（动物学专业论文）基于纳米碳管的葡萄糖生物传感器的研究.pdf

摘要 摘要 生物传感器已发展成为一种新型的分析手段，被广泛应用于临床、环境、 监测、食品卫生等领域。生物传感器活性界面的构建直接影响到生物传感器的 测定灵敏度、线性范围和使用寿命等，是制备性能优良的生物传感器的关键技 术，同时也是生物传感器得以改进和开发的重要技术背景。本论文致力于发展 新型生物活性材料固定化方法用于构建生物传感器活性界面，以提高固定化生 物分子的活性，达到提高生物传感器灵敏度、延长传感器使用寿命等目的。表 面修饰是生物传感器构建过程中的关键步骤，所采用的固定化材料对传感器性 能有重要影响。纳米材料因具有良好的生物相容性、吸附性、导电性等，在材 料学、生物学、医学等领域有广泛的应用前景；自组装技术具有操作简单、材 料可选择、酶量可控、可重复性好、条件温和等特点，已成为最有前途的纳米 膜制备技术之一。将二者分别引入或者同时引入葡萄糖生物传感器可在多方面 提高其传感性能，基于此本实验采用原位生长和滴涂法制分别备出p t c n t s 聚苯 胺g o x 和p t c n t s p b g o x 二种高性能葡萄糖生物传感器。本研究主要过程和结 果如下： 实验一；在经m w c n t s 修饰后的p t 电极表面用戊二醛交连法固定葡萄糖氧 化酶，经p d d a 和p s s a 修饰后，对比了甲苯磺酸( t s a ) 和磺基水杨酸( s s a ) 分别 掺杂后的电极表面的拉曼光谱和u v - v i s 曲线，最终选取p a n i - t s c n t s 修饰的 p t 电极进行测量。在底物浓度o 5 3 0 0 r a m 的范围内，r r 曲线呈现出良好的线性， 线性拟合方程为y = 0 0 1 + 0 3 3 x ，相关系数为0 9 8 6 ，灵敏度是0 3 3 u a m m ，响应 时间 1 0 s 。 实验二；采用静电吸附技术，将葡萄糖氧化酶固定在用生物相容性好的 m w c n t s 修饰过的p t 电极上，再电镀上导电性能良好的p b ，从而制各了性能良 好的酶生物传感器，在底物浓度o 2 8m m 的范围内，r r 曲线呈现出良好的线性， 线性拟合方程为y = 0 2 4 + o 4 7 x ，相关系数为0 9 8 6 ，灵敏度是0 4 7 u a m m ，响应 时间 8 s 。应用于对葡萄糖的检测，制得的传感器性能良好，具有较高的灵敏度， 较低的检测限，良好稳定性及重现性。此外该传感器制作成本低，并可多次重 复使用，具有潜在的应用价值。 摘要 关键词：葡萄糖生物传感器、表面修饰、纳米材料、聚苯胺、普鲁士蓝 a b s t r a c t a b s t r a c t b i o s e n s o rh a sd e v e l o p e di n t oan e wa n a l y t i c a lm e t h o d ，w h i c hh a sb e e nw i d e l y a p p l i e di n t h ec l i n i c a ld i a g n o s i s ，e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，a n df o o ds a n i t a t i o n c o n t r o le t c t h ed e v e l o p m e n to fs i m p l ea n de f f e c t i v es t r a t e g i e sf o r t h ec o n s t r u c t i o no f a c t i v ei n t e r f a c eo nt h es e n s o rs u b s t r a t es u r f a c ei sac r u c i a ls t e pi nt h ed e s i g na n d f a b r i c a t i o no fb i o s e n s o r s ，w h i c hn o to n l yd i r e c t l yi n f l u e n c e s t h ep e r f o r m a n c eo f b i o s e n s o r ，s u c ha ss e n s i t i v i t y ，d e t e c t i o nr a n g ea n ds t a b i l i t ye t c ，b u ta l s ol a y sa f o u n d a t i o nf o rd e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no fb i o s e n s o r s t h ed i s s e r t a t i o nf o c u s e s o nd e v e l o p i n gn e ww a y sf o rf a b r i c a t i n gn o v e lb i o s e n s o ra c t i v e i n t e r f a c e sf o rt h e p u r p o s eo fi m p r o v et h eb i o a c t i v i t yo fi m m o b i l i z e db i o m a t e r i a l s ；p r e p a r eb i o s e n s o r s w i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n d l o n gt e r ms t a b i l i t y s u p e r f i c i a lm o d i f i c a t i o ni st h ek e ys t e pf o rt h ep r e p a r a t i o no fb i o s e n s o r ，t h e m a t e r i a lw h i c hc h o s et oi m m o b i l i z ep l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ec o n s t r u c t i o n p r o g r e s s b e c a u s e o ft h eg o o dp e r f o r m a n c ei n b i o - c o n s i s t e n t 、a b s o r p t i o n 、 c o n d u c t i b i l i t ye t c ，n a n o m a t e r i a lw e r ew i d e l yu s e di nh y l o l o g y 、b i o l o g y 、m e d i c i n e t h es e l f - a s s e m b l yt e c h n i q u eh o l d st h ea d v a n t a g e so fs i m p l em a n i p u l a t i o n 、s e l e c t i v e m a t e r i a l 、c o n t r o l l a b l ee n z y m ed o s e 、g o o di t e r a t i o n 、m i l dc o n d i t i o n s ，a n db e c o m e so n e o ft h em o s tp r o m i s i n gt e c h n i q u ei np r e p a r i n gt h en a n o m e m b r a n e i n t r o d u c i n go n eo f t h e mo rb o t ho ft h e mi n t ot h ep r e p a r i n go fg l u c o s eb i o s e n s o rc o u l de n h a n c et h e c a p a b i l i t yo ft h es e n s o ri nm a n ya s p e c t s a c c o r d i n gt ot h i s ，t h ea r t i c l eu s e dt h e m o t i o n l e s sg r o w i n gm e t h o da n da d s o r b e n tm e t h o da n dp r e p a r e dt w oh i g hq u a l i t y g l u c o s eb i o s e n s o r s ，p t c n t s p o l y a n i l i n e g o xa n dp t c n t s p b g o xr e s p e c t i v e l y t h er e s e a r c hp r o g r e s sa n dc o n c l u s i o na sf o l l o w e x p e r i m e n to n e ：t h ep te l e c t r o d ew a sm o d i f i e db ym w c n t sa n dt h e nt h eg o x w a sf i x e db yt h e g l u t a r a l d e h y d eo nt h es u r f a c eo ft h ep te l e c t r o d e ，a f t e rt h e m o d i f i c a t i o nb yp d d aa n dp s s a ，t h et s aa n ds s aw e r em i x e do nt h es u r f a c eo ft h e e l e c t r o d ea n dt h er a m a ns p e c t r aa n du v - v i sc u r v ew h i c hd e r i v i n gf r o mt h e s u r f a c eo fp te l e c t r o d ew e r ec o m p a r e d t h ep a n i t s a c n t sp te l e c t r o d ew a s i n a b s t r a c t s e l e c t e dt ot e s tf i n a l l y w h e nt h es u b s t r a t e sc o n c e n t r a t i o nb e t w e e n0 5 3 0 0 m m 。 t h ei tc u r v es h o w si t s e l fag o o dl i n e a r n e x u s ，t h el i n e a rf o r m u l ai s y = 0 0 1 + o 3 3 x ，c o r r e l a t i v ec o e f f i c i e n ti s0 9 8 6 ，s e n s i t i v i t yi s0 3 3 u a m m r e s p o n d s t i m eu n d e r1 0 s e x p e r i m e n tt w o ；t h ep te l e c t r o d ew a sm o d i f i e db vm w c n t sa n dt h e nt h eg o x w a sf i x e do nt h es u r f a c eo fp te l e c t r o d eb ys t a t i ca b s o r p t i o n ，t h e nt h eg o o dc o n d u c t o r p bw a se l e c t r o p l a t e dt o p r e p a r e ah i g h q u a l i t ye n z y m eb i o s e n s o r w h e nt h e s u b s t r a t e sc o n c e n t r a t i o nb e t w e e n0 2 8m m ，t h ei tc u r v es h o w si t s e l fag o o d l i n e a rn e x u s ，t h el i n e a rf o r m u l ai sy = 0 2 4 + o 4 7 x ，c o r r e l a t i v ec o e f f i c i e n t0 9 8 6 ， s e n s i t i v i t yi s0 4 7 u a m m ，r e s p o n d st i m eu n d e r8 s f o rt e s t i n gt h eg l u c o s e ，t h eg a i n e d b i o s e n s o rh a sag o o dp e r f o r m a n c ew i t hh i g hs e n s i t i v i t y 、l o wd e t e c t i o nl i m i t 、w e l l s t a b i l i t ya n dr e p e a t a b i l i t y b e s i d e ，t h eb i o s e n s o ri sr e p e a t a b l ea n dt h ep r e p a r a t i o no f t 1 1 eb i o s e n s o rc o s t saf e w s oi th a sa p o t e n t i a lv a l u e k e yw o r d s ：g l u c o s eb i o s e n s o rs u r f a c em o d i f i c a t i o nt e c h n i q u en a n o m a t e r i a l s p o l y a n i l i n ep r u s s i a nb l u e 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：荔确 叫年r 月移日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： iii”7“”“。”“”? ”! ”“”“、1 ”1 ”。“、”“。 ；内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) ! 秘密1 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 5 机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：弓，布角 年歹月哆日 南开大学学位论文电子版授权使用协议 论文基于纳米碳管的葡萄糖生物传感器的研究系本人在南开大学工作和学习 期间创作完成的作品，并已通过论文答辩。 本人系本作品的唯一作者( 第一作者) ，即著作权人。现本人同意将本作 品收录于“南开大学博硕士学位论文全文数据库”。本人承诺：已提交的学位 论文电子版印刷版论文的内容一致，如因不同而引起学术声誉上的损失由本人 自负。 本人完全了解堡直珏太堂图盘焦差王堡在：僮旦堂焦途塞的簧堡壶法翌。同 意南开大学图书馆在下述范围内免费使用本人作品的电子版： 本作品呈交当年，在校园网上提供论文目录检索、文摘浏览以及论文全文部 分浏览服务( 博士论文前2 4 页) 。公开级学位论文全文电子版于提交1 年后， 在校园网上允许读者浏览并下载全文。 注：本协议书对于“非公开学位论文在保密期限过后同样适用。 院系名称：生命科学学院 作者签名：黄楠 学号：2 1 2 0 0 6 0 8 0 4 日期：2 0 0 9 年5 月2 0 日 第一章引言 第一章引言 1 1 生物传感器 1 1 1生物传感器的概念及发展 生物传感器就是指用固定化的生物体成分( 如：酶、抗原、抗体、核酸、激 素等) 或生物体本身( 如细胞、细胞器、组织等) 作为分子识别元件，对被分析物 具有高度选择性的分析仪器。生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、 电子技术等多种学科相互渗透成长起来的新学科，这种交叉学科在理论上和技 术上均有许多新的问题要进行探索和开发，在应用上有极为宽广的领域可以进 行开拓1 1 。 生物传感器具有选择性高，分析速度快，操作简易和仪器价格低廉等特点， 而且可以进行在线甚至活体分析，因此引起世界各国的极大关注【l 】。 从1 9 世纪4 0 年代起，在科学研究中就已经开始用酶作为分析试剂来检测研 究特定的物质，酶不仅对底物，对与之相应的辅酶、抑制剂也能识别。1 9 6 2 年 c l a r k 2 j 等人首次提出把酶与电极结合来测底物的设想，在氧电极的基础上提出 了研制葡萄糖生物传感器的设计原理。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s t 3 j 报道了酶的固 定化技术，并研制出世界上第一支葡萄糖酶电极，开创了生物传感器的历史， 这可称为第一代生物传感器。其后逐步发展出组织、微生物、免疫、酶免疫和 细胞器等传感器，称为第二代生物传感器。第三代生物传感器是将生物技术和 集成电路技术结合起来，研制成场效应生物传感器。现在更有将生物传感器和 流动注射分析与电脑技术相结合，预计将发挥更大的作用。 进入2 0 世纪8 0 年代，生物技术和传感技术水平的提高，在国际上引起了对 生物传感器的广泛研究。当今许多发达国家都把生物传感器列为关键技术，给 予特别的重视和支持。近十多年来已经研制出一系列在环境监测，临床检验和 生化分析等方面具有实用价值的生物传感器，可以测定糖类、有机酸、蛋白质、 抗原、抗体、d n a 、激素、生化需氧量以及某些致癌物质等【4 j 。尽管到目前为止， 真正商品化的生物传感器为数不多，但其研究和开发的势头很大，相信不久的 第一章引言 将来一定会研制出更多有用的生物传感器。 葡萄糖测定在医疗诊断( 例如血糖、尿糖浓度) 、发酵工业中占有相当重要地 位，如何快速准确的测定葡萄糖浓度一直是重要的研究课题。 11 ，2 生物传感器原理 生物传感器依据其结构，一般可分为两个组成部分口】：其一是分子识别元件 ( 感受器) ，分子识别元件是采用固定化技术将一些具有分子识别能力的生物活性 物质固定在载体上所形成的功能薄膜，这些生物活性物质包括酶( e n z y m e s ) 、微 生物( m i c r o b e s ) 、全细胞( w h o l ec e l l s ) 、细胞器( o r g a n e l l e s ) 、组织( t i s s u e s ) 、抗原 ( a n t i g e n s ) 和抗体( a n t i b o d i e s ) 和核酸( n u c l e a r a c i d s ) 等，它们是具有催化活性或亲和 作用的生物分子，能够专一识别各种被测物质，并与之发生物理、化学或生物 化学变化。其二是信号转换器( 换能器) ，主要是由电化学或光学检测元件，如电 极( 固体电极、离子选择性电极、气敏电极等) 、热敏电阻器、离子敏或化学敏场 效应晶体管、压电晶体、光导纤维、光敏二极管等构成，它能把膜上进行的生 化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光、热等转变为电、光信号，最后 把所得的信号经过电子技术处理后，在仪器上显示或记录下来。 如图l1 生物传感器原理示意图所示：当待测物质( 底物、辅酶、酶、维生 素、抗原、抗体、抗菌素等) 经扩散作用进入固定化生物敏感膜层，经分子识别， 发生化学反应，产生的信息( 或光、热等) 继而被相应的化学或物理换能器转变成 可定量和可以处理的电信号或光信号等并输出，根据输出信号的大小或强弱便 可知道所测物质的浓度。 ，一 i 、 待测物质 、分子识别嚣件信号转换器- 可测量的信号 一， 幽1 1 生物传感器原理示意幽 第一章引言 本论文各章节所研究的葡萄糖生物传感器工作原理主要是：葡萄糖( c 6 h 1 2 0 6 ) 在c o x ( 分子识别元件) 的催化下，被氧氧化生成葡萄糖酸( c 6 h 1 2 0 7 ) 和过氧化氢 ( h 2 0 2 ) ，h 2 0 2 发生氧化电化学反应产生电子，当产生的电子转移到电极( 信号转 换器) 表面即产生安培电流，根据电流的大小可以测定葡萄糖的含量。因此只要 将g o x 固定在电极表面即可构成测定葡萄糖的生物传感器。 1 1 3 生物传感器的分类 生物传感器根据分子识别元件与待测物结合的性质可分为二类【6 】，即催化型 生物传感器和亲和型生物传感器。前者利用酶的专一性和催化性，如酶传感器、 微生物传感器、组织传感器等，它检测的是整个反应动力学的总效应；后者则 利用分子间特异的亲和性，如免疫传感器、受体传感器、d n a 传感器等，它检 测的是热力学平衡的结果。 催化型生物传感器利用生物催化剂的专一性和催化性或底物对它的抑制作 用，对其作用的底物进行检测，酶生物传感器是典型的催化型生物传感器，其 反应形式可用通式表示： s + r _ s r _ p ( p 一生成物) 而亲和型生物传感器则利用生物活性物质对底物的亲和或键合作用，如抗原与 抗体间专一性识别及结合的性质来对抗原、半抗原或抗体进行检测，植物凝集 素对底物的键合作用和d n a 分子与蛋白质的相互作用也包括在其中。其反应形 式可用通式表示： s + r s r ( s 一底物，i o 一受体) 此外，还可将生物催化识别元件与受体作用识别元件结合作为敏感元件，如 酶一抗体( 或抗原) 等；还有利用核酸链间碱基序列互补特异性的生物传感器【7 】。 本论文所研究的葡萄糖生物传感器是催化型生物传感器中的酶传感器。 如果根据分子识别元件进行分类： 3 第一章引言 表1 1 根据分子识别原件分类传感器 1 1 4 生物传感器的特点 经典的分析技术，如高压液相色谱( h p l c ) 、气相色谱( g c ) 和质谱等，费时、 昂贵、要求对样品进行预浓缩，难以广泛应用。生物传感器作为一种新的检测 手段，与之相比有以下的优点： ( 1 ) 测定范围广泛。根据生物反应的特异性和多样性，理论上可制成测定所 有生物物质的传感器。 ( 2 ) 测定过程简单迅速。由于分子识别元件是由高选择性的生物材料构成， 一般就不需要样品的预处理，这样就将样品中的被测组分的分离和检测统一。 ( 3 ) 样品用量少，灵敏度高。由于生物敏感膜分子的高度特异性、灵敏性， 故对一些含量极低的检测对象也能准确地反应出来。 ( 4 ) 检测时不需加入其它试剂，是一种准确的“无试剂”分析方法。 ( 5 ) 重复性好。将敏感材料固定化保证可以反复多次使用，有较好的稳定性。 ( 6 ) 响应快，体积小，可以实现连续在线检测。 ( 7 ) 可进入生物体内。如安放于静脉或动脉中的葡萄糖传感器能持续不断地 监测血糖含量，并将指令传给植入人体的胰岛素泵，控制胰岛素释放量，从而 使糖尿病人获得解救。 4 第一章引言 及 ( 8 ) 成本低。传感器连同测定仪器的成本远低于大型分析仪器，因而便于普 1 1 5 生物传感器的应用： 生物传感器作为一种新型快速、准确、实时的检测手段，被广泛应用于多 种领域， ( 1 ) 生物医学领域 生物传感器在生物医学中应用广泛，可检测体液中的微量蛋白( 如特异性 抗体、神经递质) ，小分子有机物( 如葡萄糖、乳酸及各种药物) ，核酸( 如 病原微生物、异常基因) 等多种物质。在现代医学检验中，这些项目是临床诊 断和病情分析的重要依据【8 】。体内实时监控的生物传感器对于手术中和重症监护 的病人有很大帮助。生物传感器也被应用于生理学的研究，例如，将微电极用 作电化学探针，可检测动物脑神经递质的扩散过程；利用微米级超微电极可在 细胞水平上对药物的代谢状况进行检测。 ( 2 ) 环境监测领域 生物传感器为环境监测的连续化和自动化提供了可能，而且能有效降低环 境监测的成本。目前，应用于环境监测领域的生物传感器总体可分为两类【9 】：一 类是酶传感器，利用一些污染物对酶活性的催化作用( 如酚类对酪氨酸酶) 、 特异性抑制作用( 如有机磷酸脂类对乙酰胆碱酯酶) 或调节作用( 女l l m n 2 + 对辣 根过氧化物酶) 等，通过检测酶反应所产生的信号即可间接测定污染物含量。 另一类是微生物传感器，利用活微生物的代谢功能检测污染物含量，如利 用丝孢酵母或芽孢杆菌制备用于监测水质有机污染情况的b o d 生物传感器、利 用硝化菌制备用于检测大气及废水中氨含量的氨传感器、利用甲基单胞鞭毛虫 制备生物传感器。 ( 3 ) 食品工业领域 在食品和医药工业中，为保证产品质量，必须实现生产过程的自动监控。 例如，为确保发酵生产的啤酒的质量，必须对乙醇进行在线监测。有些微生物 可通过消耗氧把乙醇分解成二氧化碳和水，若将这些微生物固定在氧电极上， 5 第一章引言 通过测量氧的消耗便可以确定乙醇的浓度，实现对乙醇的在线监测【1o 】。又如， 在鱼的a n t _ 处理中，三磷酸腺苷( a t p ) 只存在于活细胞内，因此a t p 可作为鱼鲜 度的衡量标准。利用黄嘌呤氧化酶作为敏感元件，结合h 2 0 2 电极制成生物传感 器【1 1 】，可测定鱼体内的磷酸肌苷、肌苷和次黄嘌呤的浓度，从而评价鱼的鲜度。 ( 4 ) 医药生产领域 在医药生产特别是新药开发中，需要对药物进行分析。应用于药物分析的 生物传感器的典型代表是表面等离子共振( s p r ) 器。这是一种表面膜共振分析， 是实时测定生物分子结合的技术。以抗原抗体结合分析为例【l2 1 ，将抗原( 或抗 体) 通过表面化学方法固定在芯片的金箔表面，然后让抗体( 或抗原) 流过， 抗原抗体的结合将改变膜表面液体性状，从而影响金箔共振性质，这一改变可 被实时监测并记录下来，根据改变量的多少就可以知道抗原与抗体的结合量。 ( 5 ) 军事上的应用 现代战争往往是在核武器、化学武器、生物武器威胁下进行的战争。侦检、 鉴定和检测是整个“三防”医学中的重要环节，是进行有效化学战和生物战防护的 前提。由于具有高度特异性、灵敏性和能快速地探测化学战剂和生物战剂( 包 括病毒、细菌和毒素等) 的特性，生物传感器将是最重要的一类化学战剂和生 物战剂侦检器材。近年来，美国陆军医学研究和发展部研制的酶免疫生物传感 器具有初步鉴定多达2 2 种不同生物战剂的能力。美国海军研究出d n a 探针生 物传感器，在海湾沙漠风暴作战中用于检测生物战剂。 1 2 葡萄糖生物传感器的原理 早在1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s t ”】就提出了电化学葡萄糖生物传感器的原理， 他们用一薄层葡萄糖氧化酶覆盖在氧电极表面，通过氧电极检测溶液中溶解氧 的消耗量可以间接测定葡萄糖的含量。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s l l 4 1 根据此原理 成功地制成了第一支电化学葡萄糖生物传感器，从此以后，基于酶电极的电化 学葡萄糖生物传感器研究得到了迅速发展。一般来讲葡萄糖生物传感器是以葡 萄糖氧化酶( g o x ) 作为生物识别成分，有少量报道是利用葡萄糖脱氢酶制备葡萄 糖传感器l l 引。 6 第一章引言 葡萄糖氧化酶对1 3 - d 葡萄糖具有高度专一的催化氧化作用0 5 1 。其丰要的两 种来源是黑曲霉菌( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 和灰绿霉菌( p e n i c i l l i u mg l o u c u m l 。本论文实 验中使用的是前者，因此以下提到葡萄糖氧化酶均来源于黑曲霉菌。葡萄牿氧 化酶( 图1 2 葡萄糖氧化酶分子结构) 分子量为1 5 0 至1 8 6 k d a 的二聚体，其结构 包括5 8 0 个氨基酸残基，辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) ，6 个n 一乙酰氨基葡萄 糖残基，3 个甘露糖残基和1 5 2 个溶剂分子【1 “。亚单元的解离可能只在变性条件 f 发生，并伴随着辅酶f a d 的损失。辅酶在氧化还原酶中起重要的作用：氧化 还原酶进行催化作用的过程中，辅酶实际上起到电子和质子中问体的作州，叩 辅酶f a d 通过它的氧化态和还原态的不断循环而实现其功能。 ( 】) 葡萄糖氧化酶全酶的拓扑结构( 2 ) 葡萄糖氧化酶二纽结构( 中闸密集部分为f a d 弧基 图l2 葡萄糖氧化酶分子结构 葡萄糖氧化酶催化氧化1 3 - d 一葡萄糖产生葡萄糖酸内酯和过氧化氢7 ，它是这类 氧化酶典型的两步酶反应过程。这个过程包括酶引起的葡萄糖氧化，f a d 还原 成f a d h 2 ( 反应1i ) ，然后辅酶被分了氧氧化( 生物催化剂的再生) 并产生过氧化 氧r 反应12 1 ： b d g l u c o s e + g o x ( f a d 卜g l u c o s e 一6 1 a c t o n e 十g o x ( f a d h z )( 11 ) g o x ( f a d h 2 ) + 0 2 旦望! - ( f a d ) + h 2 0 2( 12 ) 反应l2 产生的葡萄糖酸内酯在水媒质中水解为葡萄糖酸： g l u c o n o 一6 一l a c t o n e + h 2 0 g l u c o n i ca c i d ( 1 孙 在上面的反应式巾，g o x ( f a d ) 是葡萄糖氧化酶的氧化卷，g o x ( f a d h ! ) 是 葡萄糖氧化酶的还原态。总反应通常表示为： 第一章引言 p - d - 9 1 u c o s e + 0 2 卜h 2 0 二= g l u c o n i ca c i d + h 2 0 2 ( 1 4 ) 根据上述反应原理，电化学葡萄糖氧化酶电极有两种 18 j ：( 1 ) 测量氧气的葡 萄糖氧化酶电极【1 引，电位通常为一o 6 至一o 9 v ( v s a g a g c l ) i ( 2 ) 测量过氧化氢 的葡萄糖氧化酶电极【18 1 ，电位通常为+ o 6 至+ 0 8 v ( v s a g a g c l ) 。h 2 0 2 发生氧化 电化学反应产生电子( 反应1 5 ) ： h 2 0 2 与0 2 + 2 h 十( 1 5 ) 根据反应1 5 ，h 2 0 2 通过氧化电化学反应产生电子，当产生的电子转移到电 极表面即产生安培电流，根据电流的大小可以测定葡萄糖的含量。因此只要将 g o x 固定在电极表面即可构成测定葡萄糖的生物传感器。由于测量过氧化氢的 葡萄糖氧化酶电极的结构简单，因而得到广泛的运用。 1 3 葡萄糖氧化酶的固定方法 酶的固定化方法是制各酶传感器的关键环节，直接影响酶活性，不同的固 定化方法有不同的优点与缺陷，适用于不同的酶蛋白的固定。酶的固定方法影 响传感器的各个性i i 比如稳定性、灵敏度、响应时间等。目前酶的固定方法 有：包埋法，吸附法，共价法，交联法，静电层层自组装法等。上述方法如图 1 3 所示。 1 3 1包埋法 箍藜貉鞲 猡猫 ( 1 ) 缒堙泣貂) 吸醚滚3 藏貉缓法( 訇交蘸滚 ( 5 ) 溶胶凝胶法 8 第一章引言 持鼷衢磐n 瓣 包埋法是将酶分子直接包埋在聚合物材料的网格结构或微胶囊结构巾。这 样可以防止酶蛋白渗出，但是底物仍能渗入格子内与酶相接触，形成稳定的生 物组分敏感膜包埋法适合于小分子底物和产物的酶。 该技术的特点是：实验条件温和、操作简单、可采用多种凝胶或聚合物、大 多数酶可很容易无化学修饰地掺入聚合物膜中、多种活性单元可同时固定，包 埋的酶不易泄漏并可结合共价键合法或交联法进一步改进稳定性，可固定高浓 度的生物活性单元，因此对它的研究也比较多。比如利用海藻酸钠凝胶包埋脂 肪酶、明胶包埋l 一抗坏血酸氧化酶、明胶包埋双乙酰还原酶等。 132 吸附法 吸附法是一种通过物理吸附作用将酶固定于小溶性载体电极表面的方法， 是一种鞍为简单的固定化技术。酶与载体之间的亲和力是范德华力、离子键和 氢键。此方法的优点：对酶分子活性影响较小，操作简单。易在许多材料上进 9 第一章引言 行。它是一种较为温和的蛋白质固定方法，能有效地保留蛋白质活性，酶电极 的响应速度快( 一般不超过3 0 s ) 。缺点：酶的负载量较低，这就意味着灵敏度 较低；同时吸附一般是可逆过程，吸附的酶易于脱落，因而随着时间的延长， 也会因此降低灵敏度，因此这种酶电极的操作和储存稳定性差；对溶液的p h 变 化、温度、离子强度和电极基底较为敏感，需要对实验条件进行相当程度的优 化，分子与固体表面结合力弱，易发生分子泄露和脱落。 1 3 。3 共价键法 将含有一n h 、一o h 、一s h 、- - c o o h 等活性基团的酶蛋白通过共价键与 电极表面上的反应基团间靠共价键连接来固定酶的方法，常包括三个步骤：基 底电极表面的活化、酶的偶联、剩余价键的封闭及除去键合疏松的组分。该方 法形成的酶膜厚度与吸附法相似，共价法的结合力较强，结合效率较高，酶与 载体之间的连接很牢固，无酶膜脱落和开裂现象，所以酶电极的响应快、稳定 性好。但也由于酶分子与载体材料表面形成较大的多点结合界面、结合力强， 易使酶的活性降低，同时该方法的操作复杂、反应条件激烈、影响固定的因素 较为复杂，酶在操作过程中易失活。固定化效率受酶、载体材料表面和连接试 剂官能团的性质及其相互作用的影响。 1 3 4 交联法 为了增加酶负载，通过借助交联剂( 具有两个或两个以上功能基的试剂) 在酶 分子之间、酶分子与载体之间交联形成网络结构而使酶固定化的方法称交联法， 交联形成的固定化酶称为交联酶。常用的载体如胶原蛋白膜、肠衣膜、尼龙布、 透析膜等。与共价结合法一样，两者都是靠化学结合的方法固定酶，其区别在 于交联法使用了交联剂，常用的交联剂有戊二醛、鞣酸、葡聚糖等。单用戊二 醛交联得到固定化酶的方法很少单独使用，将此法与包埋法或吸附法联合使用 效果较好。例如：岳振峰等以粉末状壳聚糖为载体，采用先吸附后交联的固定 法固定葡萄糖氧化酶1 22 1 。 1 0 第一章引言 1 3 5 溶胶一凝胶法 溶胶一凝胶技术是指有机或无机化合物经过溶液、溶胶、凝胶而固化，再经 过热处理而制得氧化物或其它化合物固体的方法，主要是将金属醇盐等原料配 成均匀溶液，在饱和条件下经水解缩聚等化学反应，生成物聚集成溶胶，再经 蒸发干燥转变为凝胶。其特点主要是：在固定生物大分子时，物理包埋在功能 上是非侵害的，可保存蛋白质表面微结构的完整性和方向一致性；同时可以选 择无机氧化物支持体以及控制产品的结构参数并且能制成各种几何形状。由于 其载体为无机多孔材料，具有许多高分子材料无法比拟的特性：物理特性，化 学惰性，溶剂中可以忽略的溶胀性，对光、化学、热和生物降解的高稳定性。 因此溶胶一凝胶法在生物传感器的研制中越来越受重视，在分析中的应用也越来 越广泛。 1 3 6 层层自组装技术 l a n g m u i r 和b l o d g e t t 报道将兼具亲水性头和疏水性尾的两亲性分子铺展 在水面上，经逐渐压缩其水面上的占有面积，可形成单分子层膜( l b 膜) ，并 可将此单层膜成功地转移到固体基片上制备多层膜【2 4 】。为了克服l b 膜的稳定性 差、尺寸限制和制备需要昂贵的仪器等缺点，s a g i v 等人发展了利用化学吸附方 法制备多层膜的技术【2 5 1 ，首先将表面活性剂分子的一端固定到衬底表面，再将 分子另一端的双键转变为羟基，接着利用化学吸附下一层表面活性剂，从而得 到双层自组装膜。重复这一过程，可以制备多层自组装膜。进行多层自组装， 关键是要在单层自组装膜表面连接上活性基团，使薄膜能够进行下一轮组装。 化学吸附和配位作用制备多层膜受限于特殊的聚合物比如只适合于含有硅氧 烷，磷酸基团或酸基的烷基长链分子，并且制备完善的多层膜比较困难。1 9 9 1 年d e c h e r 发展了一种利用阴阳离子静电作用制备多层膜的方法】。首次对聚阴 离子、聚阳离子电解质以交替吸附的方式实现了聚阴离子一聚阳离子类多层有 机复合膜的自组装。静电层层自组装累积膜技术( e s a ) 是利用静电吸引力对带电 荷的生物大分子，以静电相互作用力作为推动力进行分子间的交替沉积。其次 影响力是氢键、范德法力等。自从1 9 9 1 年d e c h e r 等提出这种方法后，e s a 被 广泛应用于大多数水溶性的蛋白质与带相反电荷聚电解质的交替沉积。a n z a i 等 【27 】通过静电自组装沉积法将抗生物素蛋白质和聚阴离子聚苯乙烯磺酸钠、聚乙 1 1 第一章引言 烯硫酸盐和葡聚糖硫酸酯交替沉积到石英晶体表面，结果发现沉积的聚电解质 不同，沉积的状态也不同，并且与浓度无关。实验还证明组装后的抗生物素蛋 白分子依旧保留着对生物素的键合作用。h a i b i ns h i 等【2 8 】在p t 电极上交替沉积 胆碱氧化酶与阳离子聚电解质( p e i 、p d d a ) 构建胆碱传感器，使用石英晶体微天 平监控了酶膜的组装过程；b a o y a nw u 等f 2 9 在p t 电极上层层累积壳聚糖、金纳 米粒子、葡萄糖氧化酶构建葡萄糖生物传感器。静电层层自组装技术的优点： 一是累积膜的厚度可通过调整试验的相关参数j t l l p h ，阴阳离子浓度和带电荷的 强度等控制在纳米级水平上；二是通过对组装膜层数的变化控制自组装膜总的 厚度和酶的组装量；三是酶固定材料可以选择，电极表面的性质可以通过材料 的改变而改变；四是酶可以有多种选择，通过选择不同的固定化材料就能将不 同的酶蛋白固定在电极表面，从而可以用同样的方法制备多种类型的生物传感 器。 1 4 影响固定化酶的因素 酶分子的分子量很大，葡萄糖氧化酶的分子量为1 5 0 1 8 6 k d ，a o d 分子量 为5 9 2k d 。酶具有活性，构象变化复杂，是比较脆弱的物质，在不合适的条件下 很容易发生变性和失活，因此在酶固定化时，首先应考虑避免酶的失活。即使 在最适宜的条件下，酶也会缓慢失活，采用比较强烈的处理( 强酸、高温、剧烈 的试剂) 会使酶立刻失活。 酶固定化后所引起的酶性质的改变，一般认为其原因可能有两种：一是使 酶本身变化；二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。所谓酶本身的变化， 主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化；载体 影响，则主要体现在固定化酶的周围，形成了能对底物产生影响的扩散层，以 及静电的相互作用等引起的。影响固定化酶的因素主要有： 1 4 1温度对酶的影响 温度对酶促反应速度的影响3 0 1 有两个方面：是在一定范围内温度升高时， 反应速度会加快；另一方面，超过这个限度，随着温度的升高会使酶蛋变性甚 至失活。酶固定化后，最适温度比天然酶高，一般因酶而异，大致提高5 1 5 。c 。 1 2 第一章引言 1 4 2 离子浓度对酶的影响 不同浓度的中性盐溶液对酶活性有影响3 1 1 。在盐浓度较低时，酶表现为易 于溶解，产生盐溶现象。盐浓度高到一定程度后，溶解度降低，发生盐析，产 生沉淀。过高或过低盐的浓度都可以破坏酶分子中的离子键，影响酶活。 1 4 3 p h 值对酶的影响 在一定的p h 值3 2 ，3 3 1 下，氨基酸所带正电荷和负电荷相等，净电荷为零， 此时的p h 值称为氨基酸的等电点。由于氨基酸具有两性解离，其带电情况就取 决于环境的p h 值。当氨基酸处于等电点时，由于所带正负电荷相等，在外加电 场中就不会发生移动；介质的p h 值小于氨基酸的等电点，氨基酸带正电荷；介 质的p h 值大于氨基酸的等电点，氨基酸带负电荷；酶的失活速度在大多数情况 下决定于溶液p h 值。大多数酶在室温下p h 值4 5 以下或8 1 0 以上的溶液中失 活。 1 4 4 有机溶剂对酶的影响 在溶液中加入与水互溶的有机物，可通过改变溶剂的介电常数 3 4 1 ，使酶分 子间的静电引力改变而发生沉淀，一些有机溶剂易使酶造成不可逆的活性损失， 以至引起完全变性。 总之，酶经过固定后，稳定性都有所增加，稳定性的提高包括对各种试剂 的稳定性、对蛋白酶的稳定性、热稳定性的贮存及操作稳定性等。 1 5 葡萄糖电化学生物传感器的发展历程 葡萄糖电化学生物传感器的发展历程：根据酶与电极间电子传递的机理大 致可将葡萄糖电化学生物传感器分为三代。 1 5 1 第一代葡萄糖电化学生物传感 基于溶解氧为电子媒介体的电催化过程：其原理是葡萄糖氧化酶催化氧化 p d 葡萄糖产生葡萄糖酸内酯和过氧化氢3 5 1 ，即酶使葡萄糖发生氧化反应，f a d 1 3 第一章引言 还原成f a d h 2 ，然后还原型辅酶f a d h 2 被分子氧氧化，并产生过氧化氢，产生 的葡萄糖酸内酯进一步在水媒介中水解为葡萄糖酸( 如下列反应式) ： p d g l u c o s e + g o d ( f a d ) g l u c o s e 一6 - 1a c t o n e + g o d ( f a d h 2 ) ( 1 6 ) g o d ( f a d h 2 ) + 0 2 叶g o d ( f a d ) +