叶绿体基因工程.doc

叶绿体基因工程姓名：李茂华 学号：20142356 摘要：叶绿体是植物细胞和真核藻类执行光合作用的重要细胞器，在叶绿体中表达外源基因比在细胞核中表达具有一些独特优势。叶绿体基因工程步骤类似核基因工程，叶绿体基因工程在提高植物光合效率、改良植物特性及生产生物药物等方面已得到应用。尽管叶绿体基因工程还存在同质化难度高、标记基因转化效率较低、宿主种类偏少等问题，但作为外源基因在高等植物中表达的良好平台其仍然具有广阔的发展和应用前景。 关键词：叶绿体 基因工程 应用 存在问题 叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器，其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882 年Straburger 观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞；1909年Baur 和Correns 通过在3 种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出，质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣【1】。1988 年Boynton 等首次用野生型叶绿体DNA 转化了单细胞生物衣藻突变体（atPB 基因突变体），使其完全恢复光合作用能力，标志着叶绿体基因工程的诞生【2】。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术，在植物光合作用、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。1 叶绿体基因工程概述1.1叶绿体简介 叶绿体是绿色植物光合作用的场所, 来源于古代的衣藻类原核生物, 含有双链环状DNA ( Manning , 1971 )叶绿体DNA 有IRA 和IRB 两个反向重复序列( 分别位于A 链和B链) , 两者基因大小完全相同, 只是方向相反, 它们之间有一个大的单拷贝区(large single copy region , LSC ) , 大小约80kb, 和一个小的单拷贝区( small single copy region , SSC )大小约20kb。多数叶绿体D N A大小在120一160kb, 最大2000 kb ( 伞藻) , 最小85 kb ( 刺海松)。叶绿体基因组中的基因在漫长的进化历程中, 有许多转移到了核中, 遗留在叶绿体中的基因是功能必需的一些基因, 有巨大的拷贝数( 一个叶绿体中, 基因拷贝数可达上百个; 一个细胞中, 基因的拷贝数可达上万个) , 而且它们都是原核生物来源的, 具有原核生物基因的特点叶绿体基因多为多顺反子转录单位, 这些转录单位中基因的排列顺序是高度保守的【3】。1.2叶绿体基因工程优势1.2.1 高效表达外源蛋白 外源基因在叶绿体基因组中稳定整合之后，能够使外源蛋白大量积累，这是因为在每一个植物细胞中质体遗传系统的多倍体特性可以使叶绿体基因组的基因拷贝数目多1000-10 000，保证了功能基因拷贝数维持在较高数量。此外，叶绿体转化体系消除了核转化体系中频繁出现的位置效应，因叶绿体转化载体两侧的同源序列保证了外源基因在和叶绿体基因组进行同源重组时的位点特异性，这就为外源基因的高效表达提供了有利条件。叶绿体转基因植物还具有其他一些优点，如不会出现转基因沉默现象。这使得转录本的积累比核转化植物可以高169 倍，并且外源蛋白的表达量在成熟叶片中可占可溶性蛋白的45.3%，在老叶片中占可溶性蛋白的46.1%【4】。1.2.2 安全性好 在大多数被子植物中，叶绿体基因都是母系遗传的，所以这些叶绿体中的转基因不会通过花粉进行传播，使叶绿体转化成为创造和培养基因修饰的转基因植物的一个有价值的工具，并且产生更低的环境危害。因此，利用这种生物防范策略也可以使传统的和修饰的转基因作物共存，雄性不育遗传工程技术正是这种转基因防范策略的进一步体现【5】。此外，植物来源的医疗蛋白不受人类病原体和哺乳动物病毒载体的危害。因此，叶绿体系统为传统的生产系统，如微生物发酵或哺乳动物细胞培养等提供了一个可行的替代选择。1.2.3 后代不易分离 母系遗传是叶绿体的遗传特性，因此在得到纯合并且稳定的叶绿体转化植株后，这样纯系的后代不会因有性杂交而分离，从而一直保持纯系【6】。除上述优点，叶绿体遗传工程还具有转基因累加的独特优势。例如，可以同时表达多个基因以实现通过一次转化就能生产多价疫苗。一些异源操纵子已经在转基因叶绿体中表达，多顺反子也没有先被加工成单顺反子就被成功翻译。此外，在叶绿体中合成的外源蛋白经适当的转录后修饰被正确折叠，包括生成二硫键、脂质修饰等【7】。2 叶绿体转化步骤2.1将外源DNA导入叶绿体外源DNA 穿过叶绿体的双层膜比穿过核膜要困难得多, 叶绿体转化的一个关键问题是DNA 进入细胞质后如何穿过叶绿体双层膜。目前最常用和最有效的方法是基因枪法, 转化效率高且重复性好【8】。此外还有农杆菌介导法、聚乙二养醇(PEC) 介导法、显微注射法等。2.2 外源D N A 整合进入叶绿体基因组用于叶绿体基因转化的质粒载体具有叶绿体基因组的同源片段、启动子及适于叶绿体表达的筛选标记, 转化载体被载人叶绿体后通过与叶绿体基因组的同源片段之间发生核两次同源重组, 将外源基因整合到基因组定位点。2.3筛选叶绿体转化的细胞 高等植物中, 每个叶绿体内又有数百个基因组拷贝,因此转化和未转化的叶绿体极易同时存在于转基因植株中, 这种杂合体遗传不稳定。解决该问题的方法之一是在得到外源基因的转化子后, 在增加选择压力的培养基上反复筛选, 逐步淘汰野生型拷贝, 最终使转基因植株中已整合外源基因的叶绿体基因组取代原基因组所有拷贝, 即同质化【9】。2.4再生稳定的转基因植株 目前常用的植物组织再生方式有愈伤组织再生和原生质体再生。转化外植体经脱分化培养诱导形成愈伤组织后, 再通过分化培养诱导生根、发芽获得再生植株, 将再生植株移栽土壤就可长成可育的成年植株。再生系统的遗传稳定性与再生方式、培养条件、外植体的选择等有关【10】。3叶绿体基因工程的应用3.1提高植物光合效率 植物的光合效率非常有限，太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量，从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于Rubisco 酶的丰富度。Rubisco 酶一方面可以制造可溶性蛋白，另一方面也可以限制CO2合成。人们可以通过2 种直接的方法提高光合速率：一是加速酶催化的循环过程；二是提高酶的特性，减少光呼吸浪费的能量【11】。很多科学家正试图通过提高Rubisco 酶来提高植物的光合效率，而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突破，证明叶绿体基因工程是生产高光合效率作物植物的最有价值的方法。3.2合成有机物质 由于叶绿体型转基因植物具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点，已被越来越多的人关注，并成为工业化生产特定有机物质的可靠场所。例如，有科学家已发明了用叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因的方法。其通过构建了含phbB、phM、phbC 和aadA 基因表达盒的叶绿体整合及表达载体，通过基因枪轰击法转化烟草。Northem 点杂交、RT-PCR分析结果表明，叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因【12】。3.3生产疫苗 人类治疗用蛋白质可以在叶绿体中实现表达，表达效率取决于外源基因的整合位点，增强转录和翻译的调控元件以及外源蛋白的稳定性等。人类已经在用叶绿体基因生产疫苗方面开展了卓有成效的工作。例如，范国昌等将甲型肝炎病毒VP3P1 区和丙型肝炎病毒C 区融合，并导入到衣藻叶绿体基因组中，融合蛋白得到高效表达，且具有双抗原活性【13】。3.4在植物抗性方面的研究 在抗虫性方面，Kota 和Cosa 分别于1999 年、2001 年将BTCryZAaZ 基因转入烟草叶绿体，前者可100%杀死4000多倍抗性的抗性虫，后者报道BT 表达量达46.1%。【14】在抗逆性方面，人们通过编码SOD、APx 等酶的基因已经转入到烟草、苜蓿、马铃薯、棉花的叶绿体中，提高了植物的耐氧化能力，从而提高了植物对环境胁迫的耐受能力【15】。4存在问题4.1叶绿体的同质化问题 植物叶绿体转化不同于细胞核转化的重要一点是同质化问题。高等植物的每个细胞中含有许多叶绿体，单独的每个叶绿体又含有许多叶绿体基因组拷贝，所以转化后所得到的叶绿体植株中未被转化的野生型叶绿体和被转化的叶绿体同时存在，一般情况下是异质的，这在遗传学上较不稳定。因此，在将外源基因导入之前必须使转基因植株易于同质化，然而改造叶绿体的基因组相当困难，它的基因组结构使人们难以进行深入的加工和修饰【16】。4.2选择标记基因 应用不同的选择标记基因，转化效率不同。如aadA 基因转化能大大提高叶绿体转化子的回收率。可见，有效的选择标记基因是提高叶绿体转化效率的关键因素。并且，为非绿色质体选择合适的标记基因是在重要作物中构建质体转化系统的一个可行的途径。这个领域的快速发展需要对叶绿体基因工程进一步的研究应用【17】。4.3植物种类有待扩展 叶绿体基因工程只在少数的几种植物中获得成功【18】，主要原因是大多数植物的叶绿体基因组序列还没有完全测出，无法确定同源重组和插入位点。截至目前，叶绿体转化技术已经在多种高等植物中得到成功尝试，而稳定的转化系统仅仅在烟草中得以构建，番茄、油菜、大豆、胡萝卜及莴苣等叶绿体转化体系相继建立但仍处于开发阶段【19】。5结语 迄今为止，在烟草叶绿体基因组中稳定整合并表达的转基因已超过40 余种【20】，而且产生了有价值的工业生物材料和治疗蛋白。重组蛋白在叶绿体工程系统中的高效表达表明植物作为生物反应器的潜在巨大效益，并且这种环保的植物生物反应器途径已逐渐被应用于治疗蛋白、疫苗和生物材料的生产。叶绿体基因工程作为分子水平上的一种技术手段，为转基因植物的研究开辟了一个新的方向，为外源基因在高等植物中表达提供了一个良好的平台。然而这只是第一步，这个技术尚不能使产品商业化，目的基因表达水平的调控还有待解决，并且叶绿体转基因植物需要得到更多层面的评估。随着对叶绿体基因工程的进一步探索与完善，叶绿体作为一种新型高效的生物反系统必将为生物工程领域带来新的希望。参考文献【1】刘良式.植物分子遗传学M.北京：科学出版社，1997.【2】BOYNTON J E，GILLHAM N W，HARRIS E H，et al.Chloroplast transformation in Chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles J.Science，1988，240（4858）：1534-1538.【3】西费利.叶绿体分子遗传学M.湖南：湖南科学技术出版社,1987【4】桂腾琴，孙敏.叶绿体基因工程的研究进展.安徽农业科学,2009,37(8):3429-3431【5】Ruiz ON, Daniell H. 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