（水产养殖专业论文）紫菜产品品质及安全质量分析研究.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以。求实、创新一的科学精神从事研究工作 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：j 盆障 日 期：盗4c 厶z 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 作者签名：盈峥 日期：浏：生二 2 0 0 8 年硕士学位论文 摘要 应用顶空固相微萃取和气相色谱质谱联用技术，对坛紫菜、条斑紫菜及其 一个突变品系的生长藻体挥发性物质进行分析，共分离鉴定出6 6 种挥发性组分， 3 个紫菜试样中分别含有3 6 、4 4 和4 5 种。鉴定组份中有2 1 种为紫菜共同的挥 发性物质，其中8 十七烯和十五烷的相对量值最大，可能是紫菜重要的挥发性风 味物组份，而一些短链醛、醇及酮类可能构成紫菜的特征嗅感物质。野生型条斑 紫菜与其突变品系y 铲之间的风味物组份无显著差别；条斑紫菜所含挥发物中 醛、酮相对量值明显高于坛紫菜。 应用柱前衍生反相高效液相色谱技术，对坛紫菜、条斑紫菜及其一个突变品 系中的1 6 种主要游离氨基酸( f r e ea m i l l oa c i d ，f a a ) 的含量进行检测分析。条 斑紫菜及其突变品系的总f a a 含量明显高于坛紫菜，其中丙氨酸、精氨酸、谷 氨酸和天冬氨酸含量均最大，是影响紫菜风味的重要因子。生长日龄的增长影响 了总f a a 含量的降低，而a i a 和1 3 1 u 含量的降低可能是主要的因素。因此佐证 了条斑紫菜风味品质优于坛紫菜，而条斑紫菜早期收获产品优于后期收获的产 品。 本论文还对南通地区生产条斑紫菜干紫菜中三嗪类农药扑草净的残留量进 行调查性检测。实验应用固相萃取结合反相高效液相色谱技术，该方法的线性范 围在0 0 1m g k g - - - 0 4m g k g 之间，检出限为0 0 1m g k g ，回收率在8 2 4 1 - , 1 0 2 8 6 之间。结果表明，农药扑草净残留量在南通产干紫菜中微量存在，条斑紫菜主产 区海安和如东地区1 6 家紫菜栽培企业2 0 0 8 年生产的干紫菜中扑草净残留量均低 于日本肯定列表规定的紫菜中扑草净的检出限。 关键词：紫菜、风味、挥发性化合物、游离氨基酸、扑草净 2 0 0 8 年硕士学位论文 a bs t r a c t h e a ds p a c es o l i dm i e r o e 舭t i o na n dg c - m sw e r ee m p l o y e dt oi n v e s t i g a t et h e p r o f i l e so fv o l a t i l ec o m p o u n df r o mp o r p h y r ah a i t a n e n s i s ，p o r p h y r ay e z o e n s i sa n da g r e e nm u t a n to fpy e z o e n s i sa n d6 6v o l a t i l ec o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e dw i t h3 v a r i e t i e sc o n t a i n i n g3 6 ，4 4a n d4 5 a m o n g6 6v o l a t i l ec o m p o u n d s ，2 1c o m p o u n d s w e r ei n c l u d e di n3v a r i e t i e s 、7 l ，i 也k g hr e l a t i v ea m o u n to f8 - h e p t a d e c e n ea n d p e n t a d e c a n e ，w h i c hm i g h tb er e s p o n s i b l ef o rt h ef l a v o ro fpy e z o e n s i s v o l a t i l e c o m p o u n d sw i t l ls h o r tc h a i na l d e h y d e ，a l c o h o la n dk e t o n ec o n s t i t u t et h ec h a r a c t e r i s t i c f l a v o ro f p y e z o e n s i s t h ev o l a t i l ec o m p o n e n t sa r es i m i l a rb e t w e e nt h ew i l d - t y p ea n d t h eg r e e nm u t a n to f 只y e z o e n s i s ，b u tt h e a l d e h y d e sa n dk e t o n e sa r eo fg r e a t e r a b u n d a n c ei np y e z o e n s i st h a nt h o s ei nph a i t a n e n s i s t h ee o n t e n t go f16m a j o rf r e ea m i n oa c i d s ( f a a ) i nph a i t a n e n s i s ，py e z o e n s i s a n dag r e e nm u t a n to f 户y e z o e n s i sw e r ed e t e r m i n e db yr e v e r s e d - p h a s eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 埘n lp r e - c o l u m nd e f i v a t i z a t i o n t h ec o n t e n t so f t h et o t 址f a ai n 旦y e z o e n s i sa n dt h em u t a n to f p y e z o e n s i sw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a n 卫h a i t a n e n s i s ，a n dt h ef o u rf a a a l a n i n e ，a r g i n i n e ，g l u t a m i ca c i da n da s p a r t i ca c i d ，o f w h i c ht h ec o n t e n ta r et h em o s t , m a yb et h em a i nf a c t o r s t h ec o n t e n to ft o t a lf a ai n z y e z o e n s i sw h i c hw a sa f f e c t e db ya l a n i n ea n dg l u t a m i ca c i dr e d u c e dw i t hl e a fa g e ， a n dt h a tp r o o f e dt h ec o n t e n t so fa l a n i n ea n d g l u t a m i ca c i dd o m i n a t et h ec h a n g eo f t h e t o t a lf a ac o n t e n ta n dt h ef l a v o ro ft h ee a r l yh a r v e s t e ds e a w e e di sb e t t e rt h a nt h e l a t t e r s o l i d p h a s e e x t r a c t i o nw i t h r e v e r s e d p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h yw a se m p l o y e d t os a m p l es u r v e yt h ep r o m e t r y nr e s i d u eo fd r i e dl a v e r i nn a n t o n g t h el i n e a rr a n g eo fp r o m e t r y ni so 0 1 m e e k 鲫4m e c k g ，a n dt h e d e t e c t i o nl i m i ti so 0 1m e g k g ，t h ef o r t i f i e dr e c o v e r yr a n g e d8 2 4 1 - - 1 0 2 8 6 嬲w e l l t h er e s u l th a v es h o w nt h ep r o m e t r y nr e s i d u eo fd r i e dl a v e re x i s t i n gi nt r a c ea m o u n t s i nn a n t o n g ，a n dt h er e s i d u ei n16c o m p a n i e s i nh a l a na n dr u d o n gi sl o w e rt h a nt h e 2 2 0 0 8 年硕士学位论文 d e t e c t i o nl i m i to f p o s i t i v el i s ts y s t e m ”i nj a p a n k e yw o r d s ：p o r p h y r a ，f l a v o r , v o l a t i l ec o m p o u n d ，f r e ea m i n oa c i d ，p r o m e t r y n 3 2 0 0 8 年硕士学位论文 文献综述 1 紫菜产品及品质 紫菜属红藻门( r h o d o p h y c o p h y t a ) 、红毛菜科( b a n g i a e e a e ) 植物【1 1 ，是一 种重要的经济海藻，约占全世界海藻产业的2 3 。紫菜在美国称l a v e r ，日本叫 n o d 。我国食用、栽培紫菜已有很长的历史，早在千年前的隋唐时期，我国已有 了食用紫菜的记录。明代李时珍在本草纲目中对紫菜的医疗价值做了说明。 条斑紫菜( p o r p h y r ay e z o e n s i s ) 和坛紫菜( ph a i t a n e n s i s ) 是我国两大紫菜 栽培种类。条斑紫菜藻体叶片状，叶形多为卵形或长卵形，随生长环境有较大的 变化，人工栽培的藻体一般为5 0 7 0c m ，有时可达lm 以上，厚2 5 3 0i s m ， 藻体单层，紫红、紫黑或紫褐色，基部拟圆或心脏形，边缘有皱褶，色素体单一， 是我国长江以北地区的主要栽培种类，也是日本、韩国最重要的栽培紫菜种类； 我国长江以南主要栽培种类是坛紫菜，藻体披针形或长卵形，人工栽培的藻体长 可达o 5 lm ，厚6 5 1 1 0 岬1 ，藻体单层细胞，局部双层，色暗绿紫而带褐色或 褐红色，基部为心脏形，少数圆形或楔形，边缘平整或有皱褶，多数细胞具单一 色素体，少数具双色素体，属我国特有种类【l 】。 由于具有丰富的营养和广泛的医用价值，紫菜又被称为“神仙菜、“长寿菜 。 紫菜中含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖、膳食纤维、胡萝卜素、维生素a 、维 生素b 1 、b 2 ，维生素c 、维生素b 1 2 和胆碱等物质，同时还含有人体所需的c a 、 p 、f c 、m g 、i 、s e 、z n 和m n 等多种矿物质。中医认为紫菜性味属甘、咸、寒， 有化痰软坚，清热利尿，补肾养心之功效。近年来的研究显示紫菜多糖具有多种 生物活性，条斑紫菜多糖具有增强免疫功能、抗衰老、抗凝血、降血脂、抑制血 栓形成等作用b3 】。紫菜所含的脂肪多为不饱和脂肪酸，能使胆固醇酯化，从而 降低血清和肝脏的胆固醇水平。 紫菜经过加工可制成多种食品，如烤紫菜片、紫菜汁、紫菜酱、紫菜果冻、 紫菜酱油、紫菜饼干、紫菜面条等，另外还可以做成罐头填充剂、饮料、汤料、 茶类制品、糕饼、糖果等食品【4 】。 目前，在紫菜交易初级市场，对条斑紫菜初加工品的质量仍然以感官经验标 4 2 0 0 8 年硕士学位论文 准评价为主，将干紫菜分为a 、b 、c 、d 等多个等级，每个等级根据不同的标 准再加分类。这种不按量值作为标准的评价方法往往会因人员的主观判断，造成 偏差，从而影响企业或买家的经济效益，造成市场的混乱。而规避这一难题的一 个有效方法就是对紫菜产品质量进行量值评估，从而指导市场的定价。紫菜食品 的质量除了与加工过程、工艺流程、添加剂等有关外，对紫菜的品种、内在品质 的要求也比较严格。 紫菜产品的质量与其种类有很大关系，如目前广泛栽培的条斑紫菜和坛紫菜 存在着很大的差异，其蛋白质、脂肪、碳水化合物的含量都差别明显【5 1 。除此之 外，紫菜内在品质也是紫菜商品性优劣的重要指标。其主要由糖、酸、香味物质、 蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等因素构成。其中风味物质的组成及其含量对紫 菜内在品质有着重要影响。 2 紫菜风味物质分析 2 1 风味化学 风味是衡量食品质量品质的重要指标之一。h a l l ( 1 9 8 6 ) 将风味一词的含义 概括为“摄入口中的食物使人的感觉器官包括味觉、嗅觉、痛觉及触觉等在大脑 留下的综合印象 。w e b s t e r 大辞典上风味一词的含义为“简而言之，风味是指所 尝到的和嗅知及触知的口中食物的总的感受。”英国标准学会( b r i t i s hs t a n d a r d i n s t i t u t i o n ) 对它的注释是：风味是味觉和嗅觉的结合，受痛觉、热觉和冷觉以及 触觉的影响。美国风味化学学会对风味的定义是：“风味是由吃入口中物质的性 质决定的，这些物质通过刺激口中的味觉、嗅觉、痛觉、触觉等受体，所形成的 特定的感觉 。 风味包括香味( 嗅觉感知) 和滋味( 味觉感知) ，故风味物质包括嗅感物质 和味感物质。嗅感物质是一类挥发性香气物质，含量极低( 如1 0 缶g l ，1 0 。9g l ， 1 0 d 2 9 l ) 、易挥发、含量复杂，包括t 4 分子量的醇、醛、酮、酯类、烃类、 吡嗪类和含硫化合物等多种物质，而且香气物质具有不稳定性，在提取过程中易 发生氧化、聚合、缩合和基团转移等反应同，与食品其他组分间存在动态平衡【刁。 味感物质包括游离氨基酸( f r e ea m i n oa c i d ，f a a ) 、糖、有机酸与核酸等多种物 质。如生物碱、黄酮类、单宁类、蛋白质水解产生的苦肽、盐类、胆汁、脲类、 5 2 0 0 8 年硕士学位论文 蛇麻子等构成了苦味；各种酸构成了酸味；l i c i 、c u c l 2 、k c l 、k i 、n a b r 、n a c l 、 n 阻c l 、n a 2 s 0 4 等，还有苹果酸钠和新近发现的一些肽类分子构成咸味，而k b r 、 n h 4 i 呈咸苦味；辣椒素及其衍生物、山椒醇、胡椒碱和姜醇等分别是辣椒、花 椒、胡椒和生姜的呈辣味物质；l 谷氨酸钠，5 次黄苷酸( 5 m 伊) 、5 鸟苷酸 ( 5 g m p ) 、琥珀酸钠是鲜味的呈味物，它们的阈值分别是1 4 0m g k g 、1 2 0m g k g 、 3 5m g k g 和1 5 0m g k g ，分别代表着肉类、鱼类、香菇类和贝类的鲜味。 f a a 是指以游离状态存在的氨基酸，一般是未经水解处理而直接测出的氨 基酸。与水解氨基酸相比，f a a 对营养的贡献不大，主要是参与风味物质的形 成。f a a 是重要的滋味物质和香味前体物质，具有酸、甜、苦、咸、鲜等多种 味道，疏水能小的氨基酸味甜，疏水能大的氨基酸味苦【8 】。其中谷氨酸( g l u t a m i c a c i d ，g l u ) 和天冬氨酸( a s p a r t i ca c i d ，a s p ) 呈鲜味，甘氨酸( g l y c i n e ，g l y ) 、 脯氨酸( p r o l i n e ，p r o ) 、丙氨酸( a l a n i n e ，a l a ) 和丝氨酸( s e r i n e ，s e t ) 呈甜 味【9 】。 2 2 挥发性风味物质研究进展 目前，对挥发性风味物质的研究比较广泛的有茶叶、水果、酒、肉制品、乳 制品、海产品、食用调料等【1 肛1 6 1 。挥发性风味物质分析主要包括萃取、定性与 定量分析和评价三部分。由于其具含量低、组成复杂、易挥发、不稳定等特点， 提取技术对分析挥发性风味物的组成含量有着主要的影响。 2 2 1 挥发性风味物萃取技术 同时蒸馏萃取法( s i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o ne x t r a c t i o n ，s d e ) 是将蒸馏和萃取 反复循环，从而浓缩样品，可以把1 0 母g l 浓度的挥发性物质从脂质或水介质中 浓缩千倍，提高了微量成分的提取效率。但高温作用对热敏的挥发性组成影响较 大【1 7 1 。对烟草中挥发性与半挥发性中性成分的s d e 法与水蒸气蒸馏法比较发 现，s d e 具有应用范围广、步骤简单、省时、省工等特点【1 3 1 。 分子蒸馏法( m o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n ，m d ) 是一种在高真空度下对高沸点、 热敏性物质进行的特殊液液分离技术。可以有效的脱除低分子物质( 脱臭) 、重 分子物质( 脱色) 及一些杂质，保护被分离物质不被污染，保持提取物原来的品 质【埘。影响挥发物得率的因素有油的温度和体系的真空度，油温越高，体系的真 空度越大，回收率也越大【2 0 】。 2 0 0 8 年硕士学位论文 超临界流体萃取法( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s c f e ) 利用流体在临界点 附近某一区域内，与待分离混合物中的溶质异常相平衡行为和传递性能，且对溶 质溶解能力随压力和温度改变而在相当宽的范围内变动这一特性达到分离的一 项技术口n 。最常用的是c 0 2 超临界萃取法，c 0 2 悔界温度低( 3 1 ) ，与室温相 近，在超临界状态下，c 0 2 具有很强的提取能力，且无溶剂残留、对环境无污染 和适用于热敏物质的分离。 ， 固相微萃取法( s o l i dp h a s em i e r o e x l r a c t i o n ，s p m e ) 是1 9 8 9 年由加拿大 w a t e r l o o 大学的a r t h u r 、p a w l i s z y n 等开发的一种新型无溶剂化的样品前处理技术 田】。1 9 9 3 年，美国的s u p e l c o 公司推出了商业化的固相微萃取设备，1 9 9 4 年获 美国匹兹堡分析仪器会议r & d 革新大奖【2 3 1 。s p m e 是在固相萃取基础上发展起 来的一种新的萃取分离技术，通过涂有特殊吸附剂的熔融纤维萃取头直接从液态 样品中或密封试管样品顶空提取待分析物，待达到平衡后，吸收了待分析物质的 纤维将被取出，并通过气相色谱进样口的高温热解吸目标化合物。具有操作时间 短，样品量小，无需萃取溶剂，适于分析挥发性和非挥发性物质，重现性好等优 点。对烟用香精中香气成分的s p m e 法与s d e 法分析表明，s p m e 虽然对一些 半挥发性成分灵敏度降低，且重复性较差，但其无破坏性，基本反应了待测物的 原始信息1 2 4 。 吹扫补集法( p u r g ea n dt r a p ，p & t ) 【2 5 1 是将挥发出的香气先吹扫使其吸附在 合适的高聚物表面，制成浓缩物后再进行分析，此法的缺点是难以富集足够浓度 的试样以进行分析。 2 2 2 挥发性风味物定量与定性 由于挥发性物质的化学性质各不相同，利用其他方法很难将其分离，。而它们 共有的特性就是分子量小，易挥发，因此气相色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，0 2 ) 对挥发性风味物的分离定量最合适。通过对照标准物质的图谱还可以对其定性。 其可以结合人工嗅闻、质谱及傅立叶变换红外光谱对挥发性组分进行鉴定分析 【7 】。其定量的方法有： 归一法，将提取的挥发物分离，并测出各组分峰高和峰面积。某些不需要定 量的组分也必须测出其峰高或峰面积及校正因子。组分百分含量即该组分峰面积 或峰高与校正因子的积，与该样品中各组分峰面积或峰高与校正因子的积之和的 7 2 0 0 8 年硕士学位论文 百分比值。 外标法，该法是用己知浓度的纯样品配成不同含量的标准样，用峰面积或峰 高对标准样定量作校正曲线。被测样品所得峰面积或峰高从校正曲线中得出组分 的含量。 内标法，该法是准确称取样品，加入一定量某纯物质作内标物，根据其相应 峰面积或峰高之比，求出待测组分的含量。 目前，对挥发性物质的分析，以气相色谱与质谱联用技术( g c m s ) 最为普 遍。挥发物在气相色谱中根据化合物的极性、分子量大小等进行分离，根据有机 化合物的分子离子和碎片离子所得到的信息，来推测化合物的分子量与分子结 构。即气体分子或固体、液体的蒸汽分子，受到高能电子流的轰击，首先失去一 个外层电子，生成带一个正电荷的阳离子。同时也可能是正离子的化学键断裂， 产生带有不同电荷和质量的碎片离子。碎片离子的种类及其含量与原来化合物的 结构有关。测定了这些离子的种类和含量，通过与标准谱库的比对，就确定了未 知物的化学组成及结构。旦前的标准谱库有美国国家标准局n i s t 与w i l e y 谱 库。 2 2 3 挥发性风味物评价 嗅闻法( g c o ) 2 6 - i ，该法是将制备好的挥发性成分样品依次进行2 次气相 色谱分析，2 次色谱分析的条件一致，其中第2 次分析的样品不进入色谱检测器， 而是用于研究人员的感官嗅闻，并由研究人员记录各种气相流出物的香气特征。 通过对比第2 次流出物的香气特征图谱和第1 次分析的气相色谱图，确定第1 次 分析的气相色谱图中单个峰对应的香气特征，从而确定对食品香气有重要影响的 挥发性成分。本方法对研究人员的要求较高，但此方法快速、有效。 风味强度法，风味强度在数值上等于浓度与阈值之比。当挥发性成分浓度接 近或高于阈值时，风味强度接近或大于l ，表明该组分对食品的香气有较重要的 影响，风味强度越大，说明该组分对食品香气的贡献越大。此方法仅限于评价已 知阈值的挥发性成分物质。 此外还有主成分法，a d e a 法和人工嗅觉系统等【2 7 1 ，逐渐使评价从感官走 向电子化、智能化、过程化。 3 2 0 0 8 年硕士学位论文 2 2 4 不同物质的风味构成 不同物质具有不同的风味成分。其风味的构成差异明显。水果中的香气主要 成分一般是低级脂肪酸、酯类和几种单萜烯类化合物 2 8 1 ；许多新鲜蔬菜的清新泥 土香味主要由甲氧烷基吡嗪化合物产生，如2 一甲氧基- 3 - 异丙基毗嗪及2 - 甲氧基 - 3 - 异丁基吡嗪( 前者是鲜土豆、青豆等的主要香味化合物) ，它们一般是在植物 组织中以亮氨酸等为前体经生物合成而形成的【1 1 】；而海洋水产品肉质风味是一种 比较复杂的气味和滋味的综合反应，在养殖品种中容易缺失【2 9 1 ，有报道次黄嘌呤 核苷酸、游离氨基酸和脂类是关键的呈味物质 3 0 l ，还有认为是一种溴苯酚类化合 物【3 l 3 2 。 p a r k ( 2 0 0 2 ) 报道六氢吡啶衍生物、胺类、萜类物质，甲基吡咯、溴代戊烷、 间甲基异丙基苯、邻甲基乙基苯、5 , 6 二甲基已内酯和苯乙醛等成分形成海藻的 特有风味【3 3 1 ，其中萜类物质、胺类物质和吡啶类物质是形成海藻腥味的主要成份 阴1 。虽然绿藻、褐藻及其它一些红藻等多种海藻中挥发性物质已经被分离鉴定 a s 3 7 1 ，一些重要挥发性风味物质的产生机理与特征气味已经被阐明【3 8 】，但很少 有对紫菜的报道。f l a m e n t ( 1 9 8 5 ) 报道了甘紫菜中1 0 0 多种挥发性物质，包括 类胡萝b 素降解化合物( 洳紫罗兰酮、p 紫罗兰酮和二氢猕猴桃内酯) 3 9 】、还有 库贝醇、植醇、软脂酸、( z ，z ) 7 ，1 0 十六碳二烯醛、( z ，z ) 8 ，1 1 一十七碳二烯醛和 8 十七醛，这些醛在丝状体阶段通过酶反应生成【柏】。条斑紫菜的挥发物中存在十 四醛、十五醛、( e ，z ) 2 ，6 。壬二醛、2 壬烯醛和倍半萜醇等脂肪醛【4 1 1 。 2 3 游离氨基酸研究进展 2 3 1 游离氨基酸分析技术 由于大多数氨基酸在紫外可见光谱区吸收极弱，自身又无荧光，所以通常要 对氨基酸进行衍生化处理，使之具有较强的紫外或荧光吸收，以便检测。 分光光度法，光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。 大部分氨基酸在紫外区无吸收，只有一小部分在紫外区有吸收，而且吸收光谱严 重重叠，所以，这部分氨基酸可与茚三酮混合，经加热反应后，一级胺与之生成 蓝紫色化合物，二级胺与之生成黄色化合物，通过处理吸光光度数据来测量氨基 酸组分含量。对紫外区有吸收的氨基酸的测定，有人也采用了其它方法，如双波 长紫外吸收法【4 2 】、三波长分光光度法 4 3 1 、等吸光度法 4 4 1 等。 9 2 0 0 8 年硕士学位论文 柱前衍生法，是在一定条件下利用特定试剂( 标记试剂) 在色谱柱前与化合 物样品进行化学反应，使反应产生的衍生物利于色谱的分离或检测。其优点是通 常无需考虑衍生反应的动力学因素；衍生化试剂、反应条件和反应时间的选择不 受色谱系统的限制；不需附加仪器设备。缺点是操作过程较繁琐，容易影响定量 分析的准确性，且衍生反应形成的副产物可能对色谱分离造成较大干扰，从而影 响分析结果。 常用的柱前衍生化试剂有邻苯二甲醛( o p a ) 、磺酰氯二甲胺偶氮苯 ( d a b s y l c 1 ) 、2 , 4 二硝基氟苯( d n f b ) 、异硫氰酸苯酯( p i t c ) 、丹酰氯 ( d a n s y l c i ) 、9 芴甲基氯甲酸酯( f m o c c i ) 、6 氨基喹啉n 羟基琥珀酰亚胺 碳酸盐( a q s ) 和萘2 ，3 二甲醛( n d a ) 等【4 8 1 。在选择衍生化试剂时，三个 首要条件是：& 试剂应能与基质中所有的氨基酸反应，包括含亚氨基的脯氨酸 和羟脯氨酸；b 衍生化试剂的重现性应很强；c 氨基酸的衍生物必须很稳定。 f t t r s t ( 1 9 9 0 ) 比较了四种衍生化试剂：氯甲酸芴甲酯( f m o c c i ) 、邻苯二 甲醛( o d a ) 、异硫氰酸苯酯( p r r c ) 和丹酰氯( d a n s y l c 1 ) 在h p l c 法分析生 理氨基酸时的优缺点：f m o c c 1 可与一级和二级氨基酸生成稳定的衍生物，而 且在仪器自动化方面也是可行的，缺点是须将反应过程中剩余的衍生试剂萃取出 来以终止反应并避免衍生产物的分解；d a n s y l c 1 与包括亚氨基在内的所有氨基 酸均反应，可与组氨酸形成多种衍生物，对胱氨酸的重现性也特别好，所以可以 很好的测定游离胱氨酸，但洗提液中的污染以及干扰副产物的生成是此法最大的 缺点；o p a 法由于样品制备简单，衍生反应快速，可以实现自动化以及灵敏度 高的优点受到欢迎，此法的缺点是不能检测二级氨基酸，胱氨酸因为衍生物的荧 光强度太低，也检测不出，可以结合其他的衍生化试剂，如f m o c c 1 ；如果需 要测定二级氨基酸，并且样品足够多，应优先选择p i t c 法，此法生成的衍生产 物单一、稳定( 尤其在冷冻储存的时候) 、衍生速度快、重现性好【4 9 1 。但是其洗 提液中会有污染的干扰，而且巯基氨基酸胱氨酸和巯基丁氨酸形成混合的二硫化 物会影响亮氨酸的测定【5 0 1 。此外，样品制备过程耗时并且衍生时要求真空蒸发， 导致此法不易于自动化。 c l u n g 等( 1 9 8 8 ) 从检测限、精密度和稳定性几个方面比较了五种柱前衍生 方法。他们总结：p i t c 就稳定性而言是理想的方法；o p a 法在测定微量样品时 l o 2 0 0 8 年硕士学位论文 是最合适的；而d a n s y l c i 法被认为是最精确的【s i 】。o p a 法需要有还原剂才能与 氨基酸生成荧光物质，o p a 法需要需要硫醇作还原剂来形成荧光物质，还原硫 醇的选择能够极大地改变衍生物质的色谱行为【5 2 1 。应用最广泛的是2 巯基乙醇 ( 2 m c e ) ，但是用其它的巯基化合物取代m c e 往往能得到更好的稳定性，如 3 巯基丙酸( 3 m p a ) 或n 乙酰基l 半胱氨酸【5 3 1 。 k u e e m 等( 1 9 8 3 ) 通过比较o p a m p a 、o p a m c e 和o p a e t 氨基酸的稳 定性发现，m p a 在更广范的反应时间里能产生相似的荧光强度及水性更强的 o p a - m p a 衍生物，从而更容易被洗脱【5 4 1 。a m i n o t 等( 2 0 0 6 ) 发现在他们的实验 条件下衍生反应时间小于2 m i n 时，甘氨酸的浓度将被低估；而反应时间延长， o p a m c e 作衍生，甘氨酸的浓度又将被高估；o p a - m p a 在7m i n 后荧光强度基 本保持不变 5 s 】。该方法未来的发展主要在于选择高稳定、高灵敏度的衍生试剂， 使方法更趋灵敏、可靠。 柱后衍生法，由于反应试剂连续流入检测器，受到未反应试剂不能检测的限 制，可使用的试剂种类有限。氨基酸分析专用试剂仅有茚三酮和邻苯二甲醛2 种。前者用于可见吸光度检测，后者用于荧光检测。 2 3 2 紫菜中游离氨基酸研究进展 游离氨基酸( f a a ) 一直被认为是紫菜风味的最大贡献者【5 8 】。但对条斑紫 菜中f a a 含量的报道差异很大。s a k a i 等( 2 0 0 0 ) 认为日本北海道地区产紫菜 中总f a a 包括谷氨酸含量随着采收日期( 生长日龄，即生长及采收日期) 而增 加，而h a r a d a 等( 1 9 9 0 ) 和n i w a 等( 2 0 0 7 ) 则认为神户地区产的紫菜中谷氨酸 含量的变化趋势是递减的【5 7 , 5 9 。这种差异的存在，除了可能与栽培品种有关外， 栽培环境的差异也是影响f a a 含量变化的因素之一嗍。在所有f a a 中，精氨酸、 谷氨酸、丙氨酸和牛磺酸被报道为最重要的f a a i s 6 - - s g 。而谷氨酸和丙氨酸又是 四种风味f a a 中最重要的两种f a a 5 6 1 。风味品质已成为紫菜选育的重点之一【6 1 6 2 1 ，严兴洪( 1 9 9 7 ) 曾比较了条斑紫菜及其1 3 种突变体中f a a 含量，通过f a a 含量组成考量了各突变品系的风味品质。目前对坛紫菜中f a a 含量组成鲜有报 道。 3 扑草净残留量分析 2 0 0 8 年硕士学位论文 农药残留物就是指任何由于使用农药而在食品、农产品和动物饲料中出现的 特定物质，包括被认为具有毒理学意义的农药衍生物，如农药转化物、代谢物、 反应产物以及杂质旧】。农药残留可以通过食物链蓄积【6 4 ，造成生态系统的破坏， 近年来农药对人类生活的危害不仅仅是农药残留问题【6 5 1 ，农药三废的污染与高毒 农药使用不科学及管理不善造成的人畜中毒事故不断发生。 三嗪类除草剂是2 0 世纪5 0 年代发明的传统除草剂，防治一年生阔叶杂草1 6 6 】。 具体结构可分为三种，起初的化合物是随机筛选所得。这类除草剂常用的有莠去 津、环嗪酮、嗪草酮、特丁津、西玛津、莠灭净、扑草净、氰草津、特丁净、特 丁通、扑灭净、敌草净等，目前仍在广泛应用。德国和希腊是欧洲三嗪类农药最 大的消费国，在其很多地区的地下水中均发现了这类农药1 6 7 】。 扑草净，又名扑蔓尽、割草佳、扑灭通，化学名称为2 甲硫基- 4 ，6 - ( 异丙 胺基) 1 ，3 ，5 三氮苯，是一种选择性内吸收传导型的三嗪类除草剂【醯】，适用于阔 叶杂草的防除【蛔。其化学性质稳定，能够长期存在于土壤、水体和植物体内，并 通过渗透进入地下水【6 9 , 7 0 。由于其在水中低的生物活性又使得其在水中持续多年 而不分解【7 l 】。扑草净容易在人体内富集，造成人体内分泌紊乱阎，并会造成d n a 的损伤【7 习 三嗪类农药自5 0 年代被发明到现在仍然被广泛应用瞄】。但扑草净也是常检的 农药之一，欧盟对其在饮用水中的限量标准是o 1p g l 【6 7 1 。美国规定在玉米中的 限量标准为o 2 5m g k g ，加拿大为0 1m g k g 。 2 0 0 6 年5 月底，日本政府根据修订后的食品卫生法制定的食品残留农 业化学品肯定列表制度，简称肯定列表，是日本为加强食品包括可食用农产 品、农业化学品( 农药、兽药和饲料添加剂) 残留的管理而制定的一项新制度。肯 定列表规定所有食品中未被列入“豁免物质”清单、且未制定“最大残留限量标 准”的农业化学品，均适用“一律标准”。对于稀释后食用的浓缩食品 肯定列表 根据稀释状态下的残留量来衡量该食品残留量水平，对于花生、玉米、大豆等有 一定含水量的农产品中扑草净残留量的限定，肯定列表按照新鲜样品的质量 作为试样质量。这样的做法合理的对新鲜样品中的农残进行了限量。 按照“一律标准”，肯定列表规定了紫菜中的扑草净残留量为o 0 1m g k g ， 而这个检出限不是以紫菜鲜藻而是以干紫菜中扑草净的残留量作为标准。干紫菜 1 2 2 0 0 8 年硕士学位论文 是中国对日出口的重要商品紫菜，是利用紫菜的新鲜藻体经过除杂、清洗、切碎、 烘干等步骤加工而成的片状干燥藻饼，含水量由新鲜藻体的约9 0 下降到 5 1 0 ，因此单位质量的紫菜中扑草净的残留量随着含水量的降低而升高。所 以如果以干紫菜中扑草净的残留量作为紫菜的残留量作为标准，则与其他标准形 成冲突。5 月2 9 日，日本通报了江苏2 7 家紫菜生产企业3 0 份干紫菜样品的检测结 果，其中有1 0 份样品的扑草净残留量超过0 0 1m g k g 。而江苏沿海所产干紫菜制 品占我国总产量的9 5 ，年产量超过1 0 亿张【7 4 】。经过中日双方的谈判，2 0 0 7 年1 月1 6 日，日本修改了肯定列表里紫菜原藻中扑草净的限量标准( 表1 ) o 肯定列表中对紫菜中扑草净的检出限 p o s i f f v e 三妇rs y s t e m ”f o rt h ed e t e c t i o nl i m i t so fp r o m e t r y ni nl a v e r 紫菜制品的水分含 量 扑草净检出限m g k g 原藻中水分含量原藻中水分含量原藻中水分含量 9 5 9 3 9 0 目前对三嗪类农药残留分析方法主要为气相色谱法与质谱联用法【7 5 圳，虽然 气相色谱法灵敏度高，检测限低，但该法不适合分析酸性农药，或极性大、低挥 发性和热稳定性差的物质f 7 刀，有较大局限性，而高效液相色谱法只要求试样能制 成溶液，不受样品挥发性的限制，适用性较广，但检测灵敏度比气质联用法低， 但仍然满足检测要求。谢笑天等( 2 0 0 2 ) 建立了扑草净、乙草胺混配除草剂的 h p l c 分析方法，流动相为正己烷氯仿，扑草净的加标回收率为9 9 和1 0 1 嗍； 徐远金等( 2 0 0 6 ) 利用甲醇、乙腈与水做流动相，建立了同时测定蔬菜中的阔草 清、西玛津、硫双威、绿麦隆、扑草净、仲丁威的s p e l c m s 法，样品的加标 平均回收率为8 3 1 0 6 ；董丽娴等( 2 0 0 6 ) 建立了对水中痕量三嗪类物质的 s p e h p l c 分析方法，回收率达到9 4 1 1 6 ，方法检测限为0 1 4 耀儿【嗍。 4 研究结果及其意义 坛紫菜与条斑紫菜作为我国重要的经济海藻，在整个海藻产业中占有重要的 地位。紫菜产业在我国逐渐壮大，而品种退化、品质降低、食品安全等问题已成 1 3 2 0 0 8 年硕士学位论文 紫菜栽培、生产、销售这条产业链各环节不可避免的难题，国内科学工作者为此 做出了许多深入的研究。种质改良成了当前紫菜研究的热点之一，除了要提高产 量之外，紫菜内在品质的优化也是重中之重。 本论文对影响紫菜风味品质的两类风味物特征挥发性物质和游离氨基酸的 含量组成进行研究，鉴定了6 6 种挥发性组分和1 6 种主要游离氨基酸的含量，报 道了8 十七烯和十五烷是紫菜重要的挥发性风味物组份，而一些短链醛、醇及酮 类可能构成紫菜的特征嗅感物质，条斑紫菜所含挥发物中醛、酮相对量值明显高 于坛紫菜；条斑紫菜的总f a a 含量明显高于坛紫菜，其中丙氨酸、精氨酸、谷 氨酸和天冬氨酸含量均最大，是影响紫菜风味的重要因子，生长日龄的增长影响 了总f a a 含量的降低，而a l a 和g l u 含量的降低可能是主要的因素。 扑草净残留量是国外对我国紫菜产品第一个设限的安全质量指标，本文还对 南通地区紫菜干制品中农药扑草净的残留量进行抽样检测，以期为紫菜生产过程 的安全质量关键点控制提供了重要的数据资料。 1 4 2 0 0 8 年硕士学位论文 第一章紫菜特征挥发性物质分析 海藻食品除了有丰富的营养成份外，其独特的风味也是引人向往的重要因 素。目前，对于食品的风味物质研究已被关注。风昧物质包括昧感物质和嗅感物 质，挥发性风味物质是嗅觉感知的一类化合物组份，包括香气物质和香味物质， 其特点是易挥发，含量极低。对食品挥发性风味物质的研究较多涉及茶叶、水果、 酒类、肉制品、乳制品及食用调料等【1 啦! 4 ，垌，在海产品中报道较少。 紫菜是重要的栽培海藻，经济价值约占全世界海藻产业的2 3 。我国是主要 紫菜生产国之一，并是从事条斑紫菜和坛紫菜两种紫菜人工栽培的唯一国家【l 】。 紫菜因为其独特的风味和丰富的营养受到人们的喜爱，在东亚地区尤为受欢迎。 紫菜食品消费对品质的要求很高，尤其以烤、调为主的紫菜加工品，不仅以色泽、 味感等评价产品质量，并且还将香型等嗅觉感受作为品质的重要评价指标。 虽然作为脂肪酸与氨基酸次级代谢产物的挥发性物质在绿藻、褐藻及红藻等 多种海藻中已被分析鉴定0 5 , 3 8 j ，一些特征性挥发物组份也有阐述，但很少有对紫 菜挥发性物质进行专门的研究，关于特征性的挥发风味物质组成、含量等分析研 究几乎未见报道。甘紫菜藻体中已被分析含有超过1 0 0 种的挥发性组份，其鉴定 物质中包括类胡萝卜素降解化合物( a - 紫罗兰酮、b 紫罗兰酮和二氢猕猴桃内 酯) 、不饱和短链醛和长链醛等【3 。 食品挥发性物质的研究进展得益于分离与分析技术的进步。目前重要的分离 方法有同时蒸馏萃取法( s i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o ne x t r a c t i o n ，s d e ) 、分子蒸馏 法( m o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n ，加) 、固相微萃取法( s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ， s p m e ) 和顶空分析法( h e a ds p a c e ，h s ) 等。气质联用仪( g c m s ) 、人工嗅 辨器( o c o ) 【2 6 】及电子鼻【删等检测技术的进步，推动了挥发性物质的研究，并 使特征风味物质的研究成为可能。 本研究利用h s - s p m e - g - c m s 技术，对坛紫菜、条斑紫菜及其一个突变品 系y - g r 生长藻体的挥发性成分进行分离鉴定，以期通过特征性化合物对紫菜风 味成份的组成及作用进行分析讨论。 1 材料与方法 1 5 2 0 0 8 年硕士学位论文 1 1 材料与样品制备 实验材料为紫菜叶状体藻体。坛紫菜采自浙江象山栽培海区，条斑紫菜及其 突变品系y - g r 藻体采自江苏南通栽培海区。y 乒为条斑紫菜的绿色突变型品系， 生长藻体在同一栽培海区与一般野生型藻体可以明晰分辨。 采集的紫菜藻体经蒸馏水洗净，7 0 。c 冷冻干燥，4 c 低温保存。分析样品经 研磨成粉，过0 4 5i s i s 筛备用。 1 2 仪器设备 q p 2 0 10 气相色谱质谱分析仪，a o c - 2 0 自动进样器( 日本s h i m a d z u ) ；3 0 m x 0 2 5m m x 0 2 5 肿s p b 一5 色谱柱( 美国s u p l c o ) ；7 5p a nc a r b o x c n - p d m ss p m e 萃取装置，1 5i n l 顶空瓶( 美国s u p l c o ) 。 1 3 实验方法 1 3 1 分析样品预处理 称取样品各1 n ng ，分别加入1 5 趔s p 陋顶空瓶中，7 5 u r nc a r b o x c n - p d m s 萃取头g c 进样口2 5 0 ( 2 老化3 0r a i n ，8 0 c 条件下插入项空瓶中，萃取4 5m i n ， 室温下1 5m i n ，取出萃取头立即插