（分析化学专业论文）桥连β环糊精主体分子用于生物活性分子的研究与分析应用.pdfVIP

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 、 学位论文作者签名： 扣1 暑 导师签字： 学位论文版权使用授权书 、劾t 刁 j 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞匝可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文 在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：妙1 牙 导师签字： t 签字日期：2 0 0 8 年r 月牙日签字日期：2 0 0 8 年，月穆日 走 拟 ，、， 山东师范大学硕士学位论文 摘要 环糊精具有疏水的空腔和亲水的表面，可以在水溶液中选择性结合各种具 有适当极性和尺寸的有机、无机以及生物分子形成主客体或超分子配合物。这 种特性使其在分析分离、医药、模拟酶等许多领域得到广泛应用。天然环糊精与 模型底物分子的配位作用一般相对较弱，即使在其边臂上引入某种功能基的简单 修饰也很难显著提高其分子键合能力，这在很大程度上限制了环糊精在模拟酶和 识别底物等方面的应用。但如果将两个环糊精单元通过适当的基团连接起来，可 以得到具有双重疏水结合作用和多重识别功能的桥连双环糊精，由于结合位点的 增加，以及可以通过调节连接基团以达到适宜的几何匹配，两个相邻的环糊精空 腔可协同参与对形状和尺寸适合的客体分子进行包结，扩展分子键合能力，给出 更高的配位稳定常数，这种特性使其有可能在酶底物和抗原抗体强键合相互作 用模拟研究中得到重要应用。因此，基于桥连双环糊精的分子识别研究已成为当 今环糊精化学的研究热点之一。 基于桥连b 环糊精独特的结构和特性，本论文主要开展了两大方面的研究： ( 一) 设计合成了一种新型的金属桥连p 一环糊精，并通过1 印心佩、取、元素 分析及氧化还原滴定等予以表征。金属桥连b 环糊精由于受二价铜离子的顺磁性 及螯合作用的影响，与没有络合铜离子的主体桥连p 一环糊精相比，荧光强度减弱。 而谷胱甘肽也可以与铜离子产生络合作用，这种竞争络合作用会导致荧光恢复， 且荧光强度随谷胱甘肽浓度变化而发生变化。基于此，建立了一种快速、简便的 用于检测谷胱甘肽的荧光光度法。分析实验是在室温下，p h 6 0 0 的p b s 缓冲溶 液中进行的，线性范围为0 3 0 2 0 0 岬o ll ，检出限为6 3 8 衄0 1l 1 。血浆中 主要成分对测定不产生干扰，应用本法测定人血浆样品中谷胱甘肽的含量，结果 令人满意。 ( 二) 基于f r e t 原理，构建荧光探针：亲和素修饰纳米金一咪唑酮桥连p 环糊精一荧光素超分子主体化合物识别生物素。亲和素与生物素存在特异性结合， 其结合部位是生物素上的咪唑酮环，因此本文设计合成了一种咪唑酮桥连的b 一 环糊精，通过桥连p 一环糊精桥基上的咪唑酮环与亲和素特异性结合，可以将 b i s ( p c d s ) 连接到亲和素修饰纳米金上。而b i s ( p c d s ) 通过两个相邻空腔的协同作 用，大大增强了对荧光素的包结能力，使其靠近纳米金，f r e t 现象发生，荧光 山东师范大学硕士学位论文 素的荧光猝灭：竞争性的客体分子生物素存在时，挤占桥连8 c d s 桥基上的眯唑 酮结合位点，桥连d 环糊精连同包结的荧光素远离纳米金，f i 迮t 难以发生， 荧光素的荧光随之得到恢复。基于此，建立了一种高灵敏度、高选择性的用于生 物素检测的荧光分析方法。分析实验是在室温下，p h7 6 的t r i s h c l 缓冲溶液中 进行的，线性范围为0 8 0 2 0 0 斗幽= i l l ，检出限为5 7 0n g n 儿。该探针将应用于 血浆样中生物素含量的测定，为发展一种新的血液中生物素含量的检测方法提供 实验依据。与传统的生物素的检测方法相比，预计该方法具备荧光光谱法灵敏度 高、选择性好、用样量少、方法简便等优点。 关键词：桥连p 一环糊精，荧光探针，纳米金，谷胱甘肽，生物素 2 a b s t r a c t c y c l o d e x t r i n s ( c d s ) a r eac 1 弱so fc y c l i co l i 9 0 s a c c h 撕d e sw 油s i xt 0 e i 曲t d 。百u c o s eu 1 1 i t sl i i l l ( e db ya 一1 ，4 一斟u c o s eb o n d s m y p o s s e s sah y 出0 p l l i l i ce x t 丽0 r 跹dah y d r o p h o b i c c a v i t yc a p a b l eo f 硫l u 幽gav 丽e t yo f 证o r g 痂c 硒r g a l l i c h y d r o p h o b i cc o n l p o 衄d sw h i c hp o s s e s ss u i t a b l ep o l a r i t ya n dd i m e l l s i o n 访ah o s t g u e s t c o i i l p l e x a t i o n c d sa r ee x t e n s i v e l ys t u d i e da si l o t o n l ye x c e l l e mr e c e p t o r sf o r m o l e c u l a rr e c o g 血t i o nb u ta l s o 缸l c t i o n a lb u i l d i l l gb l o c l 【s t 0c o i l s t r u c tm o l e c u l a r d e c e s a m o n gv a d o u s 劬c t i o n a lc d s ，b r i d g e db i s c d s ，、h i c hc o n l p r i s e st w oc d s c 删t i e s1 i i l k e d b ya 劬c t i o n a l 嘶d g e ，i s a 笋e a t l yp r o m i s i i l gc a n d i d a t e h 1c o m p 耐s o n 、7 l r i t l ln a t i v ec d sa n dn 1 ) n o m o d i f i e dc d s ，b r i d g e db i s c d se x h i b i ts i g n i 丘c a n tl l i g h b i i l d i l 培a b i h t ya n dm 0 1 e c u l a rr e c o g i l i t i o n 也r o u g h l ec o o p e r a t i v eb 砌i 】1 9o ft w o 砌a c 钮tc d s 疵t s m o r e o v e r ，也el i l l l ( e rc a i ls u p p l yaw e l l o r g 砸z e dp s e u d o c a v i t ) ， 廿l a tmt l l m sp r o 访d e s 缸l d i t i o n a lb i l l d i n g i l l t e r a c t i o 璐、析也a c c o m m o d a t e dg u 髓t m o l e c u l e s b a s e do n 虹1 e 血r a m o l e c u l a rc o o p e r a t i v e b 越i 芏1 9a 芏l d 瑚l u l t i p l er e c o g m t i o no f 研d g e db i s ( p c d s ) 谢t hf h i l c t i o n a ll 址e r si i l s o l u t i o i l ，勰w e n 勰t h e i r 嘶q u e p r o p e n i e sa n d 丽d ea p p l i c a t i o 璐，w eh a v ec a 硝e do u tt 、7 l ，oa s p e c t so fi n v e s t i g a t i o n ： f i r s t ，an 0 v e lm c 伽l o 晡d g e db i s ( p - c d s ) w 勰s y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db v m e 锄o f1 h 风re l 锄e n t a n a l y s i sa 1 1 dr e d o xi o d 咖e t r i ct i 订a t i o n t l l e n u o r e s c e n c eo fm e t a l l o b r i d g e db i s ( p c d s ) w 舔、e a kc o m p a r e d 州也b i s ( b c d s ) 恤c hh a dn o tf 0 m e dc o n l p l c xw 油c o p p e r ( 田b e c a u s eo f l ep a r 锄a g n c 缸s mo f c o p p c r ( i di o n s g 1 u ta _ t 1 1 i o n ec o u l df o 册c o m p l e x 鼯w i mc o p p e r ( i dd 甜v e d 丘d mt h e m e t a l l o b r i 以e d b i s ( b c d s ) 砸sc o m p e t i t i v ec o m p l e x a t i o nw i mc o p p e r c 趾1 e a d t oa s l g m 矗c 觚tn u o r e s c e n c er e c o v qo ft 1 1 eb i s ( p - c d s ) 1 h 盯e f o r e ，am p i d 孤d s i m p l e 印e c 仃0 f l u 0 血i l e t r i cm e t l l o dw a sd e v e l o p e df o rt 1 1 ed e t e n l l i n a t i o no fg l ma _ 蛳o n e t l l ea n a _ 1 ) 嚏i c a l 印p l i c a t i o nf - o rg l u t a t h i o n ew a si n v e s t i g a t e di np b sb u 丘e rs o l u t i o no f p h6 0 0a tr o o mt e m p e r a t u r e t h el i l l e a rr a n g eo ft 1 1 em e t l l o dw 舔o 3 0 2 0 0 啪o l l 1w i t hm cd e t e c t i o n1 i m i to f6 3 8 衄0 1l 1 t h e r ew a sn 0i n t e r f e r e n c e 舶mt h e p l a s m ac o n s t i t u e m s t h ep r o p o s e dm e m o dh a db e e ns u c c e s s 如l l y a p p l i e dt ot h e d e t e m l i n a t i o no fg l u t a t l l i o n ei 1 1h u m a i lp 1 2 l s m a s e c o n d ，a v i d i nm o d i f i e d9 0 1 dn a n o p a r t i c l e s ( a g n p s ) 一b i s ( p c d s ) n u o r e s c e i n h a sb e e nd e s i g n e da sas e l e c t i v en u o r e s c e n t p r o b ef o rd e t e c t i n gb i o t 访c o n t e n t 山东师范大学硕士学位论文 u t i l i z 血gf r e t h l c i u s i o no ff l u o r e s c e i ni n t 0b i s ( p c d s ) m a l 【e s 矸逻to c c u rt h r o u 曲 d o n o r 肌dq u e l l c h e rn e a r b y f r e ts w i t c h e so f j fb yt l l ea d d i t i o no ft l l ec o i n p e t i t i v e b i o 血w m c ha 娲r d sl l i 业b i n d i n ga b i l i t yw i t ha v i d i n t h sc o m p e t i t i v eb i n d i n g r e s t o r e st h en u o r e s c 吼c eo ft h eq u e n c h e dn u o r e s c e i n t m sp h e n o m e n o ns u g g e s t sm a t t h ea g n p s - b i s ( p - c d s ) 一f li se f f e c t i v e 弱an u o r e s c e n tp r o b ef o rb i o t i i lr e c o g i l i t i o n t h e 锄a l 如c a l 印p l i c a t i o nf o rb i o t i nw 蠲i 】w e s t i g a t e di i lt r i s h c lb u 妇艮i rs o l u t i o no f p h7 6a tr o o mt e m p 耐u r e t l l el i n e a rm g eo f m em 础o dw 筋o 8 0 2 0 0p 咖l 谢mm ed e t e c t i o nl i r l l i to f5 7 on g m l k e y w o r d s ：b r i d g e db i s ( p - c d s ) ，f 1 u o r e s c e n tp r o b e ，( 沁l dn a n o p a r t i c l e s ( q 岬s ) ， 4 g 1 u t a t l l i o n e ，b i o t i l i 山东师范大学硕士学位论文 第一章桥连p 一环糊精研究概述 环糊精( c y c l o d e x t r i n s ，c d s ) ，又名s c h a r d i n g e r 糊精，由v i l l i e r s 于1 8 9 1 年发现， 但有关其制备与分离的详细过程是由s c h 砌i n g e r l 9 0 3 年首次报道，它们是由环糊 精葡萄糖基转移酶( c g t ) 作用与淀粉所产生的一组以a 一1 ，4 糖苷键结合的环状低 聚葡萄糖【卜3 1 。常见的环糊精有0 【c d s 、p c d s 和丫c d s ，其内腔疏水而外腔亲水， 可与许多有机或无机分子形成包合物【4 5 】。研究结果表明，多种弱相互作用的协 同作用，对于环糊精的分子识别过程、主客体间的尺寸匹配、几何互补等因素 对主客体间的稳定性有重要的贡献。多种实验方法如核磁共振【每8 1 、x 射线粉末 衍射【9 l0 1 、红外光谱【1 、紫外可见光谱盼1 4 1 、荧光光谱【1 5 - 1 7 1 、圆二色谱【1 8 ，1 9 1 、 电化学方法【2 3 1 、热分析方法【2 4 1 、毛细管电泳法【2 5 1 、各种色谱分析方法【2 6 ，2 7 】以 及理论计算方法 2 8 】等被用于环糊精的超分子作用机理和分子识别机理的研究。 天然环糊精与客体分子的作用一般相对较弱，而在其臂上引入功能基的简单 修饰也很难在分子键合能力上达到显著提高，而环糊精单元通过特定链连接之 后，两个相邻的环糊精空腔有可能协同参与对形状和尺寸适合的客体分子的包合 配位作用，从而扩展分子键合能力1 2 9 】，给出最高的超分子配合物结合常数可达 融 1 0 1 1 l m o r l 。这种特性使其有可能在酶底物和抗原抗体强键合相互作用模拟 酶研究中得到重要应用。刘育的研究指出，桥连双环糊精的协同配位还可以改变 客体分子的荧光性质。如天然的p 环糊精对罗丹明b 有猝灭作用，而联毗啶桥连p 一 环糊精d i m e r 则对罗丹明b 客体分子的荧光有增强作用，这可能归因于两个环糊 精单元的协同配位作用，固定了客体的构型，从而提高了客体分子的荧光量子产 率【3 0 1 。 近几年来，桥连环糊精因其独特的结构和特性，在很多领域得到了广泛的研 究与应用。本概述就近年来环糊精及其衍生物尤其桥连环糊精在生物体中的作 用，模拟酶和分子识别等方面来阐述环糊精超分子化学研究进展，以期推动这一 领域的发展。 1 、环糊精及其衍生物的模拟酶研究： 酶的高效催化性能是通过与底物形成包合物而获得。与冠醚相比，环糊精的 结构、性能和酶所具有的微环境更为相似。因此，环糊精作为酶模型早被广泛研 山东师范大学硕士学位论文 究f 3 ，3 引。近年来硒化物桥连d 环糊精( s c h 锄e1 a ) 已用于模拟谷胱甘肽过氧化 酶【3 3 ，3 4 1 。它能消除体内自由基，防止脂质过氧化，对治疗和预防克山病、心血管 病及癌症等有明显的效果。m i c h a e lm c n a u g h t o n 等合成了有机碲化物桥连的环糊 精( s c l l 锄e1 b ) 【3 5 1 ，可模拟谷胱甘肽过氧化酶，亦可作为硫氧还原蛋白还原酶及 癌细胞增生的抑制剂；m a oz o n g w a n 用咪唑桥连双铜核( s c h e m e1 c ) 模拟超氧化 物歧化酶( s o d ) 【3 6 】，b c d s 用胍基修饰，可模拟灯g 1 4 3 。 3 。- 船h ：托 s c h e m e1 硼1 es 仃u c t u f e so f b i s 诏一c d s ) f o r 印2 y 坞m o d e l 2 、在催化方面的研究： b r e s l o w 等合成了联吡啶桥连的d c d s ( s c h 锄e2 a ) ( 3 7 ，3 羽，与c u 2 + 配位后，可 催化酯的水解；y 觚j i a m i n g 用e d t a 桥连p c d s ( s c h e m e2 b ) 【3 9 】，与c e 。合， 用于催化磷酸二酯的水解。 莎s 鬟s 曰 & ，啊一甜 萎。州节 - b 、：， v s c h e m e2t h es 仃u c t u r e so fb i s ( p c d s ) f o rc a t a i y s i s i 3 、在分子感应元件方面的研究： u e n o 等4 0 ，4 u 设计了一种新型的a 螺旋多肽，在其上分别拥有y 环糊精单元 6 山东师范大学硕士学位论文 豆素和芘放在b c d s 的同一侧，同过p e t 机理来感应客体分子( s c h e m e3 b ) m 3 1 。 皴旦瞧 耻垒敷 狂h non氇lm o f f b s c h e m e31 1 1 es 仃u c t 盯e so f b i s ( p c d s ) f o rb i o s e i l s 叮 4 、桥连环糊精在分析应用方面的研究： 刘育在该领域做了大量的研究( s c h e m e4 ) 。他们合成了一系列的桥连环糊精 及其金属配合物，用于对类固醇的包结，通过圆二色谱、同r o e s y 研究了桥连 环糊精的原始构象；通过2 d 舳研究了类固醇与b i s ( p c d s ) 包合物的结构【“舶】。 对低聚肽的研究，早期，b r e s l o w 做了大量的工作。他研究了桥连环糊精对一系 列小肽的包合作用【4 7 1 ，后来，又发现b i s ( p c d s ) 可以诱导具有氨基酸疏水残基的 小肽发生螺旋折叠【4 8 】。近几年，刘育也在该领域做了一系列的研究，研究了桥连 环糊精及其金属配合物对蛋白质水解肽( 二肽、三肽) 的包合作用，从尺寸一形状匹 配、多位点识别、氢键及疏水作用等方面分析了包结机理【4 9 5 1 1 。另外，刘育还研 究了桥连环糊精对a n s 、t n s 、m e t h y lo r a l l g e 、m o r d a n to r a l l g e l 、i u 1 b 、a r 、 7 山东师范大学硕士学位论文 b 打l i a l l tg r e e i l 、p y r o n i n ey 等染料的包结作用从尺寸- 形状匹配、诱导契合效应、 多位点识别等方面分析包合机理【5 2 铆】。 嘲“ 妒吃矿i 广取褥一一龟瀑茹t 裕一 n - 1 1 ：n 吆2 3 n_012w 靠绺绷：三一p 嘴 -帏1 i 蛐 j 1 ：脚r 争煳 一盖，。 一一h 一二妒- t 0 工二 笛 计譬哟w 瓣蝴。触 心i 协”伯臌舢 赢赫 _ ：童- 芏一盘一z 埘：戈一专。 蝴- - p 曩：d 辨- 一_ t 啊 一一 眦筏哪，盈憾辘n 吣甜 鹞。f 3 一。扩r 矿卜煳巾一叫产一刮弦江一 神 棚 一 根q 舢 一张一j 。一呻w 蒜确黥叶a 一一磊 蚪对朝卜- 翻卜棚膏 _ 厂k 警一一。移基一 4 目嘲 孢脚_ + o 一：= 0 制瑚_ 脚亭忡 囊 7 ， 鬈搿一产营、。国潞篇 萨t 一 髫 穗 1 晰b 苎矽煳 u 苷， 和哟 缃 一晶擎，一+ _ ”气孑嘲函嗍 s c h e m e4t h es 仇l c t u r e so f b i sq c d s ) 蚕) rc o m p l e xw i t i lo l i g o p 印丘d e s ，s t e r o i d sa n dd y 器 5 、环糊精在超分子纳米方面的研究： 纳米网络可应用于高集成度的电子元件，其中的空腔可以承载酶和药物等， 应用于酶催化反应和药物控制释放等领域。为满足应用要求，纳米网络需在水相 中稳定存在。目前构筑纳米粒子网络结构包括静电吸引、氢键、互补d n a 链桥 连和双硫醇分子桥连等方法。然而，氢键构筑的纳米网格在高p h 值和高盐度是 q 鑫贸 吖 严 f 一 山东师范大学硕士学位沦文 会聚沉；双硫醇分子桥连的纳米粒子网格无法水溶。李迪等利用环糊精和1 ，8 辛二硫醇构筑了稳定的水溶性的金纳米网格( s c h 锄e5 a ) 【5 8 1 ，可用于催化、纳 米电子元件、传感器、分子识别、生物标记以及药物释放等领域。刘育用l t r y 修饰的p c d s 与聚丙二醇构筑了金纳米颗粒，形成了一种聚假轮烷，可捕获c 6 0 ， 增加c 6 0 在水中的溶解度，可裂解d n a 链( s c h e m e5 b ) 【5 9 】。最近，m a j i a l l b i a 0 分别 研究了单取代的p c d s 以及桥连的p c d s 与牛血清蛋白的相互作用【矧，并在此基 础上用聚乳酸修饰( 二) 乙二胺桥连的环糊精，制成纳米颗粒，用作蛋白质的运输 体系【6 1 1 。 b s c h e m e51 k l l s a g eo fp - c d s w i t l li 姗0 p a n i c l e s 鉴于环糊精奇特的理化性质和优良的生物学特性，有关环糊精的修饰、包合、 配位、聚合和应用研究仍然是人们非常感兴趣的课题。特别值得提出的是设计合 成桥连环糊精，协调利用其多重疏水结合和识别能力，作为酶模型以及自组装与 分子识别的主体分子将有着不可估量的发展前景。 参考文献： 【1 】陈乐怡，合成匆名缎塑擞1 9 9 0 ，2 ，4 5 【2 】方世壁；江英彦，勃于遁撼1 9 8 8 ，1 ，5 5 【3 梁受天，石功石丘互1 9 8 7 ，1 6 ，9 9 4 s z e j t l i ，j ，t r a j l s l a t e db yn o 冒a d im a i l dh o n ，a t l lk c 如，d 比町砌坫口7 z d 历p 护 加c 也j f d 甩c d ，印厶髓e d a k a d e m i 嵇a d o ，b u d 叩e s t ，19 8 2 ，10 4 5 b e n d e r ，m l ；k 0 m j y 锄，m a ， 咖如盯力，z 伽国硎衙，e d s p 咖g e r2 v e r l a y ，b e r l i nh e i 2 d e l b e 唱，n e wy o r k ，1 9 7 8 6 王维贤；石庭森；高立军；张涛，c 矗伽 b 口r m z ，1 9 9 4 ，2 9 ，2 7 4 9 山东师范大学硕士学位论文 7 鲁润华；汪汉卿，纪学纡窑与蝴：】9 9 9 ，ll ，17 【8 】范小毅；韩高义；陈世荣；杨频，无视纪学掘2 0 0 l ，1 7 ，18 8 9 】侯曙光；王培玉，c 焉觑场口厂珑z ，1 9 9 4 ，2 9 ，2 7 9 1 0 】鲁晓凤；许芳萍；夏震；曾钟智；谢明贵，四大学期自熬蔼蝴，1 9 9 5 ，3 2 ， 6 9 4 1 1 】何坚刚；方惠群，元祝纪学期1 9 9 9 ，1 5 ，2 3 0 。 1 2 m u n o z ，b s ；l e m e r ，d a ；c a s t i l l o ，b ；m a r t i n ，m 。a ，么刀口6 仗，1 9 9 6 ，1 2 l ， 1 5 5 7 1 3 刘育；历斌；张毅民；卜显和；李玉梅；陈荣悌，剥透提1 9 9 5 ，4 0 ，1 8 5 8 1 4 】尤长城；赵彦利；刘育，房等学狡化学羰2 0 0 1 ，2 2 ，2 18 1 5 h 跚a i ，s b ，a 绷肠c 扫冠，1 9 8 2 ，5 7 5 ，2 7 2 1 【1 6 】江云宝等，纪学逦掇1 9 9 0 ，9 ，4 6 【1 7 k u w a b 锄，t 。；n a l ( 巧i n l 砧h ；n a l l a s a w a ，m 。；u e n o ，a ，勘口正国绷，1 9 9 9 ，7 1 ， 2 8 4 4 ， 1 8 l e g r a n d ，m ；r o u 百e r ，m j ，陈荣峰译度光者移圆二彦娥开封：河南大学 出版社，1 9 9 0 1 9 k o d a k a ，m ，zp 7 咖c 镌p 所彳，1 9 9 8 ，1 0 2 ，8 1 0 1 2 0 】常雁；张勇；樊慧芝；潘景浩，分析化学新近昆太原：山西科学技术出版社， 1 9 9 7 【2 1 李向军；连军；张勇；潘景浩，詹化学1 9 9 9 ，5 ，3 4 8 【2 2 g u ，j ；p a n ，j h ，2 乞肠以幻，1 9 9 9 ，5 0 ，3 5 2 3 】韩树波；朱敏；袁卓斌，分矽剜学学缀19 9 9 ，2 0 ，10 3 6 2 4 朱晓峰；许旭；林炳承，蔚鲁学夜仫学学棍1 9 9 8 ，1 9 ，1 5 0 4 2 5 s h i ，x y ；f a l lr f ；z h a i l g ，y q ；g u ，j l ；f u ，r n ，c 忍砌c 7 l p m 上e “，2 0 0 0 ， 1 1 ，6 9 2 6 】何坚刚；方惠群，无视纪学学掘1 9 9 0 ，1 5 ，2 3 0 2 7 s h u a i l g ，s m ；c h o i ，m f ，国厂d m 以f d 矿彳，2 0 0 1 ，9 1 9 ，3 2 1 2 8 m e l a n i a ，o ；a u r a ，t ；d 孤i e l a ，g ；o v i d i u ，m ；m i h a e l a ，h ，z 尸矗声国p ，1 b ， 2 0 0 2 ，1 0 6 ，2 5 7 2 9 】刘育；尤长城，蔚等学夜诒学粼2 0 0 1 ，2 2 ，5 9 1 3 0 l i u ，y ；y o u ，c c ；l i ，b ，d 弘胛f c 三p f f p ，芍，2 0 0 1 ，3 ，1 6 5 7 3 1 】u e n o ，a ；k i k a n ，k ，。s 匆酣j “，1 9 9 7 ，3 1 ，4 4 1 0 山东师范大学硕士学位论文 【3 2 z h a n g ，b l ；b r e s l o w ，r ，彳朋劬绷肋c ，1 9 9 7 ，1 1 9 ，4 5 3 5 【3 3 】刘俊秋；宁云刚；师成波等，府等学狡纪学与匈昆1 9 9 8 ，1 9 ，1 4 4 6 3 4 s u n ，y ；【u ，y ；m 码s m ；g o n g ，p s ；y 抽，gl ；l i u ，j q ；s h e 玛j c ；l u o ， g m ，b f o c f m f 伽豇b f 印矗) ，出口彳c 细，2 0 0 5 ，17 4 3 ，19 9 3 5 】m i c h a e l ，m ；l a r s ，e ；a 彻e ，b ；g a r t h ，p ；i a n ，a c ，z 五鼠凸g m ，2 0 0 4 ，4 7 ， 2 3 3 。 【3 6 f u ，h ；z h o u ，yh ；c h e l l ，w l ；d e q i i l g ，z g ；t 0 n g ，m l ；j i ，l n ；m a 0 ，z w ，z 彳扰国绷勋c ，2 0 0 6 ，1 2 8 ，4 9 2 4 3 7 】b r e s l 0 、，r ；z h a n g ，b ，z 么历c 办p m - c ，1 9 9 2 ，1 1 4 ( 1 4 ) ，5 8 8 2 3 8 】b r e s l o w ，r ；b e l v e d e r e ，s ；g 盯s h e l l ，l ；l e u n g ，d ，尸“地仰正国硎，2 0 0 0 ，7 2 ， 3 3 3 【3 9 y 抽，j m ；a t s u i i l i ，m ；y u a l l ，d q ；f 哂慨k ，胁z w 巧c 口f m f 伽彳咖，2 0 0 2 ， 8 5 ，1 4 9 6 4 0 h o s s a 缸m a ；h 锄嬲a k i ，k ；m m a 飓h ；u e n o ，a ，c 兹册1 工e 纪，2 0 0 0 ，2 9 ，2 5 2 【4 1 】m a t s l l m l 】r a ，s ；s a k a m o t 0 ，s ；u e n o ，a ；m i h a r 毛h ，c 7 l p 坍上轧rz ，2 0 0 0 ，6 ， 1 7 8 1 【4 2 】h o s s a 虹m a ；h 锄邪a 虹，k ；t a k a h a s l l i ，k ；m m a r a h ；u e n o ，a ，z 么珑 c 绷勋c ，2 0 0 1 ，1 2 3 ，7 4 3 5 4 3 h o s s a i n ，m a ；m i h a m ，h ；u 肌o ，a ，z 么肌c 兹硎c 2 0 0 3 ，1 2 5 ，l1 17 8 4 4 l i u ，y ；s o n g ，y ；w a i l g ，h ；盈a 1 1 9 ，h y ；w a 电t ；1 1 1 0 u e ，y ，za i r g 劬绷， 2 0 0 3 ，6 8 ，3 6 8 7 4 5 l i uy ；s o n g ，y ；c h e n ，y ；l i ，x q ；d i i l g ，f ；z h o n g ，r q ，凸绷眈rz ， 2 0 0 4 ，1 0 ，3 6 8 5 4 6 l i u ，y ；y q n g ，y w ；y a n g ，e c ；g u a 玛x d ，zd 僵c 兹g m ，2 0 0 4 ，6 9 ，6 5 9 0 4 7 】b r e s l o w ，r ；y a l l g ，z ；c l l i n g ，r ；t r o j 觚d t ，g ；o d o b e l ，f ，z4 掰国绷勋d ， 1 9 9 8 ，1 2 0 ，3 5 36 4 8 】w i l s o n ，d ；p e r l s o n ，l ；b r e s l o w ，r ，b f o d 停朋配凸绷，2 0 0 3 ，1 1 ，2 6 4 9 4 9 l i u ，y ；c h e l l ，g s ；c h c n ，y ；d i n g ，f ；l i u ，t ；z h a 0 ，y l ，曰幻c d ，扩m 吕c a 绷， 2 0 0 4 ，1 5 ，3 0 0 5 0 l i u ，y ；z l l a 0 ，y l ；c h e n ，y ；d i n g ，f ；c h e n ，g s ，b f d c d 形孵国p m ，2 0 0 4 ， 1 5 ，1 2 3 6 5 1 l i u ，y ；y a n g ，y w ；c h e l l ，y ；d i n g ，f ，b f d d 停施d 国e m ，2 0 0 5 ，1 3 ，9 6 3 5 2 l i u ，y ；y o u ，c c ；c h e n ，y ；w a d a ，t ；i i l o u e ，y ，zd 强国绷，1 9 9 9 ，6 4 ， 山东师范大学硕士学位论文 7 7 8 1 【5 3 】l i u ，y ；c h e n ，y ；l i u ，s x ；g u a i l ，x d ；w a d a ，t ；i n o u e ，y ，d 曙伽以上p f 绍瑙， 2 0 0 1 ，3 ，1 6 5 7 5 4 】l i u ，y ；“，b ；y o u ，c c ；w a d a t ；h l o u e ，y ，zd 停c 办p m ，2 0 0 1 ，6 6 ，2 2 5 5 5 l i u ，y ，；s o n y ，；c h 胁，y ；y a n g ，z x ；d i n g ，f ，z 励声凸绷b ，2 0 0 5 ，10 9 ， 1 0 7 1 7 【5 6 】s o n g ，y ；c h e i l ，y ；l i u ，y ，如“加口，矿砌d f d c g 聊话砂口刀dm d 幻6 勿魄y4 j c 兹p 珑括缈，2 0 0 5 ，1 7 3 ，3 2 8 【5 7 】l i u ，y ；y a n g ，y w ；“，l ；c h e n ，y ，d 嘻曰面掰以函删，2 0 0 4 ，2 ，1 5 4 2 5 8 】李迪；黄云杰；孙春燕；王美佳；李军；李景虹，高等铭学学撼2 0 0 5 ，6 ，6 51 5 9 】l 沁y ；w a i l h ；c h e i l ，y ；k e ，c f ；l i u ，m ，z4 所国啪勋c ，2 0 0 5 ，1 2 7 ， 6 5 7 6 0 】g a 0 ，h ；w a n g ，y n ；f 姐，y g ；m a ，j b ，b 如d 侈拖d 国绷，2 0 0 6 ，1 4 ，1 3 1 6 1 】鼢，h ；l g y w ；f a n ，y g ；m a ，j b ，乃册口z 矿c 锄抛腑眦硪， 2 0 0 6 ，1 1 2 ，3 0 1 1 2 山东师范大学硕士学位论文 第二章用于血浆中谷胱甘肽检测的新型金属桥连p 一环糊精荧光 探针的研制及分析应用 摘要：本文合成了一种新型的金属桥连d 环糊精2 ，并通过1 m 心偶、瓜、元素 分析及氧化还原滴定等手段予以表征。金属桥连d 环糊精2 由于受二价铜离子的 顺磁性影响，与没有络合铜离子的主体桥连d 环糊精1 相比，荧光强度减弱。而 谷胱甘肽也可以与铜离子发生络合作用，这种竞争络合作用会导致荧光恢复，且 荧光强度随谷胱甘肽浓度发生变化。基于此，建立了一种快速、简便的用于检测 谷胱甘肽的荧光光度法。分析实验是在室温下，p h6 o o 的p b s 缓冲溶液中进行 的，线性范围为o 3 0 2 0 0 岬o ll 一，检出限为6 3 8 舳o ll 1 。血浆中主要成分 对测定不产生干扰，应用本法测定血浆样品中谷胱甘肽的含量，结果令人满意。 关键词：金属桥连p 一环糊精，谷胱甘肽，分子识别，荧光光度法 引言 谷胱甘肽( 酉u t a 衄0 n e ) 是由h 0 p k i i l j s 发现并命名，1 9 2 9 年h o p l 【i l l s 及k e n d a l l 等各自独立发现其为含有甘氨酸的三肽。谷胱甘肽化学名为：n ( n l r - g l u t 锄y l l c y s t e i 】血y 1 ) g l y c i i l e ，即n 科一l r - 谷氨酰一l 半胱氨酰) 甘氨酸。谷胱甘肽分子量 为3 0 7 3 3 ，熔点1 8 9 1 9 3 0 c ( 分解) ，晶体是无色透明细长柱状( 板状) ，等电点( p d 为5 9 3 ，成品见光易分解，易氧化，谷胱甘肽分子中有一特殊的6 肽键，即由谷 氨酸的6 c o o h 与半胱氨酸的a n h ：缩合而成，这样的肽键与蛋白质分子中的 一个氨基酸中q c o o h 和另一个氨基酸中a - n h 2 失水缩合而成的肽键显然不同。 由于谷胱甘肽中含有一个活泼的巯基极易被氧化，2 分子还原型谷胱甘肽( 简称 g s h ) ，脱氢以二硫键s s ) 相连便成为氧化型的谷胱甘肽( 简称g s s g ) ，所以谷 胱甘肽可分为氧化型和还原型两大类，在生物体中起重要功能作用的是还原型谷 胱甘肽。 谷胱甘肽广泛分布于自然界的生物体中，主要存在于酵母、动物肝脏、肌肉、 血液中，许多植物，如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类及细菌中也含有一定量的 谷胱甘肽。在动物细胞中还原型谷胱甘肽水平达5 i m o ll ，而氧化型仅为 山东师范大学硕士学位论文 0 1 唧o ll 1 ，细胞内高水平的g s h 对动物机体维持正常机能是十分重要的。据 测定，谷胱甘肽在未加工的肉中含量是5 0 2 0 0 m gk 分1 在新鲜水果和蔬菜中的含 量是5 0 1 5 0 m gk 昏1 ，干燥酵母中含有约1 5 的谷胱甘肽，在乳制品、谷物和熟 食品中含量较低。 谷胱甘肽在体内的代谢过程现已基本清楚。进入血液循环的g s h 可被一些 组织直接吸收入细胞，也可被组织细胞膜上的r - 谷氨酰转肽酶( 好t ) 降解为r 谷 氨酰氨基酸( 氨基酸来自细胞外液中的游离氨基酸) 和半胱氨酰甘氨酸，而后被二 肽酶降解为半胱氨酸和甘氨酸或以二肽的形式转运到细胞| 内后再被降解为半胱 氨酸和甘氨酸。大多数哺乳动物的肾、肝脏、小肠、肺组织中有较高的r - g t 和 二肽酶活性，它们是清除循环系统中懿h 的主要器官。在细胞内，g s h 的组成 氨基酸在卜谷氨酰环化转移酶、r - 谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶催化 下生成谷胱甘肽。g s h 的合成通过其自身对r i 谷氨酰半胱氨酸合成酶韵反馈抑 制来调控。肝脏是体内合成g s h 的主要场所。细胞内的谷胱甘肽在谷胱甘肽硫 转移酶( g s t ) 的催化下，可与细胞内外产生的活性亲电子基、有机氢过氧化物( x ) 结合成g s h s 复合物，经一系列反应生成n 乙酰- c y s ( x ) 后运出细胞而排出体 外。g s h 清除细胞内自由基、过氧化物、r 0 0 h 的同时，2 分子的g s h 转变为 g s s g ，g s s g 在谷胱甘肽还原酶( g r ) 作用下n a d p h 供氢还原为g s h 。上述反 应形成r 谷氨酰循环。由于猪肾脏中的r _ g t 与肝脏中的r - g t 活力比较低，因 此对于猪，肝脏和胆管分支在g s h 周转中起重要作用。 谷胱甘肽的生理功能十分广泛【l 捌，其主要功能有：( 1 ) 清除自由基、过氧化 物、重金属及黄益霉毒素等毒物：( 2 ) 参与氨基酸( 谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中 性氨