u e n c e o fi t sg e n o m ew a sm a d e a v a i l a b l ei n2 0 0 0 t h e s e a d v a n t a g e sp r o m p t e d a n e v e r e x p a n d i n g s c i e n t i f i cc o m m u n i t yt o i n v e s t i g a t e v a r i o u sb i o l o g i c a li s s u e s u s i n g a r a b i d o p s i s , w h i c hh a sr e s u l t e di nar a p i da c c u m u l a t i o no fk n o w l e d g ea n d t e c h n o l o g y l i g h tr e g u l a t e sa l m o s te v e r ys t e po fp l a n td e v e l o p m e n t ，f r o ms e e d g e r m i n a t i o n t of r u i tm a t u r a t i o n m o r e o v e r ，l i g h ta l s or e g u l a t e st h e c i r c a d i a nr h y t h m ，t h ea d a p t i v es i z em o d i f i c a t i o no ft i s s u ea n do r g a n s ， a n dt h ee x p r e s s i o no fp h o t o s y n t h e t i cg e n e s a n dm a n yo t h e rk n o w na n d u n k n o w ng e n e s 哩d e s p i t ea r a p i dp r o g r e s si nt h es t u d i e so fl i g h ts i g n a l i n g 1 i t t l ei sk n o w na b o u tt h eg e n e t i cr e g u l a t i o no fc h l o r o p h y l lm e t a b o l i z i n g o n et y p eo ft h ea b n o r m a lc h l o r o p h y l lm e t a b o l i z i n g sr e s u l t si nas t a y + g r e e n p h e n o t y p e ，w h i c hh a sw i d ea p p l i c a t i o n si na g r i c u l t u r e t os t u d yt h em o l e c u l a rm e c h a n is m so fs t a y g r e e ni na r a b i d o p s i s , a s e r i e so f s t a y g r e e n m u t a n t sw e r ei s o l a t e d f r o mm 2p o p u l a t i o n so f a r a b i d o p s i s ( c o l u m b i a 嘲m u t a g e n i z e db yf a s tn e u t r o n ( f n ) i nt h ea b s e n c e o f1i g h t u n e x p e c t e d l y ，t w oo ft h em u t a n t ss c r e e n e d ，d e s i g n a t e dd s t 6a n d d s t 7 ( d a r ks t r e s st o l e r a n t ) a r es i m i l a rt o t h eb r a s s i n o s t e r o i d s ( b r s ) m u t a n t sp r e v i o u s l yr e p o r t e d 出t 2 m u t a n tw a so n eo ft h ef i r s tm u t a n t sf o u n dt ob ed e f e c t i v ei nt h e b r s p e c i f i cp a t h w a y t h ea r a b i d o p s i sd e t 2g e n ee n c o d e sap r o t e i nt h a t s h a r e s s i g n i f i c a n ts e q u e n c ei d e n t i t y w i t hm a m m a ij a ns t e r o i d s 5q - r e d u c t a s e s a n dh a so n l yo n ei n t r o n h e r ew ep r e s e n tad e s c r i p t i o no fd s t 6 m u t a n t ，d s t z m u t a n ta n dp u t a t i v e d s t 6d s t 7d o u b l em u t a n t t h em u t a n td s t 6w a sa p u t a t i v e n e wa 1 1 e l eo f d e t 2 u s i n gs i m p l e s e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m s ( s s l p s ) “3 ，t h ed s t 6 m u t a t i o nw a sm a p p e dt o 3 p r e f a c e t h eb o t t o mo fc h r o m o s o m ei i ，a r o u n dt h er e g i o no ft h ed e t 2 ，o n eo ft h e g e n e sk n o w nt oc a u s eb r sm u t a t i o n w es e q u e n c e db o t ht h ec d n aa n dg e n o m ic d n ao fd e t 2g e n ei nd s t 6 b o t ho ft h er e s u l t ss h o w e daf r a m e s h i f t i n g i n s e r t i o n a lm u t a t i o no fd e t 2g e n ei nd s t 6 s of a re i g h t 幽t 2 a l l e l e sh a v e b e e nr e p o r t e d f o u ro ft h e mc o n t a i nf r a m e s h i f t i n gd e l e t i o n s ，t w oc a u s e p r e m a t u r et e r m i n a t i o n so ft h ed e t 2p r o t e i n ，a n dt h er e m a i n i n gt w oh a v e an o n e o n s e r v a t i v es u b s t i t u t i o no fl y s i n ef o rg l u t a m a t ea tp o s i t i o n2 0 4 t h u s ，d s t 6i sv e r yl i k e l yan e wa l l e l eo fd e t 2 t h em u t a n td s t 7 d i s p l a y e da ni n t e r m e d i a t ep h e n o t y p eb e t w e e nd s t 6a n d c o l 一髓i ta l s oc a r r i e das i n g l er e c e s s i v em u t a t i o n ，w h i c hw a sm a p p e dt o 5 2c mc e n t r o m e r i cr e g i o no nc h r o m o s o m ei i i p u t a t i v ed s t 6d s t ? d o u b l em u t a n te x h i b i t e da n e x t r e m e l yd w a r f p h e n o t y p ea n dc o m p l e t ei n f e r t i l i t y ，w h i c hi sp r o b a h l yt h ec o n s e q u e n c eo f ac r o s st a l kb e t w e e nd i f f e r e n tp a t h w a y st h a tt h et w om u t a n t sw e r ei n v o l v e d i n p a r a q u a t ，ap o t e n th e r b i c i d et h a te x a c e r b a t e s0 2r a d i c a lp r o d u c t i o n ， w a su s e da sam o d e lt os t u d yo x i d a t i v es t r e s s 嘲t of u r t h e ru n d e r s t a n d t h ed e f e n s em e c h a n i s m so fp l a n t sw i t he x t e n d e dl i f es p a n st oo x i d a t i v e s t r e s s ，t h es t u d y w a s d e s i g n e d t od e t e r m i n et h ee f f e c to f p a r a q u a t m e d i a t e d o x i d a t i v es t r e s so nr e l a t i v e g r o w t h r a t ea n ds o d a c t i v i t yo fr o s e t t el e a v e so fd s t 6m u t a n t sa sw e l la sw i l dt y p ep l a n t s r e s u l t sf r o mt h i ss t u d yc a ns u p p l yi n f o r m a t i o no nt h e p o s s i b l ei n v o l v e m e n t o fa c t i v a t e d o x y g e ns p e c i e s i nt h em e c h a n i s m o f d a m a g eb y p a r a q u a t - m e d i a t e do x i d a t i v es t r e s si nd r a b i d o p s i s m u t a n tp l a n t s ，a n da l s o c o u l dp r o v i d ead e e p e ri n s i g h ti n t ot h em o l e c u l a rm e c h a n i s m so ft o l e r a n c e t oo x i d a t i v es t r e s si np l a n t sw i t he x t e n d e dl i f e s p a n s r e v i e w s r e v i e w s 1 l e a fs e n e s c e n c e 1 1l e a fs e n e s c e n c ei sa ni m p o r t a n tp h a s ei nt h ep l a n t1 i f ec y c l e t h es i g h to ff a l l i n gr e da n dg o l da u t u m n1 e a v e so ro fy e i l o w i n gw h e a t f i e l d sb r i n g st om i n dt h ee n do fas e a s o no rt h ed e a t ho fap l a n t t h e 1 e a v e so fb o t ha n n u a la n dp e r e n n i a lp l a n t sm u s te v e n t u a l l yd i e h o w e v e r ， w h g tm a yn o tb ei m m e d i a t e l ya p p a r e n ti st h a tt h es e n e s c e n c eo fl e a v e si s n o ts i m p l yc o n c e r n e dw i t hd e a t h ，b u tt h a tl e a fs e n e s c e n c er e p r e s e n t sa k e yd e v e l o p m e n t a lp h a s ei nt h e1 i f eo fb o t ha n n u a la n dp e r e n n i a lp l a n t s w h i c hi sa so r d e r e da n dc o m p l e xa sa n yo t h e rp h a s eo fd e v e l o p m e n t i n d e e d ， 1 e a fs e n e s c e n c ei sa si m p o r t a n tad e v e l o p m e n t a lp h a s ea st h o s eo fg r o w t h a n dm a t u r a t i o n d u r i n gi t sl i f e s p a n al e a fu n d e r g o e sa tl e a s t t h r e e p h a s e so fd e v e l o p m e n t i n i t i a l l y ，i ti se x p a n d i n gr a p i d l y ，i m p o r t i n g c a r b o na n dn i t r o g e na n du n d e r g o i n gr a p i d p r o t e i ns y n t h e s i su n t i li t sf u l l c a p a c i t yf o rp h o t o s y n t h e s i si sr e a c h e d t h e nt h em a t u r el e a fb e c o m e sa n a s s e tt ot h ep l a n t ，c o n t r i b u t i n gt ot h es u p p l yo fc a r b o n ，d u r i n gw h i c h t i m e ，p r o t e i nt u r n o v e ri sa tac o n s i s t e n t l yl o wl e v e l t h i sc o n t i n u e s u n t i li n t e r n a lo re x t e r n a lc o n d i t i o n si n i t i a t et h eo n s e to fs e n e s c e n c e l e a fs e n e s c e n c ei sap e r i o do fm a s s i v em o b i l i z a t i o no fn i t r o g e n ，c a r b o n a n dm i n e r a l sf r o mt h em a t u r el e a ft oo t h e rp a r t so ft h ep l a n ta n di sa h i g h l yr e g u l a t e d 。o r d e r e ds e r i e s o fe v e n t s i n v o l v i n gc e s s a t i o no f p h o t o s y n t h e s i s ，d i s i n t e g r a t i o n o f c h l o r o p l a s t s ，b r e a k d o w n o f l e a f p r o t e i n s ，l o s so fc h l o r o p h y l la n dr e m o v a lo fa m i n oa c i d s i ti st h o u g h t t oc o n t r i b u t et of i t n e s s b yr e c y c l i n gn u t r i e n t st oa c t i v e l yg r o w i n g r e g i o n s i na n n u a lp l a n t s ，w h i c hi n c l u d em o s ta g r i c u l t u r a lc r o p sa n d ，i n a d d i t i o n ，t h em o d e lp l a n ts p e c i e s ，a r a b i d o p s i s ，t h em o b i l i z a b l en u t r i e n t s f r o mt h ee n t i r ep l a n ta r es t o r e du l t i m a t e l yi nt h ed e v e l o p e ds e e d s s i n c e ac o n s i d e r a b l ep e r c e n t a g eo fn i t r o g e nf o rg r a i nf i l l i n gi sd e r i v e df r o m v e g e t a t i v ep l a n tp a r t s ，w i t ho n l yam i n o rp o r t i o nb e i n gt a k e nu pf r o mt h e s o i l d u r i n gs e e dd e v e l o p m e n t ，r e m o b i l i z a t i o nf r o ms e n e s c i n gl e a v e si s c e n t r a lf o rt h en u t r i e n tb u d g e ti ns e e dc r o p s r e c e n t l y ，m u c ha t t e n t i o nh a sb e e nf o c u s e do nl e a fs e n e s c e n c ea saf o r m 5 r e v i e w s o fp r o g r a m m e dc e l ld e a t h ( p c d ) ，ag e n e t i c a l l y c o n t r o l l e d s y s t e mo f s e l f d e s t r u c t i o n a tt h ec e l l u l a rl e v e l ，t h es e n e s c e n c ep r o g r a mu n f o l d s i na no r d e r l ym a n n e r c h l o r o p l a s t s ，w h i c hc o n t a i nm o s to ft h ep r o t e i ni n al e a fc e l l a r eo n eo ft h ef i r s to r g a n e l l e st ob et a r g e t e df o rb r e a k d o w n o t h e r o r g a n e l l e s ，s u c h a st h e p e r o x i s o m e ，a l s ou n d e r g o b i o c h e m i c a l c h a n g e sa ss e n e s c e n c ep r o c e e d s t h en u c l e u s ，w h i c hi sn e e d e df o rg e n e t r a n s c r i p t i o n ，a n dt h em i t o c h o n d r i a ，w h i c ha r ee s s e n t i a lf o rp r o v i d i n g e n e r g y ，r e m a i ni n t a c tu n t i lt h el a s ts t a g e so ft h es e n e s c e n c e 1 2t h eo n s e to f 1 e a fs e n e s c e n c e t h ei n i t i a t i o no fl e a fs e n e s c e n c ec a nb ei n d u c e db yav a r i e t yo f i n t e r n a la n de x t e r n a lf a c t o r s 【9 w h il et h ei n i t i a t i o no fl e a fs e n e s c e n c ed e p e n d su p o nt h ea g eo ft h e l e a fa n dt h er e p r o d u c t i r ep h a s eo ft h ep l a n t ，e x t e r n a lf a c t o r ss u c ha s n u t r i e n td e f i c i e n c y ，p a t h o g e n i ca t t a c k ，d r o u g h t ，1 i g h t1 i m i t a t i o n ，a n d t e m p e r a t u r e c a ni n d u c e p r e m a t u r es e n e s c e n c e p l a n t sh a v et or e s p o n d r a p i d l yt od e t e r i o r a t i n ge n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n ss i n c e ，u n l i k ea n i m a l s ， t h e yc a n n o tm o v ei no r d e rt of i n da m o r ef a v o r a b l es i t u a t i o n o n er e s p o n s e t h a tp l a n t sc a nm a k ei st or e m o v et h o s ep a r t so ft h ep l a n tt h a ta r en o t e s s e n t i a l f o re x a m p l e ，ad i s e a s e dl e a fd u et op a t h o g e ni n f e c t i o nw i l l s e n e s c e ，d i ea n dd r o po f ft h ep l a n t ，t h u sh e l p i n gt op r e v e n ts p r e a do f d i s e a s ea n da l l o w i n gt h er e s to ft h ep l a n tt oc o n t i n u ei ni t sd e v e l o p m e n t s i m i l a r l y ，m i n e r a ld e f i c i e n c y ，n i t r o g e nd e f i c i e n c y ，1 i g h tt i m i t a t i o na n d d r o u g h ts t r e s sw i l li n i t i a t et h eo n s e to fs e n e s c e n c e ，w h i c hm a yr e s u l t i n e a r l ys e e dd e v e l o p m e n t a n dr e d u c e d p l a n t 1 i f es p a n h o w e v e r ，a d i f f e r e n c ef r o mt h en a t u r a la n dp r o g r a m m e ds e n e s c e n c ei st h a t ，i nt h e s e c a s e s ，t h ep r o c e s s e sm a yb er e v e r s i b l ei ft h es t r e s sc o n d i t i o n sa r e r e l i e v e db e f o r es e n e s c e n c eh a sp r o g r e s s e db e y o n dac e r t a i np o i n t 吵 h o w e v e r ，l e a fs e n e s c e n c eisa ni m p o r t a n tp a r to ft h ed e v e l o p m e n to f p l a n ta n dw h e nal e a fr e a c h e sac e r t a i na g e ，o rw h e nt h er e p r o d u c t i v ep h a s e o ft h ep l a n tr e a c h e sac e r t a i ns t a g e ，s e n e s c e n c ew i l lb ei n i t i a t e di nt h e l e a fe v e ni ft h ep l a n ti sg r o w i n gu n d e rf a v o r a b l ec o n d i t i o n s a 1 lt h e m a i o r p l a n t h o r m o n e sh a v e b e e ns h o w n d e f i n i t i v e l y t oh a v ear o l ei n t h e r e g u l a t i o no fs e n e s c e n c e ，w i t hc y t o k i n i n sd e l a y i n gs e n e s c e n c e ，e t h y l e n e m o d u l a t i n gt h et i m i n go fs e n e s c e n c e ，a n dt h eo t h e rh o r m o n e sp l a y i n g1e s s r e v i e w s p r o m i n e n tr o l e s 7 i 3l e a fs e n e s c e n c e i sa c t i v e l y r e g u l a t e d b y d i f f e r e n t i a l g e n e e x p r e s s i o n l e a fs e n e s c e n c e ，1 i k eo t h e rd e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e s ， i s a c t i v e l y r e g u l a t e db y d i f f e r e n t i a l g e n ee x p r e s s i o n t r a n s c r i p t l e v e l sf o r p h o t o s y n t h e t i cg e n e s s u c ha s 拍c s ( s m a l ls u b u n i to fr u b i s c o ) a n dc a b ( c h l o r o p h y l la 伊b i n d i n gp r o t e i n ) d e c l i n e ，w h i l e o t h e r g e n e s b e c o m e a c t i v a t e d u s i n gd i f f e r e n t i a ls c r e e n i n ga n d s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n t e c h n i q u e s ，r e s e a r c h e r sh a v ei d e n t i f i e dg e n e sw i t hi n c r e a s e de x p r e s s i o n d u r i n g s e n e s c e n c e t h e s e g e n e s h a v e b e e ni d e n t i f i e di n h r a b i d o p s i s ， o i l s e e dr a p e ，t o m a t o ，h a r l e y ，p o t a t o ，c u c u m b e r ，r i c e ，w h e a t ，a n dm a i z e s u c hg e n e sa r eo f t e nr e f e r r e dt oa ss a g so rs e n e s c e n c e u p r e g u l a t e d g e n e s a m o n g t h e i d e n t i f i e ds e n e s c e n c e i n d u c e d g e n e s a r e g e n e se n c o d i n g p r o t e a s e s ，r n a s e s ，g l ns y n t h e t a s e ，m e t a ll o t h i o n e i n s ，p r o t e a s er e g u l a t o r s a c eo x i d a s e ，l i p a s e s ，g l y o x y l a t ec y c l ee n z y m e s ，c a t a l a s e ，e n d o x y l o g l u c a n t r a n s f e r a s e ，p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n s ， a t p s u l f u r y l a s e ， g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ，c y tp 4 5 0 ，a n dp o l y u b i q u i t i n 1 4l e a fs e n e s c e n c ei si n v o l v e di nm u l t i p l es i g n a l i n gp a t h w a y s r e s e a r c h e r sh a v eb e g u nt oe x a m i n et h es i m i l a r i t i e sa n dd i f f e r e n c e s i n g e n ee x p r e s s i o nd u r i n gn a t u r a ls e n e s c e n c e ，h o r m o n et r e a t m e n t ，a n d s t r e s sb ym e a s u r i n gt h ei n d u c t i o no fs e n e s c e n c er e l a t e dg e n e s s t u d i e s w i t ha b a ，e t h y l e n e ，c y t o k i n i n ，m e t h y lj a s m o n a t e ，w o u n d i n g ，d e h y d r a t i o n ， a n dd a r kt r e a t m e n th a v es h o w nt h a tt h e s e g e n e s a r e d i f f e r e n t i a l l y r e g u l a t e d ，s u g g e s t i n gt h a tt h e r ea r em u l t i p l es i g n a l i n gp a t h w a y sl e a d i n g t ot h e i ri n d u c t i o n e x p r e s s i o no fs o m es e n e