（植物学专业论文）农杆菌介导的转bt+cry1ia基因抗虫花椰菜的研究.pdf

目录 中文摘要i 英文摘要 1j ；i 言1 1 1 植物抗虫基因工程研究进展1 1 1 1 厨杀虫蛋白基因。1 1 1 2 蛋白酶抑制剂基因的研究及应用4 1 1 3 植物凝集素基因的研究及应用5 1 1 4 昆虫神经毒素基因的研究与应用。5 1 2 花椰菜转基因技术的研究进展6 1 2 1 遗传转化方法。6 1 2 2 农杆菌介导植物遗传转化过程中的影响因素7 1 2 3 抗虫花椰菜的转基因研究进展1 0 1 3 研究的内容及目的意义1 1 1 3 - 1 研究的内容1 l 1 3 2 研究的目的意义1 2 2 材料与方法1 4 2 1 试验材料及仪器药品1 4 2 1 1 实验材料1 4 2 1 2 实验药品1 5 2 1 3 主要实验仪器16 2 2 试验方法l6 2 2 1 优化花椰菜再生体系试验16 2 2 2 优化花椰菜转化体系试验l7 2 2 3 植物表达载体的构建18 2 2 4 转化植株的p c r 检测2 l 2 2 5 转化植株的r t - p c r 检测。2 2 2 2 6 转化植株的w e s t e r nb l o t 检测2 3 2 2 7 转基因植株的抗虫性测定2 6 3 结果与分析2 8 3 1 花椰菜再生体系的优化2 8 3 1 1 外植体对不定芽再生的影响。2 8 3 1 2 不同激素浓度对花椰菜芽再生频率的影响2 9 3 1 3 银离子对花椰菜芽再生频率的影响2 9 3 1 4 不同激素对花椰菜再生茁生根的影响3 0 东北农业大学理学硕士学位论文 3 2 花椰菜遗传转化体系的优化：3 0 3 2 1 卡那霉素对花椰菜遗传转化的影响3 0 3 2 2 不同外植体对遗传转化的影响3 1 3 2 3 不同菌株对遗传转化的影响3 1 3 2 4 不同侵染时间对遗传转化的影响3 2 3 2 5 添加乙酰丁香酮对遗传转化的影响3 2 3 2 6 不同抑菌剂浓度对遗传转化的影响3 3 3 3 花椰菜转化e r y l a 基因植株的获得及其检测3 3 3 3 1 载体的构建3 3 3 3 2 转基因植株的获得3 6 3 3 3 转基因植株的p c r 检测与分析3 7 3 3 4 转基因植株的r t - p c r 检测3 7 3 3 5 转基因植株的w e s t e r nb l o t 检测。3 8 3 3 6 抗虫性鉴定3 8 4 讨论4 0 4 1 花椰菜再生体系的优化4 0 4 2 花椰菜遗传转化体系的优化。4 0 4 3 研c 吵，亿基因转化植株抗虫性的初步测定4 2 5 结论4 3 致谢1 4 参考文献4 4 攻读硕士学位期间发表的学术论文5 0 c o n t e n t s c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t 1 e n g l i s ha b s t r a c t i li n t r o d u c t i o n 1 1 1a d v a n c e si ng e n ee n g i n e e n i n go fi n s e c t - r e s i s t i n gp l a n t s 1 1 1 。lg e n e so f b ti n s e e t i d a lp r o t e i n l 1 1 2t h es t u d ya n da p p l i c a t i o no f p r o t e i n a s ei n h i b i t o rg e n e 4 1 1 3t h es t u d ya n da p p l i c a t i o no fl e e t i mg e n e 5 l 1 4t l l l es t u d ya n da p p l i c a t i o no fi n s e c t - s p e c i f i cn e u r o t o x i ng e n e “5 1 2a d v a n c e si nt r a n s g e n i ct e c h n o l o g yo fc a u l i f l o w e r 6 1 2 1w a y so fg e n e i ct r a n s f o r m a t i o nf l o w e r 。6 1 2 2i n f l u e n c i n gf a c t o r so fa g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n 。7 1 2 3a d v a n c e si nt r a n s g e n i ct e c h n o l o g yo f c a u l i f l o w e r 。1 0 1 3p u r p o s ea n dc o n t e n to f t h es t u d y 11 1 3 1c o n t e n to f t h es t u d y ll 1 3 2p u r p o s ea n di m p o r t a n c eo f t h es t u d y 1 2 2m a t e r i a l sa n dm e t l l o d s 14 2 1m a t e r i a l s ，a p p a r a n t u sa n dr e a g e n t s 1 4 2 1 1e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 1 4 2 1 2e x p e r i m e n t a lr e a g e n t s 15 2 1 3l a b o r a t o r ya p p a r a t u s 1 6 2 2e x p e r i m e n t a lm e t h o d s 16 2 2 1a s s a ym e t h o d so fr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fc a u l i f l o w e r 16 2 2 2a s s a ym e t h o d so f t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f c a u l i f l o w e r 。1 7 2 2 3c o n s t r u c tt h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sw i t hc r y l l ag e n e _ 18 2 2 4p c rd e t e c t i o no f t h et r a n s f o r m dp l a n t s 2 l 2 2 5l 卿c rd e t e c t i o no f t h et r a n s f o m a dp l a n t s 2 2 2 2 6w e s t e r nb l o td e t e c t i o no ft h et r a n s f o r m dp l a n t s 2 3 2 2 7i n s e c t - r e s i s t a n c ed e t e c t i o no f t h et r a n s f o r m dp l a n t s 2 6 3r e s u l t sa n da n a l y s i s 2 8 3 1o p t i m i z a t i o no fr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fc a u l i f l o w e r 2 8 3 1 1t h ei n f l u e n c eo fe x p l a n t st or e g e n e r a t i o n gb u d s 。2 8 3 1 2t h ei n f l u e n c eo f h o r m o n et or e g e n e r a t i o n gb u d s 2 9 3 1 3t h ei n f l u e n c eo f a g n 0 3t or e g e n e r a t i o n gb u d s 2 9 3 1 4t h ei n f l u e n c eo f h o r m o n e t or o o t i n g 。3 0 卜l p ， 3 2o p t i m i z a t i o no f t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f c a u l i f l o w e r 3 0 3 2 1t h ei n f l u e n c eo f k a n a m y c i nc o n c e n t r a t i o n t ot r a n s f o r m a t i o n 3 0 3 2 2t h ei n f l u e n c eo f e x p l a n t st ot r a n s f o r m a t i o n 3 1 3 2 3t h ei n f l u e n c eo fs t r a i n st ot r a n s f o r m a t i 伽3l 3 2 4t h ei n f l u e n c eo f i n f e c t i o nt i m 【e t ot r a n s f o r m a t i o n 3 2 3 2 5t h ei n f l u e n c eo f a c e t o s y r i n g o n et ot r a n s f o r m a t i o n 3 2 3 2 6t h ei n f l u e n c eo f a n t i b i o t i c sc o n c e n t r a t i o nt or a m s f o r m a t i o n 3 3 3 3a c q u i s i t i o na n dm o l e c u l a rd e t e c t i o no f t h et r a n s f o m a df a r e s 3 3 3 3 1c o n s t r u c tt h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sw i t hc r y l l ag e n e 3 3 3 3 2a c x l u i s i t i o no f t h et r a n s f o r m dp l a n t s 3 6 3 3 3p c rd e t e c t i o no f t h et r a n s f o r m dp l a n t s 3 7 3 3 4r r - p c rd e t e c t i o no f t h et r a n s f o r m dp l a n t s 3 7 3 3 5w e s t e r nb l o td e t e c t i o no f t h et r a n s f o r m dp l a n t s 3 8 3 3 6i n s e c t - r e s i s t a n c ed e t e c t i o no f t h et r a n s f o r m dp l a n t s 3 8 4d i s c u s s 4 0 4 1o p t i m i z a t i o no fr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fc a u l i f l o w e r 4 0 4 2o p t i m i z a t i o no f t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f c a u l i f l o w e r 4 0 4 3i n s e c t - r e s i s t a n c ed e t e c t i o no f t h et r a n s f o r m dp l a n t sw i t hc r y l i ag e n e 4 2 5r e s u l t s 4 3 a c k n o w l e d g e m e n t 4 4 r e f e r e n c e 4 5 a c a d e m i cp a p e r sp u b l i s h e dd u r i n gt h em a s t e rd e g r e e 5 0 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 l 洼；垫遗查墓丝霞墨鳖型岂魉的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：瓣 日期：帅年6 月9日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：狄霸雏日期：) 咖年多月。日 导师签名：葱叫 嗍肿年吲口日 ，|，l 一 一 如 摘要 摘要 花椰菜( b r a s s i e ao l e r a c e av a r b o t r y t i s ) 是十字花科芸薹属中重要的蔬菜作物。不仅在我国 的蔬菜生产中占有重要地位，在世界范围内也广泛种植。但是近年来，花椰菜的虫害十分严 重，其中以鳞翅目的菜青虫( p i e r i sr a p a e ) 和小菜蛾( p l u t e l l a x y l o s t e l l a ) 为主。在我国，小 菜蛾对花椰菜的危害呈明显上升趋势。常用的化学防治措施不仅污染环境，且害虫容易产生 抗药性，因此，选育和应用抗虫品种，既经济有效又安全环保，是防治害虫最理想的方法。 b tc j 励杀虫晶体蛋白基因是由本课题组从苏云金芽胞杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称 b t ) 的野生菌株b t c 0 0 8 中克隆得到的一种具有很高杀虫活性的杀虫晶体蛋白( 1 n s e c t i c i d a l c r y s t a lp r o t e i n s ，i c p s ) 。它是一类特殊的c o l 类基因，与生产中常用的c r y l a 类基因相似性较 低。c r y l i a 蛋白有较强的杀虫活性和相对较广的杀虫谱，对亚洲玉米螟、小菜蛾等有很强的 杀虫活性，其杀虫效果与c r y i a b 和c r y l a c 相当，但与c r y l a b 和c r y l a c 无交互抗性。 本研究以具柄子叶和下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌介导法将苏云金芽胞杆菌杀虫蛋 白基因c 砂j 励导人花椰菜中，并优化了转化体系，研究了不同因素对花椰菜转化效率的影响。 试验结果表明：花椰菜的基因型与外植体对抗性芽的再生有显著影响，本试验中瑞士雪球的 具柄子叶和下胚轴是比较理想的外植体；不同激素对花椰菜芽再生的影响较大，本试验中添 加2 m g d l 的6 b a 和0 0 5 m g l 的n a a 时不定芽的再生频率较高；生根培养基中添加0 1 m g l 的 i a a 时，生根效果最好：另外，用农杆菌e h a l 0 5 介导的转化，转化效率要高于l b a 4 4 0 4 ：在 侵染液及共培养基中添加乙酰丁香酮，能提高花椰菜的转化频率；在培养基中添加银离子并 没有促进芽的再生；使用1 0 m g l 的卡那霉素筛选阳性植株，可有效筛选出转基因植株；使用 3 0 0 m g l 的羧苄青霉素能完全抑制住农杆菌的污染；同时对农杆菌的侵染时间进行了优化， 结果表明以下胚轴8r a i n 、具柄子叶1 5 r a i n 为最佳。 转化后的外植体在含有卡那霉素的培养基上诱导不定芽和诱导生根，共获得了4 2 株抗性 植株，经p c r 检测，其中的l8 株呈阳性。进一步通过r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 检测，共有1 4 株均 呈阳性反应，检测结果初步说明c 眇j 血基因已整合到花椰菜的基因组中并得到有效地表达。 转基因植株用小菜蛾幼虫进行饲虫试验，结果表明昆虫幼虫的校正死亡率高达9 9 9 6 ，同时， 存活幼虫的生长发育也受到了明显抑制。 关键词花椰菜，农杆菌介导，c r y i a 基因，小菜蛾，转基因植株 一 蜇 一 0 味 a b s t r a c t _ t r a n s f e rb tc r y l i ag e n ei n t oc a u l i f l o w e rb y a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n a b s t r a c t c a u l i f l o w e r ( b r a s s i e ao l e r a c e av a r b o t r y t i s ) ，o n eo ft h em o s ti m p o r t a n tv e g e t a b c r o p s ，i s p l a n t e da l lo v e rt h ew o r l d n o w a d a y s ，i ti sa l s oa m a i nv e g e t a b i nc h i n a b u ti n s e c t - p e s t sh a v e c a u s e ds e v e r ed a m a g e a m o n gt h e mg r e e nw o r m ( p i e r i sr a p a el ) a n dd i a m o n d b a c km o t h ( p l u t e l l ax y l o s t e l l al ) a r et h ep r i m a r yp e s t s i nc h i n a ，d i a m o n d b a c km o t hi so n eo ft h em o s t d e s t r u c t i v ep e s t sa n di t sd a m a g eh a sr i s e nr a p i d l ye s p e c i a l l yf o rc r u c i f e r o u sv e g e t a b s b e c a u s e t h ep e s t sa l ee a s yt oi n d u c er e s i s t a n c et oi n s e c t i c i d e ，i ti st h eb e s tw a yt oo b t a i nt h ec u l t i v a r so f i n s e c t - r e s i s t a n c ei np e s tc o n t r 0 1 b te r y l ag e n eh a sb e e nc l o n e df r o mb a c i l l u s t h u r i n g i e n s i ss t r a i n sb t e 0 0 8a n dh a sn o h o m o l o g yw i t hc r y l a - t y p ew h i c hi sc o m m o n l yu s e di np e s tc o n t r 0 1 c r y ll ap r o t e i nh a v er e l a t i v e l y b r o a di n s e c t i c i d a lc o n t r o l l i n gs p e c t r u m ，s t r o n gi n s e c t i c i d a la c t i v i t yf o rc o r nb o r e r , d i a m o n d b a c k m o t h i n s e c t i c i d a la c t i v i t yo fc r y li ap r o t e i ni ss i m i l a rt oc r y l a ba n dc r y l a c ，b u td i d n th a v e c r o s s - r e s i s t a n c ew i t hb o t ho f 也e m t h ec o t y l e d o np e t i o l e sa n dh y p o c o t y l so fc a u l i f l o w e r ( b r a s s i c ao l e r a c e av a r b o t r y t i s ) ) w e r e t r a n s f o r m e dw i t ha g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sh a r b o r i n gc a m v 3 5 s - l l an o se x p r e s s i o nv e c t o r c o n t a i n i n gc a m v 3 5 sp r o m o t e r ，n p ti im a r k e rg e n ea n dt h ei n s e c t i c i d a lp r o t e i ng e n eb tc r y l i a g e n e i nt h i ss t u d yt h ee f f e c t so fi n f l u e n c i n gf a c t o r so ng e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yo f c a u l i f l o w e rw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e d ：b o t ht h eh y p o c o t y l sa n dc o t y l e d o no fr u i x u e w e r e p e r f e c te x p l a n t sf o rt r a n s f o r m a t i o n ；t h eh o r m o n ew a sa ni m p o r t a n tf a c t o ro nt h e r e g e n e r a t i o no fa d v e n t i t i o u sb u d s ，w ec o u l do b t a i nh i 【g hr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yb ys u p p l e m e n t i n g 6 - b a2m g la n dn a a0 0 5m g lo nt h em sm e d i u m ；a d d i n g0 1 m g l 队at om sm e d i u mh a d g o o de f f e c to nr o o t i n gp e r i o da n dr o o tq u a l i t yo fr e g e n e r a t es h o o t s ；i n f e c t i o u sa c t i v i t yo f a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n se h a l 0 5w a ss u p e r i o rt ol b a 4 4 0 4 ；a c e t o s y r i n g o n ec o u l dp r o m o t e t h er e g e n e r a t i o no fa d v e n t i t i o u sb u d si nt h et r a n s f o r m a t i o n ；i tw a sn oo b v i o u sd i f f e r e n c et oa d d s i l v e rn i t r a t eo nt r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yo fc a u l i f l o w e r ；t h er e s u l ts h o w e dt h a t 1 0 m g l k a n a m y c i nw o u l dc o m p l e t e l yi n h i b i tg r e e ns h o o tr e g e n e r a t i o nf r o me x p l a n t so fc a u l i f l o w e r , s oi t w a sa v a i l a b l et os e l e c t i n gt r a n s g e n i cp l a n t s ；t h ec a r b e n i c i l l i nc o n c e n t r a t i o nw a sd e c i d e dt ou s e w i t h3 0 0 m g l ；t h ee x p e r i m e md e t e c t e dt h a tt h e o p t i m i z e di n f e c t i o nt i m ew a s8m i l lf o rc o t y l e d o n a n d15r a i nf o rh y p o c o t y l s t h r o u g hs u c c e s s i v es e l e c t i o ni nt h ep e r i o do fs h o o ta n dr o o ti n d u c t i o nu n d e rk a n a m y c i n s e l e c t i n gp r e s s u r e ，4 2k a n a m y c i nr e s i s t a n tr e g e n e r a t e dp l a n t sw e r eo b t a i n e d ，18o ft h e mw e r e m 东北农业大学理学硕士学位论文 一 p o s i t i v er e s u l t e db yp c rd e t e c t i o nw h i c hd e m o s t r a t e dt h a tc r y l l ag e n ew a si n t e g r a t e di n t ot h e g e n o m e m o r e o v e r , r t - p c ra n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i s d e m o n s t r a t e dt h a tc r y 】kg e n ew a s e x p r e s s e di nr n aa n dp r o t e i nl e v e l si n 1 4p l a n t s t h et r a n s f o r m a t i o np l a n t sw e r eg i v e ni n s e c t f e e d i n gt e s tw i t hl a r v a eo fd i a m o n d b a c km o t h t h e r e s u l t ss h o w e dt h em o r t a l i t yo fi n s e c tl a r v a e w a sa c c o u n t e df o r9 9 6 ，a n dt h eg r o w t ho f t h es u r v i v a l l a r v a ew e r es e r i o u s l yi n h i b i t e d k e y w o r d s ：c a u l i f l o w e r , a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d , c r y l l ag e n e ，d i a m o n d b a c km o t h ，t r a n s g e n i c p l a n t i v c a n d i d a t e ：z h a n gy o n g x i a s p e c i a l i t y ：b o t a n y s u p e r v i s o r - p r o f t a n gj i n g 引言 1 引言 自1 9 8 3 年首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了飞速的发展，人们已经能用 多种方法将外源基因导入不同的植物体内。植物遗传转化是植物性状改良的有效手段，与常 规育种手段相比，应用植物转基因技术可以加快育种进程，创造出常规育种难以得到的基因 型；另外，转基因作物能使杀虫剂和除草剂的用量减少，提高作物的产量，从而保护了环境 资源。利用转基因技术培育作物新品种已经成为重要的育种手段，从1 9 9 6 年第一例转基因作 物商业化种植到2 0 0 9 年，全球转基因作物种植面积持续增长，2 0 0 9 年达到1 3 7 亿公顷( j a m e s ， 2 0 0 9 ) 。 目前转基因类型包括抗除草剂、抗虫、抗病毒、抗逆境转基因作物，而这其中虫害是影 响作物产量的一个重要因素，抗虫性是全球作物基因工程的主要目标之一。 1 1 植物抗虫基因工程研究进展 用于植物抗虫基因工程的外源基因来源十分广泛，有来源于细菌的杀虫晶体蛋白基因、 来源于植物的蛋白酶抑制剂基因和植物凝集素基因、来源于昆虫的神经毒素基因等等，其中 来源于苏云金芽胞杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称研) 的杀虫晶体蛋白基因在植物转基因 研究中应用最为广泛、杀虫效果最好。 1 1 1b t 杀虫蛋白基因 b 压塞因来源于苏云金芽孢杆菌，由s c h n e p f 等人于1 9 8 1 年首次成功克隆( s c h n e p f he e t a 1 ，1 9 8 1 ) 。苏云金芽胞杆菌是一种革兰氏阳性细菌，属于原核生物细菌纲、芽胞杆菌科、 芽胞杆菌属，广泛存在于土壤、尘埃、沙漠、植物、昆虫尸体中。该菌在形成芽胞的同时， 能产生蛋白性质的伴胞晶体( p a r a s p o r a lc r y s t a l ) ，对鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 、双翅目( d i p t e r a ) 、 鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 、膜翅目( h y m e n o p t e r a ) 、同翅目( h o m o p t e r a ) 、直翅目( o r t h o p t e r a ) 、 食毛目( m a l l o p h a g a ) 等多种昆虫以及线虫、蜗类和原生动物具有特异性的杀虫活性( b e e g l e e t a l ，1 9 9 2 ：f e i t e l s o ne t a l ，1 9 9 3 ；f e i t e l s o ne t a l ，1 9 9 2 ：s c h n e p f e t a l ，1 9 9 8 ) 。这种杀虫 晶体蛋白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s ，i c p s ) 对人畜无害，不污染环境，通常也被称为5 - 内 毒素( d e l t a - e n d o t o x i n ) 。8 - 内毒素是在芽胞形成过程中构成伴胞晶体的最主要的蛋白，分子 量大小一般为1 3 0 - - 1 6 0k d 。 1 1 1 1 研杀虫蛋白基因分类 1 9 8 9 年h o f f e 和w h i t e l e y 根据历基因的杀虫活性和一级结构，将当时克隆的4 2 种研 东北农业大学理学硕士学位论文 基因分为5 大类，包括1 4 个亚类。其中第一大类为c r yl 主要抗鳞翅目昆虫；第二大类为 c r y1 1 , 主要抗鳞翅目和双翅目昆虫：第三大类为c r y i i i , 主要抗鞘翅目昆虫；第四大类为c r y 矾主要抗双翅目昆虫，这四类统称为晶体蛋白家族( c r y s t a lp r o t e i ng e n e ) 第五大类称 为溶胞蛋白基因( 吼o l 舛c p r o t e i ng e n e ) ，对双翅目昆虫具有杀虫活性。随着新的杀虫蛋白的 分离鉴定。发现有的杀虫蛋白序列高度同源，但杀虫特异性不同；而有的杀虫蛋白同源性很 低，但具有相似的杀虫活性，即杀虫蛋白氨基酸序列和杀虫特异性并不相关。这使得对新基 因的分类令人困惑，为了消除这种困惑，1 9 9 8 年c r i c k m o r e 等提出了一种新的c r y 杀虫晶体 蛋白分类方法，根据氨基酸同源性进行分级分类，形成了一个开放式分类系统。同源性在4 5 以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在4 5 - 一7 8 之间，为第二等级，用大写英 文字母表示；同源性在7 8 9 5 之间为第三等级，用小写英文字母表示；同源性在9 5 以 上，为第四等级，用阿拉伯数字表示。只要满足来自历的伴胞晶体，对目标生物具有毒性， 或者与已知的c r y 或c y t 蛋白具有高同源性，就可以纳入这一分类系统( c f i c k m o r ee t 口f ， 1 9 9 8 ) 。按照新的分类系统来划分，截止到2 0 1 0 年2 月，全球共发现和公布了5 2 1 种研杀 虫晶体蛋白基因( 可参见网址h t t p ：w w w 1 i f e s c i s u s s e x a c u k h o m e n e i lc r i c k m o r e b t ) 。 1 1 1 2b t 杀虫蛋白的杀虫机理 研基因主要有晶体蛋白基因家族( c r y s t a lp r o t e i ng e n e s ，以c 秒表示) 和细胞外溶解性晶体 蛋白基因两大类群( c y t o l y t i cp r o t e i ng e n e s ，以碱示) 。近年来，人们又分离出一类新型杀 虫蛋白( v e g e t a t i v ei n s e c t i c i d a lp r o t e i n s ) ，命名为v l p s ( e s t r u c hjje ta 1 ，1 9 9 6 ) 。迄今在植 物转基因中利用的基因主要为c 秒类基因。 杀虫晶体蛋白( 即6 内毒素) 在昆虫的中肠碱性和还原性环境下，被降解成6 0 k d 左右的 活性小肽，这种被激活的毒性肽可穿过围食膜到达中肠上皮柱状细胞，与刷状缘膜( b r u s h b o r d e rm e m b r a n ev e s i c l e s ，b b m v ) 上的特异高亲和受体位点进行识别与结合。毒性分子与受 体结合以后，毒性分子的部分结构在受体的帮助下插入细胞膜中，并在细胞膜上形成孔道， 关于孔道的形成模型已多次报道( k n o w l e se t a l ，1 9 9 4 ；s c h w a r t z e t a l ，1 9 9 7 ；g a z i t e t a ， 1 9 9 8 ) ，但是具体的过程还不太清楚。这些形成的孔道可以允许正、负离子及一些寡糖如麦芽 糖、蔗糖或棉子糖的通过，从而破坏了细胞的离子平衡最终导致了昆虫细胞的破裂，最终导 致其瘫痪或死亡。已有研究