（微生物与生化药学专业论文）3棕榈酰莽草酸的非水相酶促合成.pdf

摘要 摘要 3 棕榈酰莽草酸( 3 p a l m i t y l o x ys h i k i m i ca c i d ，3 - p s a ) 是一种化学新单体( c h e m i c a l n e w e n t i t y ) ，属脂溶性莽草酸类衍生物。莽草酸( s h i k i m i ca c i d ，s a ) 是一种从中药木兰 科植物八角茴香中提取的具有生理活性的天然产物，是抗h 5 n l 型禽流感特效药“达菲”的 合成原料，同时它本身有抗血栓和减轻局灶性脑缺血损伤的作用。这种3 位选择性酯化 保护的s a 在手性药物合成中具有重要意义，抗h 5 n l 型禽流感药物的作用靶点神经酰胺 酶，其天然底物唾液酸( 2 脱氧n 乙酰神经氨酸) 的构型与3 一位手性不变，4 和孓位构 型翻转了的转氨化s a 相吻合。以3 一棕榈酰莽草酸或其他脂肪酸酰化莽草酸为合成中间 体，可以合成一系列“达菲”结构类似物；在方法学上，选择性保护莽草酸3 位羟基的一 步法合成为以莽草酸为中间体继续合成其他药物提供一种简便方法。与s a 相比，3 - p s a 在结构上完好保持了s a 所具有的三个手性中心，且选择性的酯化保护了其中的3 位羟 基，因而在体内可能具有与s a 相类似的抗血栓和减轻局灶性脑缺血损伤等生理活性；单 酰化修饰会使3 p s a 的脂水分配特性与s a 相比得到改善，脂溶性和血脑屏障的穿透能力 得到增强。综上所述，3 位选择性保护的s a 在手性药物的合成与改善s a 本身的生理活 性两个方面很重要。 本文首先借助液质联用建立莽草酸及其单酰化产物的薄层分析法，包括展开系统及 显色方法的选择。 在合成方面，首先对莽草酸脂溶性衍生物的酶法合成进行初步研究，证实n o v o z y m 4 3 5 可以对莽草酸的羟基选择性的催化酰化，而对莽草酸的羧基无催化活性。相对化学 催化剂浓硫酸，二氯亚砜，酶催化不会发生消旋，聚合等副反应。比较了两种酰化剂， 乙酸酐和乙酸乙烯酯，它们酰化活性过强，不利于酶催化体现其优势。 酶活研究表明酶催化莽草酸棕榈酰化时可以得到单一的单酰化物，而无酶催化时此 反应不能进行。将合成产物经硅胶柱纯化并作进一步结构鉴定，发现n o v o z y m4 3 5 可以 选择性的催化莽草酸的3 位羟基。由于这种合成方法反应生成的水不能及时除去，造成 合成转化率不高，增加分离纯化的负担。为解决除水问题，利用溶剂叔戊醇可以与水形 成最低共沸混合物这一性质，用减压蒸馏和流加叔戊醇的方法，在反应过程中除水。新 的合成方法在莽草酸与棕榈酸比例为1 ：1 2 4 时将莽草酸的转化率提高至9 5 。根据反应 后混合物的组成，设计了新的分离纯化方法，避开了使用硅胶柱色谱这种限制分离量， 污染又严重的分离方法，最终形成制备及分离纯化可达1o g 级的工艺。 最后，将非水相酶促酰化方法的适用范围的推广，证实饱和脂肪酸一月桂酸、豆蔻 酸、硬脂酸、花生酸；不饱和脂肪酸油酸、亚油酸、棕榈油酸可以适用这种催化方法， 棕榈酸甲酯也可以替换棕榈酸进行酰化反应。 关键词：3 棕榈酰莽草酸，莽草酸，n o v o z y m4 3 5 ，非水相，生物催化， a b s t r a e t a b s t r a c t 3 - p a l m i t y l o x ys h i k i m i ca c i d ，3 - p s ai san e wc h e m i c a le n t i t y ；i t i sal i p i d s o l u b l e d e r i v a t i v eo fs h i k i m i ca c i d s h i k i m i ca c i d ，s h i k i m i ca c i d ，i san a t u r a lp r o d u c tw i t hb i o a c t i v i t y e x t r a c t e df r o mt h ef r u i to fl l l i c i u mv e lu mh o o k f ( m a g n o l i a c e a e ) i ti st h em a t e r i a lt o s y n t h e s i so ft a m i f l uw h i c hi st h eo n l ye f f e c t i v em e d i c i n ea g a i n s th 5 n la v i a ni n f l u e n z aw h i l e i ti sa l s oh a sa n t i t h r o m b o s i sa c t i v i t ya n dc a nr e l i e v eb r a i nd a m a g ea f t e ri s c h e m i a - r e p e r f u s i o n ， c o m p a r i n gw i t hs h i k i m i ca c i d 3 - p s am a i n t a i n sc h i r a l i t ) r o ft h r e eh y d r o x y lw h o l l ya n d s e l e c t i v e l yp r o t e c t3 - h y d r o x y l ，w h i c hi s e s s e n t i a lt o s h i k i m i ea c i du s a g ei n c h i r a ld r u g s y n t h e s i s f o re x a m p l e ，d r u ga g a i n s th s n la v i a ni n f l u e n z ai n f l u e n c e so nn e u r a m i n i d a s e i t s n a t u r a ls u b s t r a t es i a l i ca c i d ( 2 - d e o x y - n a c e t y l n e u r a m i n i ca c i d ) m a i n t a i n ss p a t i a l c o n f i g u r a t i o no f3 - h y d r o x y la n dc o n v e r ts p a t i a lc o n f i g u r a t i o no f4 - h y d r o x y la n d5 - h y d r o x y l t h ep r o d u c to fs e l e c t i v e l ya c y l a t i o no fs h i k i m i ca c i d3 - h y d r o x y lw i mas e r i e so ff a t t ya c i dc a n b em a t e r i a lt os y n t h e s i z et a m i f l ua n a l o g u e a sam e t h o d ，i ta l s oo f f e r sa no n e s t e ps y n t h e s i s t op r o t e c ts h i k i m i ca c i dw h i c hh e l p ss h i k i m i ca c i da sm a t e r i a lt os y n t h e s i z eo t h e rb i o a c t i v e s u b s t a n c e 3 p s am a yh a v es i m i l a ra c t i v i t yt os h i k i m i ca c i dw h i l ea c y l a t i o no fs h i k i m i ca c i d o p t i m i z et h el i p i d w a t e rp a r t i t i o n a b o v ea l l ，s e l e c t i v e l yp r o t e c t i o n3 - h y d r o x y li si m p o r t a n tt o i t su s a g ei nc h i r a ld r u gs y n t h e s i sa n ds h i k i m i ea c i da c t i v i t yi m p r o v e s i nt h i sp a p e r , f i r s t l y , an e wt l cs y s t e m ，i n c l u d i n gm o b i l ep h a s es y s t e ma n dc o l o r a t i o n m e t h o d ，i ss e t t e l e du pt oa n a l y z es h i k i m i ca c i da n d i t sa c y l a t i n gd e r i v a t i v e sd u et ot h eh e l po f h p l c m s w i t l lt h i sa n a l u s i sm e t h o d ，t h ei n v e s t i g a t i o nr e s e a r c h e so ne n z y m ec a t a l y z e da c y l a t i o no f s h i k i m i ca c i d ，c o n f i r m i n gt h a tn o v o z y m4 35c a ns e l e c t i v e l ya c y l a t e dh y d r o x y lo fs h i k i m i c a c i dw i t h o u ti n f l u e n c eo nc a r b o x y l c o n t r a s tt oc h e m i c a lc a t a l y s ts u l f u r i ca c i dw h i c h1 e a d st o p o l y m e r i z a t i o no fs h i k i m i ca c i da n dd i c h l o r a ls u l f i d ew h i c hl e a dt or a c e m i z a t i o n ，n o v o z y m 4 3 5w i l ln o ti n d u c et h e s es i d er e a c t i o n c o n s i d e r i n gt w oa c y l a t i o nr e a g e n t ，a c e t i ca n h y d r i d e a n dv i n y la c e t a t eh a v et o os t r o n ga c y l a t i n ga c t i v i t yt os h o wt h ea c t i v i t yo fn o v o z y m4 3 5 i nt h ei n v e s t i g a t i o no fn o v o z y m4 35a c t i v i t yt os h i k i m i ca c i d ，e n z y m es h o w st h ea c t i v i t y o fs e l e c t i v e l ya c y l a t e d 3 - h y d r o x y lw h i c ho n l yo n ek i n d o fm o n o a c y l a t i n gp r o d u c ti s s y n t h e s i z e d w ep u r l f yt h ep r o d u c tb ys i l i c ag e lc o l u m na n di d e n t i f y i t ss t r u c t u r et ob e 3 - p a l m i t y l o x ys h i k i m i ca c i d t k sa l s o v a l i d a t en o v o z y m4 3 5c a l ls e l e c t i v e l ya c y l a t e d 3 - h y d r o x y l b e c a u s et h o u g ht h i sm e t h o d ，w a t e rp r o d u c e db yt h er e a c t i o nc a nn o tb er e m o v e d l i m i t sp e r c e n tc o n v e r s i o na n db u r d e n e dt h ep u r i f i c a t i o n ，s oan e wt e c h n i c sw h i c hc a nr e m o v e t h ew a t e rp r o d u c e di sd e v e l o p e da n ds y n t h e s i ss c a l ei si m p r o v e dt o10g r a ml e v e l t h es o l v e n t t e r t a m y la l c o h o lm i x e dw i mw a t e rc a nf o r mm i n i m u mb o i l i n gp o i n ta z e o t r o p e ，r e d u c e d p r e s s u r ed i s t i l l a t i o na n da d d i n gt e r t - a m y la l c o h o lt h o u g ht h er e a c t i o np r o c e d u r ec a nm o v e t h e w a t e rf r o mr e a c t i o ns y s t e mc o n s i s t e n t l ya n dr a i s es h i k i m i ca c i dp e r c e n tc o n v e r s i o nt o9 5 i f s h i k i m i ca c i dr e a c ta n dp a l m i t i ca c i di nt h ep r o p o r t i o no f1 ：1 2 4 a c c o r d i n gt ot h i ss y n t h e t i c a l m e t h o d ，an e wp u r i f i c a t i o nw a yi sd e v e l o p e dt oa v o i ds i l i c ag e lc o l u m nw h i c hh a sl i m i t e d q u a n t i t ya n ds e r i o u sp o l l u t i o n a tl a s t ，w ee x p a n dt h eu s a g eo ft h i sk i n do fr e a c t i o n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，i n c l u d i n gl a u r i e a c i d ，m y r i s t i ca c i d ，s t e a r i ca c i da n da r a c h i ca c i d ；u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，i n c l u d i n go l e i ca c i d ， l i n o l e i ca c i d ，z o o m a r i ca c i d ，a l lt h e s ec a nr e a c tl i k ep a l m i t i ca c i dc a t a l y z e db yn o v o z y m4 35 1 1 a b s t r a c t b e s i d e s ，m e t h y lp a l m i t a t ec a nr e p l a c ep a l m i t i ca c i di nr e a c t i o n k e y w o r d s ：3 - p a l m i t y l o x ys h i k i m i ca c i d ，s h i k i m i ca c i d ，n o v o z y m4 3 5 ，b i o c a t a l y s i s ， n o n - a q u e o u sm e d i a i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是誉人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 盔宜叟土 日 期： 亟! 墨垂i d 墅d 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 本课题的研究背景 1 1 1 莽草酸及衍生物的研究进展 莽草酸是本文研究反应的反应物，也是酶催化识别的底物，首先对莽草酸潜在的生 理活性，在合成中的应用以及莽草酸酰化方面的研究作简单介绍。 1 1 1 1 莽草酸及衍生物的生理活性 莽草酸 s h i k i m i ca c i d ，s a ，( 3 r 4 s ，5 r ) 3 , 4 ，5 一三羟基1 环己烯1 羧酸，( 3 r ，4 s ，5 r ) 3 , 4 ，5 - t r i h y d r o x y c y c l o h e x - 1 一e n e 一1 一c a r b o x y l i ca c i d ，分子式c 7 h l 0 0 5 ，摩尔质量1 7 4 1 5 9 m o l ， c a sn o 1 3 8 5 9 0 ，e i n e c sn o 2 0 5 3 3 4 2 ，白色粉末，比重1 6 4 ，熔点1 8 5 1 8 7 0 c ，易溶 于水，在水中的溶解度为1 8 0 9 l 一。结构见图1 1 】是一种从中药木兰科植物八角茴香中提 取的具有生理活性的天然产物【l 】，有抗血栓和减轻局灶性脑缺血损伤的作用，同时也是 抗h 5 n l 型禽流感特效药“达菲”的合成原料。 o h ： o h 图1 1 莽草酸结构图 f i g 1 1s h i k i m i ca c i ds t r u c t u r e 莽革酸首次由e y k m a n 在1 8 8 5 年从i l l i c i u mr e l i g i o s u m 的果实中分离提取出。s i e b z u c c 等人以最初发现莽草酸的上述植物的日文名s h i k i m i n o k i 命名了莽草酸。后期的 研究发现莽草酸广泛存在于许多植物的果实和叶子中【2 j 。除了八角类植物含莽草酸外， 还有如羊红膻【3 】，毛蕊老鹳草【4 】，鸡蛋参【5 】，金丝桃6 1 ，诃子【7 1 等植物都可提取出莽草酸。 在e y k m a n 早期的研究中，仅描述莽草酸为一个三羟基环己烯甲酸，同时观察到莽草酸 在酸性条件下加热很易形成对羟基苯甲酸，但并未确定其相对和绝对构型。1 9 3 0 年， f i s c h e r ，f r e u d e n b e r g 和k a 仃e r 等几人对莽草酸的绝对构型进行了确赳8 。1 0 】。紧接着，g r e w e 对( 一) 一莽草酸的化学性质作了研鲥u 。1 引。自此之后，莽草酸就应用于许多领域的研究， 早期研究主要是除草剂【1 3 】和光化学f 1 4 j 。 ( ) 莽草酸因存在莽草酸途径( 图1 2 ) ，在生物合成中有重要的作用。早期莽草酸途径 u 5 。1 6 l 以及莽草酸代谢的研究 1 7 - 1 8 】是莽草酸早期在生物学方面主要的研究热点。 莽草酸途径在植物和微生物，包括细菌、真菌和a p i c o m p l e x a n 寄生虫中均存在， 因为三种含芳香环的氨基酸，苯丙氨酸( l p h e n y l a l a n i n e ) 、酪氨酸( l t y r o s i n e ) 和色氨酸 ( l t r y p t o p h a n ) 均经由莽草酸途径生物合成。而哺乳动物由食物中摄取上述三种氨基酸， 不存在莽草酸途径，因此合成莽草酸途径中的某种酶的抑制剂很可能选择性的抑制途径 中的这种酶催化的转化【2 j 。其中很多人合成莽草酸的结构类似物希望能抑制酶e p s p ( 5 烯醇内酮酰莽草酸3 磷酸合成酶) ，因而具有抗细菌，抗真菌，抗寄生虫或除草活性。 江南大学硕士学位论文 如图1 3 ，( 6 j s ) 6 氟莽草酸1 9 1 【( 6 回6 一f l u o r o s h i k i m i ca c i d2 】报道有抗细菌活性并作为莽草 酸途径的酶学研究的探针f 2 0 1 。 h o h 。爷卯h z 葡萄糖呜 d - 赤藓o h 糖- 4 磷酸酯器h 2 p 0 3 0 彳0 2 。 b p 0 3 h 2 磷酸烯醇丙酮酸( p e p ) 6 h 3 脱氢奎尼酸 6 h 3 脱氢莽草酸 。儿c 。： 5 烯醇丙酮酸莽草酸- 3 - 磷酸酯( 5 一e p s - 3 一p ) n h 3 ： c 0 2 - 苯丙氨酸 o o h 3 脱氧d 阿拉伯庚酮糖酸一 7 - 磷酸酯( d a h p ) o h 奎尼酸 o h 莽草酸 o h 分支 _ h f i o h e p s p 否耐 0 h 莽草酸3 磷酸酯 c 0 2 - 叶酸 异戊二 类醌类 酪氨酸 图1 2 莽草酸途径 f i g 1 - 2s h i k i m i ca c i dp a t h w a y 色氨酸 量 o h 图1 3 ( 6 s ) 6 氟莽草酸结构式 f i g 1 3 ( 6 s ) - 6 一f l u o r os h i k i m i ca c i d 莽草酸结构确定后，1 w a o 就对其毒性作了研究，发现其无致癌活性2 1 1 ；另外，近期 研究发现，莽草酸与会属铂的络合物有抗肿瘤活性。2 0 0 0 2 0 0 6 年，北京中医药大学 作了一系列关于莽草酸三乙酯，异亚丙基莽草酸和莽草酸的药理活性，包括抗血小板聚 2 第一章绪论 集【2 3 。2 1 ，缩小局灶性脑缺血后脑梗死体积、降低神经功能评分、减轻脑水肿程度，并能 提高缺血区脑血流量。因此，我们推测莽草酸单酰化或二酰化的产物会有抗血小板聚集 或提高缺血区脑血流量的功能。 1 1 1 2 莽草酸在合成中的应用 莽草酸除了莽草酸途径在研究生理活性物质的应用外，近期研究的焦点主要在莽草 酸结构类似物有抗病毒活性。o s e l t a m i v i r 是唯一在我国上市可治疗禽流感的药物。h 5 n l 禽流感病毒属于甲型流感病毒的一个高致病性亚型，其中的h 和n 分别代表病毒表面的 两种蛋白质，h 是血凝素( h e m a g g l u t i n i n ) ，就如病毒的钥匙，它能打开和侵入人类或动物 的细胞；n 是神经氨酸酶( n e u r a m i n i d a s e ) ，其作用是破坏细胞，使病毒在感染者体内自由 传播。n 蛋白共有9 个类型，分为n l - n 9 ，h 蛋白有1 5 个类型，即h l - h 1 5 ，不同的n 蛋白 和h 蛋白结合，组成不同的病毒类型，毒性和传播速度也不同。h 5 n l 病毒就包含有h 5 蛋 白和n l 蛋白i 弱3 4 。抗h 5 n l 型禽流感药物的作用靶点神经酰胺酶，其天然底物唾液酸( 2 脱氧- n 乙酰神经氨酸) 的脱氢产物2 ，3 二脱氢2 脱氧- n 乙酰神经氨酸 ( 2 ，3 d i d e h y d r o 一2 d e o x y - n a c e t y l n e u r a m i n i ca c i d ，d a n a ) 的构型即与3 位手性不变，4 和5 位构型翻转了的转氨化s a 相吻合1 3 弼6 。d a n a ，z a n a m i v i r 和o s e l t a m i v i r 的结构式见图 】4 。 d a n a z a n a m i v i r o s e l t a m i v i r 图1 4d a n a ，z a n a m i v i r 和o s e l t a m i v i r 的结构式 f i g 1 - 4d a n a ，z a n a m i v i ra n do s e l t a m i v i rc h e m i c a ls t r u c t u r e h 5 n l 病毒1 9 6 1 年首次在南非被发现，病毒的毒性很强，病禽的死亡率可达1 0 0 。 国内不断有禽流感病毒感染人的病例，世卫组织发出的警告说：h 5 n 1 型禽流感病毒已经 分化为印尼和罗马尼亚两个亚型，在人际范围内的传播只是时间问题，我们人类能做的 只有在禽流感的大规模暴发流行之前做好准备，研究治疗和预防禽流感的药物迫在眉 睫。 世界上具有抑制禽流感病毒活性的药物仅有两种，扎那米韦【3 刀( z a n 锄i v i r ) 由于1 3 服 生物利用度很低，只能采用局部给药方式，上市剂型为固体吸入剂，在我国还未上市： 奥司他韦( o s e l t a m i v i r ，商品名t a m i f l u ) ，2 0 0 1 年1 0 月在我国上市，专利由瑞士罗氏制药公 司持有，2 0 1 9 年到期。目前罗氏公司已将该药在中国的生产权卖给了上海上药集团和广 州广药集团，这两家公司正在积极申报该药在中国的药证。 江南大学硕士学位论文 o s e l t a m i v i r ，商品名为达菲，它的生产工艺也是由莽草酸为起始原料【3 8 】，图1 5 为合 成达菲的生产工艺路线。由结构上可以观察出，莽草酸与达菲3 位手性相同，4 ，5 位需要 将羟基转化为氨基，并将手性翻转。 试剂和反应条件：ie t o h ，t s o h ( c a t ) s o c l 2 ( 0 5e q ) r e f l u x ( 9 0 ) ；i im e 2 c ( o m e ) 2 ，t s o h ( c a t ) ( 9 2 ) ； i i im s c i ，e t 3 n ，c h 2 c 1 2 ( 8 0 ) ；i v 3 - p e n t a n o n e ，h c l 0 4 ( c a t ) ( 9 5 ) ；ve t 3 s i h ，t i c l 4 ，3 2 。( 3 ( 8 7 ) ；v i k h c 0 3 ，e t o h ，h 2 0 ，6 0 0 c ( 8 0 ) ；v i in a n 3 ，n i - h c i ，e t o h ，h 2 0 ( 8 6 ) ；m e 3 p , m e c n ( 9 7 ) ；n a n 3 ， n h 4 c ! ，d m f ；xa c 2 0 ，c h 2 c 1 2 a qn a h c 0 3 ( 4 4 f o rt w os t e p s ) ；x ir a - n i ，h 2 ，e t o h ；e t o h ， 8 5 h 3 p 0 4 ( 71 f o rt w os t e p s ) 图1 5 达菲的生产工艺路线 f i g 1 5t a m i f l us y n t h e t i cp a t hw a y 除了达菲外，8 0 年代以来，莽草酸作为手性化合物的合成前体合成药物或有生理活 性的物质，! t 1 3 z e y l e n o n 3 9 】，二嗯霉素( d i o x o l 锄y c i n ) 4 0 1 。z e y l e n o n 有抑制e h r l i c 肿瘤的显 著作用，并对培养的癌细胞有细胞毒性。它的两种光学异构体均可以莽草酸为起始原料 合成，而二嗯霉素有体外抑制白血病细胞l 1 2 1o 的作用。这些合成过程中，保护手性的 选择性单酰化合成中的一个保护步骤，但化学法往往存在步骤较繁，且易引起消旋的问 题。 4 第一章绪论 z e y l e n o n d i o x o l a m y c i n 图1 6z e y l e n o n ，二嚅霉素的结构 f i g 1 击z e y l e n o n ，d i o x o l a m y c i nc h e m i c a ls 仃1 j c n 鹏 1 1 1 3 莽草酸的酰化合成 在1 9 3 0 年莽草酸结构确定后，莽草酸结构类似物的合成已有大量研究，酰化、氨化、 卤代。早期的酰化研究主要是化学法，合成了一系列结构类似物。其中大多用到对三个 羟基的选择性保护方法。8 0 年代以来，莽草酸作为手性化合物的合成前体合成药物或有 生理活性的物质，如z e y l e n o n 、二噫霉素( d i o x o l a m y e i n ) 和达菲。莽草酸的单酰化就成为 合成中的一个保护步骤，但化学法往往存在步骤较繁，且易引起消旋的问题。 随着非水相酶催化技术的不断发展，有人利用酶催化研究莽草酸的酰化反应。2 0 0 6 年，n u r i aa r m e s t o 4 5 j 等人用假丝酵母脂肪酶a ( c a n d i d aa n t a r c t i c al i p a s eac a l a ) 催化 莽草酸甲酯和奎尼酸甲酯的单酰化，得到4 一位的单酰化产物。国内也已见有利用假丝酵 母脂肪酶b ( c a n d i d aa n t a r c t i c al i p a s eb ，c a l b ) 催化莽草酸甲酯的单酰化反应的报道【4 6 1 。 1 1 2 非水相酶催化 1 1 2 1 非水相酶催化的特点及发展 从传统概念上讲，生物催化剂包括酶、微生物细胞、动物细胞、植物细胞及一些细 胞器均是在水溶液环境中催化水溶性底物的转化。然而，随着生物技术的发展，生物催 化剂需要向更为广泛的应用方面发展。1 9 8 4 年，美国麻省理工学院的科学家k l i b a n o v 成功地实现了猪胰脂肪酶在9 9 的有机溶剂中催化三丁酸甘油酯与醇之间的转酯反应 【4 ，并证实了酶在1 0 0 0 ( 3 高温下，不仅能够在有机溶剂中保持稳定，而且酶还显示出很 高的催化转酯活力。这一发现为酶学研究相应用带来了又一次革命性飞跃。并成为生物 化学和有机合成研究中一个迅速发展的领域。 有机相酶催化反应在生物工程领域的极大意义引起了研究文献的爆炸性增长。2 0 多年来的研究表明，在有机介质中酶催化反应可以获得许多常规条件下所不具有的新特 征和优势：( 1 ) 可进行水不溶性化合物催化转化，使酶作用底物的范围大大拓宽；( 2 ) 改 变反应的平衡点，使水溶液中不能发生的反应向所期望的方向进行，催化水解反应的酶 可催化合成反应的进行，如转酯、酯化、氨解、酰基交换和转硫酯等；( 3 ) e h 于酶在有机 溶剂中结构上“刚性”的增加，对底物的专一性，包括区域专一性和对映体专一性均大大 提高，从而使实现对酶催化选择件的有目的调控成为可能；( 4 ) 酶的热稳定性大大提高； ( 5 ) 由于酶不溶于大多数有机溶剂，反应后易于回收和重复利用；( 6 ) n - q 避免长期反应中 微生物的污染；( 7 ) 减少或防止内水引起的副反应；( 8 ) 可方便地利用对水分敏感的底物 进行反应，如酸酐；( 9 ) 当使用挥发性溶剂作介质时，反应后的分离过程能耗降低【4 8 1 。 5 江南大学硕士学位论文 在传统概念中，有机溶剂易于引起酶蛋白变性而失活。实验表明，在无水或含微量 水( 1 ) 的有机溶剂中，酶的稳定性显著提高，如脂肪酶和溶菌酶在1o o o c 可保存若干小 时而不失活，这种热稳定性的提高是难以以化学交联、固定化、甚至是蛋白质工程的手 段所能达到的。热稳定性的产生可归结为两方面的原因：( 1 ) 酶结构刚性增强；( 2 ) 水含 量有限。通常，水溶液中的酶分子在结构上形成亲水区和疏水区，前者位于分子的表面， 与水相接触，环境中的水分子与酶蛋白功能区之间形成氢键，使蛋白质形成具有柔韧性 的空间结构，称为“开放”型空间结构。但当处于有机溶剂中时，蛋白质分子的疏水区暴 露出来，分子折叠受到一定程度的破坏，带电基团之间相互作用形成非活性的“封闭”构 象。酶分子结构刚性增强，对受热而引起折叠松散的抗性增强、表现为其热稳定性提高。 此外，在酶分子的不可逆变性过程中，水是一个必要的参与者。如随温度升高，酶分子 首先发生折叠及螺旋结构的“松散”。随后会发生一种或多种变性反应：形成错误的卷曲 结构、s - s 键受到破坏、天冬酰胺和谷氨酰胺残基脱酰胺基及天冬氨酸的肽键发生水解， 上述每一步反应都有水的参与。在无水或仅含微量水的有机介质中，这一系列变性作用 受到有效抑制，从而大大提高了酶的热稳定性。柱状假丝酵母脂肪酶在有机溶剂中和水 溶液中的稳定性比较也具备相似的结果。通常认为在极性溶剂中酶具有较差的稳定性， 大部分非水相酶反应均被限制于相对非极性的溶剂中。一方面非极性溶剂利于提高酶的 稳定性。另一方面，在非极性溶剂中酶易于保持其活性构象而表现出高的催化活力。 在水溶液中，酶分子中的疏水氨基酸有避开水而隐藏于分子内部的趋势，从而引起 分子折叠。当周围环境中的水为非极性溶剂所替代时，酶分子内的疏水基团分散，导致 三级结构的重排，这意味着酶分子构象在极端条件下会发生剧烈改变。酶分子的非极性 “口袋”由内向外翻转，其催化行为或空间结构似乎与水中有所不同，因而研究者推测在 非水介质中其立体选择性会有所改变。近年来的研究结果越来越证明了人们所预期的结 果：即在非水介质中酶常常会有高度的选择性，包括立体选择性、对映体选择性、区域 选择性和化学选择性。这为非水介质酶催化在有机合成领域开辟了极有意义的新天地。 迄今为止，已有以脂肪酶、蛋白酶为典型代表的多种酶用于非水介质中催化酯化、酯交 换、肽合成和大环内酯合成等多种反应，特别在前手性化合物的非对称合成、对映体的 选择性拆分等方面获得了诸多有意义的结果。 1 1 2 2 脂肪酶及其对映体选择性催化原理 在非水介质酶选择性催化研究中，脂肪酶( 甘油三酯酰基水解酶) 催化反应的对映体 选择性引起了特别的重视。在非水介质中，脂肪酶有以下特点：( 1 ) 在非极性溶剂中特别 稳定：( 2 ) 对大小、构象及立体化学结构不同的多种底物具有催化活力；( 3 ) 在非极性溶 剂中催化酯化反应的对映体选择性比常规水解反应要高。脂肪酶可催化的底物范围很 广，这说明蛋白骨架富有极好的柔韧性，从而可容纳许多大小不同、构象各异的底物分 子。目前，约有2 0 种不同来源的脂肪酶以商业化产品出现，对五种酶进行了x 一射线结 构分析，包括r h i z o m u c o rm i e h e i 脂肪酶( r m l ) 、人胰脂肪酶、p s e u d o m o n a s 脂肪酶( p g l ) 、 角质化酶和乙酰胆碱酯酶。结果表明，这些酶均为s e r 酯酶，蛋白链中含有“d 水解酶 6 第一章绪论 的典型折叠结构，即大部分平行的伊片段围绕在a 一螺旋核心的周围。活性中心s e r 周围 具有共同的五氨基酸序列：g l y x s e r - x g l y 。这种折叠结构使得所有的脂肪酶催化中心 的三个氨基酸一s e r ，h i s ，g 1 u a s p - 具有相同的排列方式：s e t 处于伊片断与仅一螺旋之间的 发夹结构弯角处，其他两个氨基酸h i s 和g l u a s p 位于s e r 的一侧，形成的氧离子空洞 位于s e r 的另一侧，从而构成了所有脂肪酶的共同催化机制：在水溶液中，一个“盖子” 覆盖在活性中心位点上，当脂类或有机溶剂存在时，“盖子”打开，暴露出活性中心，催 化底物进行转化脂肪酶具有很宽的作用底物范围，且在适宜条件下对大量的手性分子具 有高度的对映体选择性，因而脂肪酶被有机化学家广泛应用于光学纯化合物的制各中， 包括选择性水解、酯化或转酯制备药物前体、农用化学品或其他合成材料【4 9 卿】。 1 1 2 3n o v o z y m4 3 5 在药物合成中的应用 水解酶催化水解及相关的逆反应酯化、酰胺化等，在外消旋体的拆分中应用较多， 其用于不对称催化合成药物的例子有s c h e f i n gp l o u g h 公司对唑类抗真菌药s c h 5 6 5 9 2 的 合成。首先采用南极假丝酵母脂肪酶( n o v o z y m4 3 5 ) 酰化潜手性二醇，产生手性单酯， 然后再通过碘化和三唑钠取代等反应生成关键中间体，进而合成最终产物，合成路线如 下【5 l 】 1 n o v o z y m e 4 3 5 图1 7n o v o z y m4 3 5 应用于合成抗真菌药s c h 5 6 5 9 2 f i g 1 - 7t h e u s eo f n o v o z y m4 3 5i ns y n t h e s i so fa n t i - f u n g id r u gs c h 5 6 5 9 2 1 2 立题意义 1 3 棕榈酰莽草酸( 3 一p a l m i t y l o x ys h i k i m i ca c i d ，简称3 p s a ) ，是一种化学新单体 ( c h e m i c a ln e we n t i t y ) ，属脂溶性莽草酸类衍生物，应当具有与莽草酸相类似的抗血栓 和减轻局灶性脑缺血损伤等生理活性，但通过单酰化修饰，使莽草酸的油水分配特性得 到改善，其脂溶性和血脑屏障的穿透能力将会得到增强，生理活性预计将比莽草酸有所 改善，甚或呈现新特点；莽草酸途径说明其可能有具有抗细菌，抗真菌，抗寄生虫或除 草活性，有望发展为一类新的药物。 7 江南大学硕士学位论文 o l 。 图1 8 3 棕榈酰莽草酸的结构图 f i g 1 - 83 - p a l m i t y i o x ys h i k i m i ca c i d ： o h o h 2 3 棕榈酰莽草酸因在结构上完好保持了莽草酸本身所具有的三个手性中心，且 选择性的酯化保护了其中的3 位羟基，因而在手性药物合成中具有重要意义。举例如下： 由合成达菲的生产工艺路线可知，前五步主要为了在保持莽草酸的3 位手性的前提下， 将其醚化，而我们能够在维持手性不变的前提下，选择性地将莽草酸的3 位羟基一步酰 化，为合成o s e l t a m i v i r 的结构类似物提供了简便的方法。由于适应这种催化的脂肪酸有 很多，可以合成一系y i j o s e l t a m i v i r 的结构类似物，对构效关系的研究以及寻找药效更优 化的结构提供了基础。 3 与s a 相比，3 - p s a 选择性的酯化保护了其中的3 位羟基，因而在体内应当具有与 s a 相类似的抗血栓和减轻局灶性脑缺血损伤等生理活性。单酰化修饰的结果，会使 3 - p s a 的油水分配特性与s a 相比得到改善，脂溶性和血脑屏障的穿透能力得到增强，因 而3 p s a 的生理活性预计将比s a 有所增强，甚或呈现新特点，从而发展为一类新的药物。 4 非水相酶催化的探索性研究：用n o v 4 3 5 脂肪酶催化莽草酸的酰化此前未见任何 报道，本研究补充了这一处国际和国内的空白，证明n o v 4 3 5 在叔戊醇的体系中可以识别 莽草酸的3 位羟基。本研究采用非水相酶促有机合成技术，以棕榈酸和莽草酸为原料， 直接合成该化合物。该合成方法步骤少，无副反应和副产物，无三废排放，分离纯化工 艺简单，产品纯度高，且具有通用性，适用于不同链长的脂肪酸跟莽草酸( 或其低碳醇 酯) 之间的3 一酰化产物的合成。 1 3 本课题研究的主要内容 1 莽草酸脂溶性衍生物的酶法合成初探 2 莽草酸的非水相酶促棕榈酰化的研究 3 棕榈酰莽草酸的分离提纯，结构鉴定及其理化性质的测定 4 3 一棕榈酰莽草酸的毒性与生理活性初步研究 5 非水相酶促酰化方法的适用范围的推广研究 8 第二章莽草酸脂溶性衍生物的酶法合成初探 2 1 引言 由于莽草酸及莽草酸甲酯的紫外吸收在2 1 0n n l 左右，没有特征性吸收，很难用紫 外吸收检测器进行检测，我们的合成目标又是新产物，没有标样。为了解决合成中的产 物的分析检测问题，我们以莽草酸以及莽草酸甲酯的乙酰化反应混合物为体系，借助高 效液相一质谱联用( h p l c m s ) 作为检测手段，自行建立了莽草酸及其甲酯的酰化产物的 薄层色谱( t l c ) 分析检测方法和参考标样。 由于n o v o z y m4 3 5 对莽草酸催化活性的报道国内外未见报道，我们对此酶催化作 了初步研究，包括化学催化剂与酶的比较，选择n o v o z y m4 3 5 作为生物催化