（外科学专业论文）低氧因素对肾细胞癌中肾上腺髓质素adm表达影响的研究.pdf

目录 i l f f f l l l lr f r ff l ；f f l l r f f f f f j f l l f l f f l l l f r r u y 19 010 16 中文摘要o oooooooo 1 英文摘要3 研究论文低氧因素对肾细胞癌中肾上腺髓质素a d m 的表达 的影响的研究 前言”“”“”“”“一”一”6 月舌”“”“”“”“”一”“”一“”o 材料与方法6 结果o oo ooo ooo ooooeooee 1 3 附i 药”“一一”一”1 4 附表o o o oooooooiodooooo 1 5 讨论一”一“一”一”“”1 7 结论- o o ooooo oooaooooood 1 9 参考文献o o0oooeoeooooooeo0 2 1 综述低氧因素、肾上腺髓质素与肾肿瘤2 3 致谢- “一一”“”一“”3 6 个人简历0 00000006 00 000000 0 3 7 中文摘要 低氧因素对肾细胞癌中肾上腺髓质素a d m 表达 的影响的研究 摘要 目的：在我国，。 子细胞癌是严重威胁人民生命健康的疾病之一，是泌 尿系统肿瘤中最常见的。近年来，a d m 在卵巢癌、肺癌等各种恶性肿瘤 的发生、发展中的作用已日益受到关注，其在肾细胞癌中的作用也已经开 始受到广泛的关注与研究。肾上腺髓质素( a d r e n o m e d u l l i na d m ) 最初是 由日本学者在1 9 9 3 年从人嗜铬细胞瘤中分离出的一种血管舒张肽，由5 2 个氨基酸组成，与降钙素基因相关肽( c a l c i t o n i n - g e n er e l a t e dp e p t i d e ，c g r p ) 间的同源性为2 4 ，具有典型的二硫桥，属于c g r p 家族。目前临床研究表 明a d m 在多种癌症病人中过度表达，且与组织学分级及肿瘤恶性程度呈 正相关，并且与预后不良有关。其在体内可以发挥诸多复杂的生物学效应。 其激活腺苷酰环化酶p k a 信号转导通路，使细胞内c a v 伊水平升高；提 高细胞内c a 2 + 浓度诱导血管舒张并激活内皮细胞的一氧化氮( n o ) 合酶； 激活m a p k 信号转导通路以促进细胞有丝分裂等均可能与肿瘤的发生发 展关系密切。 低氧是固态肿瘤生长所具备的共同特征，低氧刺激肿瘤细胞产生一系 列的反应以促进肿瘤的生长和进展。研究表明低氧可刺激a d m 在组织中 表达，其后又有诸多报道在低氧环境下多种肿瘤细胞中a d m 过度表达。 低氧环境下a d m 过度表达后再发挥其生物学效应在肿瘤的生长进展过程 中起着不可忽视的作用。 本研究以人肾癌细胞为对象，给予相关低氧刺激处理后观测其a d m 的表达水平情况，进一步在肾癌中验证低氧因素对a d m 的影响。目前国 内外对肾细胞癌中a d m 的研究较少，因此本研究为验证并探寻肾癌的可 能发生发展机制及肾癌的临床诊断和合理治疗提供理论依据。 方法： 1 材料：人肾癌细胞株7 8 6 0 ，由北京协和医科大学基础研究所提供购 买。 2 方法：培养肾癌细胞株并分别给予不同条件的低氧环境刺激，采用蛋白 中文摘要 印迹( w e s t e r nb l o t ) 检测各组肾癌细胞株中a d m 的表达水平。 3 应用s p s s l 3 0 软件对结果进行统计处理。a d m 蛋白表达水平用独立样 本t 检验法或方差分析检验法。检验水准为o 0 5 。 结果： l 各种条件低氧刺激中a d m 蛋白表达水平 da c t i n 蛋白：分子量为4 2 k d ，w e s t e r n 杂交后在4 2 k d 位置出现阳性条 带。采用凝胶成像分析系统对杂交条带进行半定量分析，蛋白含量以积分 光密度值( i o d ) 表示。每次检测蛋白时均检测pa c t i n 蛋白，以其为标准 对所检测a d m 蛋白进行定量。 a d m 蛋白：分子量为7 k d ，w e s t e r n 杂交后在7 k d 位置出现阳性条带。 采用凝胶成像分析系统对杂交条带进行半定量分析，蛋白含量以i o d 表 示，以相对积分光密度比较蛋白表达高低。与对照组细胞相比，各个条件 低氧刺激组细胞株均有不同程度的a d m 高表达，且与刺激时间呈正相关 性。 结论： 低氧环境可以促进肾癌细胞中a d m 的表达。但低氧环境促进a d m 表达的具体发生机制及a d m 在肾癌中的具体生物学效应仍需进一步深入 探讨。 关键词：肾癌；低氧；a d m ；蛋白印迹 e m p i r i c a ls t u d y o nt h ea d r e n o m e d u l l i n ( a d m ) e x p r e s s i o ni n r e n a lc e l lc a r c i n o m ab yt h el o wo x y g e n f a c t o r s a b s t r a c t o b i e c t i v e ：i nc h i n a , r e n a lc e l lc a r c i n o m ai s o n eo ft h es e v e r ed i s e a s e t h a tt h r e a t e n sp e o p l eh e a l t h ，i st h em o s t e s to ft h eu r o l o g i c a lt u m o r r e c e n t l y y e a r s a d mi no v a r i 锄c a n c e r , l u n g c a n c e ra n do t h e rt u m o r so ft h eo c c u r r e n c e d e v e l o p m e n th a sb e e nag r o w i n gc o n c e r n , i t si nr e n a lc e l l c a r c i n o m ae f f e c t a l s oh a sb e g u nb yw i d e s p r e a di n t e r e s ta n dr e s e a r c h a d r e n o m e d u l l i n ( a d m ) i s t h ef i r s td i s c o v e r df r o mj a p a ns c h o l a r si n19 9 3f r o mt h e p h e o c h r o m o c y t o m a i ns e p a r m i n go u to fap e p t i d ev a s o d i l a t o r , i t sc o n s i s t s o f5 2a m i n oa c i d c o m p o s i t i o n ，i ta n dc a l c i t o n i ng e n e r e l a t e dp e p t i d e ( c g i 心c a l c i t o n i n 。g e n e r e l a t e dp e p t i d e ，) h o m o l o g yb e t w e e n2 4 ，i th a v et y p i c a l d i s u l f i d eb r i d g e ， b e l o n g i n gt ot h ef a m i l yo fc g r p c u r r e n t c l i n i c a ls t u d i e ss h o wt h a ta d m i n m 觚vc a n c e rp a t i e n t si no v e r e x p r e s s i o n ，a n dh i s t o l o g i cg r a d ea n dm a l i g n a n t 删ei n t e r r e l a t e d t o t h e ，a n dw i t ht h ep o o rp r o g n o s i s a d mi n t h eb o d yc a np l a y m a n vc o m p l e xb i o l o g i c a le f f e c t s a d ma c t i v a t ea d e n o s i n eg u a n y l y lc y c l a s e 。 p k a s i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y , s ot h a tt h ec e l l si nc 姗l e v e l s r i s e ；a d m i m p r o r e si n t r a c e l l u l a rc a 2 + c o n c e n t r a t i o n - i n d u c e dv a s o d i l a t i o na n da c t i v a t e d e n d o t l l e l i a ln i t r i co x i d e ( n o ) s y n t h a s e ；a d ma c t i v a t e dm a p ks i g n a l i n gt ot h e p a t h st op r o m o t ec e l lm i t o s i s ，e t c t h e s ea r el i k e l yt oo c c u rw i t ht h et u m o r d e v e l o p m e n t i sc l o s e l y h y g i o x i ai s s o l i dt u n l o rg r o w t hh a v ec o m m o nf e a t u r e s ，l o wo x y g e n s t i m u l a t et u m o rc e l l sp r o d u c es o m ec o l u m n so f t h er e a c t i o nt op r o m o t et u m o r g r o w t ha n dp r o g r e s s s t u d i e ss h o w t h a tl o wo x y g e nc a i ls t i m u l a t et h ea d m i n t h ee x p r e s s i o n ，s u b s e q u e n t l ym a n yr e p o r t si ni o wo x y g e ne n v i r o n m e n t si na v a r i e t yo ft u m o rc e l l s i na d mo v e r e x p r e s s i o n l o w - o x y g e ne n v i r o n m e n t a d m o v e r e x p r e s s i o na n di t sb i o l o g i c a le f f e c t so n t u m o rg r o w t hd e v e l o p m e n t p r o c e s sp l a y sa ni m p o r t a n t r o l e t h i ss t u d yi nh u m a nr e n a lc e l lc a r c i n o m a a so b j e c t ，g i v e nt h er e l a t i v el o w 一一 3 英文摘要 o x y g e ns t i m u l a t ep r o c e s s e do b s e r v i n gi t se x p r e s s i o nl e v e lo fa d m ，f u r t h e ri n r e n a lc e l lc a r c i n o m av a l i d a t i o nh y p o x i af a c t o r so nt h ei n f l u e n c eo fa d m h o w e v e r , l i t t l ea t t e n t i o nh a sb e e np a i dt ot h ea d mi nr e n a le e l lc a r c i n o m a a s ar e s u l to ft h i sr e s e a r c ht ov a l i d a t ea n de x p l o r i n gt h ep o s s i b i l i t yo fr e n a lc e l l c a r c i n o m ad e v e l o p m e n tm e c h a n i s ma n dt h ec l i n i c a ld i a g n o s i so fr e n a lc e l l c a r c i n o m aa n dr e a s o n a b l et r e a t m e n tp r o v i d e st h e o r e t i c a lb a s i s m e t h o d s ： h u m a nr e n a lc a r c i n o m ac e l l7 8 6 一op e k i n gu n i o nm e d i c a l c o l l e g e c u l t u r eo fr e n a lc a r c i n o m ae e l ll i n ea n d g i v ed i f f e r e n tc o n d i t i o n so ft h e r e s p e c t i v e l yl o w - o x y g e ne n v i r o n m e n t ，u s eo fp r o t e i n si m p r i n t e d ( w e s t e r nb l o t ) d e t e c t i o no fv a r i o u sg r o u p so fr e n a lc a r c i n o m ac e l ll i n ee x p r e s s i o nl e v e l si n a d m a d m p r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l sw i t hi n d e p e n d e n ts a m p l et - t e s tm e t h o do r t e s tf o rv a r i a n c ea n a l y s i s s t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e sw e r ed e t e r m i n e da tl e v e lo f p 0 0 5 t h es t a t i s t i c a lp a c k a g ew a ss p s s13 0 r e s u l t s ： l o 一 一 lv a r i o u sc o n d i t i o n so fl o wo x y g e ns t i m u l a t ep r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l si n a d m pa c t i np r o t e i n ：1 1 1 em o l e c u l a rw e i g h ti s4 2 k d a r e rw e s t e r nh y b r i d i z a t i o n ，4 2 k db a n d sw e r ef o u n d ba c t i np r o t e i nw a gd e t e c t e dw h e na d m p r o t e i nw e r ee x a m i n e da n da st h es t a n d a r df o rs e m i q u a n t i t a t i v ea n a l y s i so f a d m p r o t e i ne x p r e s s i o n a d m p r o t e i n ：n em o l e c u l a rw e i g h ti s7 k d a f t e rw e s t e r nh y b r i d i z a t i o n ， 7 k db a n d sw e r ef o u n d n eb a n d sw e r ea n a l y z e db yg e li m a g ea n a l y z i n g s y s t e m n l ep r o t e i ne x p r e s s i o nw a ss e m i q u a n t i t a t i v ed a t a ( n a m e di o d ) ，a n d t h er e l a t i v ei o dw a gu s e df o rt h e c o m p a r i s o n o fp r o t e i n e x p r e s s i o n c o m p a r i n gt on o r m a lt i s s u e s ，v a r i o u sc o n d i t i o n so fl o wo x y g e ns t i m u l a t e g r o u pc e l l l i n e sh a v ed i f f e r e n t d e g r e e so fa d mh i g he x p r e s s i o n ，a n d c o r r e l a t i o nw i t hs t i m u l a t i n gt i m ee x p e r i e n c i n g c o n c l u s i o n ： l o w - o x y g e ne n v i r o n m e n t ，c a nc o n t r i b u t et or e n a lc e l lc a r c i n o m ai nt h e 4 英文摘要 e x p r e s s i o n o fa d m ，a n dw i t hl o wo x y g e ns t i m u l a t et i m ee x p e r i e n c i n g c o r r e l a t i o n s b u tl o w o x y g e ne n v i r o n m e n tt op r o m o t et h ee x p r e s s i o no f s p e c i f i ca d m m e c h a n i s ma n da d mi nr e n a lc e l lc a r c i n o m aa n ds p e c i f i c b i o l o g i c a le f f e c ti ss t i l lt h en e e df o rf u r t h e ri n d e p t hd i s c u s s i o no f k e yw o r d s ：r e n a l c e l l c a r c i n o m a ；l o w - o x y g e n ；a d m ；p r o t e i n s i m p r i n t e d 5 研究论文 低氧因素对肾细胞癌中肾上腺髓质素a d m 表达 的影响的研究 - * 曾 嗣青 在我国，肾癌是严重威胁人民生命健康的疾病，由于大部分病人早期 没有任何不适症状，因此在发现肿瘤或者出现症状后再就诊已经耽误了最 佳治疗时间因而在恶性肿瘤中死亡率较高。目前，肾癌治疗效果关键在于 早期发现和合理规范的治疗。因此寻找早期诊断指标及合理规范治疗措施 成为迫切任务。肾上腺髓质素( a d r e n o m e d u l l i na d m ) 最初是由日本学者 在1 9 9 3 年从人嗜铬细胞瘤中分离提取出的一种血管舒张肽，其是由一条 5 2 个氨基酸组成的多肽链，与降钙素基因相关肽( c a l c i t o n i n g e n er e l a t e d p e p t i d e ，c g r p ) 具有同源性，其同源性为2 4 ，具有典型的二硫桥，属于 c g r p 家族。目前临床研究表明a d m 在多种癌症病人中过度表达，且与 组织学分级及肿瘤恶性程度呈正相关，并且与预后不良有关。其激活腺苷 酰环化酶p k a 信号转导通路，使细胞内c 6 山口水平升高；提高细胞内 c a 2 + 浓度诱导血管舒张并激活内皮细胞的一氧化氮( n o ) 合酶；激活 m a p k 信号转导通路以促进细胞有丝分裂等均可能与肿瘤的发生发展关 系密切。研究表明低氧可刺激a d m 在组织中表达，其后又有诸多报道在 低氧环境下多种肿瘤细胞中a d m 过度表达。低氧环境下a d m 过度表达 后再发挥其生物学效应在肿瘤的生长进展过程中起着不可忽视的作用。 本研究以人肾癌细胞为对象，给予相关低氧刺激处理后观测其a d m 的表达水平情况，进一步在肾癌中验证低氧因素对a d m 的影响。目前国 内外对肾细胞癌中a d m 的研究较少，因此本研究为验证并探寻肾癌的可 能发生发展机制及肾癌的i 晦床诊断和合理治疗提供理论依据。 材料与方法 1 材料 1 1 实验细胞株 人肾癌细胞株7 8 6 o北京协和医科大学基础研究所购买。 研究论文 1 2 仪器 d y c - z 4 0 1 3 型电转移槽 d g 3 a 电泳槽 d y c - z 2 2 a 型电泳槽 d y y 1 7 b 型转移电泳仪 d y y - i i l 8 a 稳压稳流电泳仪 t l l c 台式高速冷冻离心机 7 5 2 型紫外可见光光度计 超低温冰箱( 8 0 ) h z s - h 恒温水浴振荡器 电子恒温水浴锅 电热恒温干燥箱 电子天平( b s 2 10 5 ) s z 9 7 型自动三蒸纯水蒸馏器 压力蒸汽灭菌器 u v p 凝胶成相分析系统 1 3 试剂 a d m 兔抗人多克隆抗体 pa c t i n 兔抗人多克隆抗体 辣根酶标记山羊抗兔i g g ( h + l ) 考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒 p v d f 膜 p m s f 脱脂奶粉 丙烯酰胺 n ，n _ 亚甲双丙烯酰胺 t e m 哐d t w e e n - 2 0 s d s a p r o t i n i n 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) 北京六一仪器厂 北京鼎国生物技术中心 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 北京四环科学仪器厂 上海光谱仪器有限公司 日本三洋 哈尔滨市东联电子技术公司 天津泰斯特实验仪器公司 天津华北实验仪器有限公司 德国s a r t o r i u s 股份公司 上海亚荣生化仪器厂 上海博讯实业有限公司 美国 美国s a n t ac r u z 公司 北京博奥森生物公司 北京中山生物技术公司 南京建成生物试剂公司 华美生物工程公司 p r o m e g a 完达山乳制品公司 g e n e b a s e 拜昂生物技术有限公司 拜昂生物技术有限公司 拜昂生物技术有限公司 拜昂生物技术有限公司 a m r c s c o 公司 天津华东试剂厂 研究论文 甘氨酸 r p m l l 6 4 0 细胞培养干粉 胎牛血清 青霉素 链霉素 胰酶 e d t a 溶液 细胞裂解液 二氧化碳气体 二甲苯 乙醇 甲醇 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 氯化钠 枸橼酸纳 柠檬酸 2 方法 2 1 细胞培养 a v o n o 公司 美国g i b c o b r l 公司 北京华美公司 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 本室自备 本室自备 本室自备 北京医用气体厂 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 按本实验室常规方法进行。肾癌细胞7 8 6 o 培养取r p m l l 6 4 0 无血清 培养基，加入新鲜胎牛血清( 购买时试剂已灭活) ，使终浓度达到1 0 ， 培养基中加入青霉素5 0 0 0 u m l ，链霉素5 u g m l 。将冻存的7 8 6 o 细胞复 苏，复苏时自液氮中取出冻存管快速放入3 8 温水中使冻存液融化，转 移至细胞培养瓶中分别加入上述培养基，置5 c 0 2 孵箱中，饱和湿度及 3 7 培养，每隔4 8 小时换培养基。细胞长满则用0 2 5 的胰蛋白酶消化 细胞，收集并传代，轻柔吹打后l ：3 传代。冻存细胞时，将细胞悬于含3 0 胎牛血清，1 0 d m s o 的r p m l l 6 4 0 冻存液中，4 。c 放置3 0 分钟，2 0 放置2 小时，7 0 c 过夜后放入液氮保存。实验选用对数生长期的细胞。 2 2 将实验细胞株进行低氧培养。 将生长良好的7 8 6 o 细胞分为实验对照组，3 小时低氧培养组，6 小 时低氧培养组，1 2 小时低氧培养组。调整低氧培养箱条件为5 c 0 2 ， 研究论文 9 4 5 5 n 2 ，0 4 5 0 2 。选定实验开始时间为零点时间，将1 2 小时低氧 培养组由正常条件培养箱转入至低氧培养箱。6 个小时后将6 小时低氧培 养组细胞转入至低氧培养箱。9 个小时后将3 小时低氧培养组转入至低氧 培养箱。1 2 个小时后收获细胞。每组细胞均重复3 次。收获细胞提取细 胞总蛋白已准备下步实验观测各个既定指标。 2 3w e s t e n b l o t 检测细胞总蛋白中a d m 的表达水平 2 3 1 细胞总蛋白的提取 准备：裂解液( 配方见后) ，大e p 管，生理盐水，刮子，枪。 ( 1 ) 将培养瓶中培养基吸出离心( 目的是收集所有细胞) ，弃去上清留沉淀。 ( 2 ) 用生理盐水轻轻洗培养瓶中细胞2 3 次，弃去冲洗液体，注意动作轻柔 缓慢。 ( 3 ) 加裂解液于培养瓶中适量( 若细胞较多长满瓶加3 0 0 微升左右裂解液) ， 冰上裂解半小时左右，一并裂解离心出的细胞。 ( 4 ) 用细胞刮刮瓶壁细胞，吹管充分吹打，收集至e p 管中。 ( 5 ) 低温高速离心机4 、1 2 0 0 0 转离心2 0 3 0 分钟，吸上清至一个新的清 洁e p 管中，做好标记，_ 2 0 保存。如长期保存，可以放置7 0 保存。 ( 裂解液：p m s f = 1 0 0 0 1 0 ) 即1 毫升裂解液中加l o 微升p m s f 2 3 2 考马斯亮兰蛋白定量法测定收集蛋白浓度 将蛋白取出，置于冰盒中化开，配应用液，( 考马斯蛋白亮兰：蒸馏 水= 1 ：4 ) ： 每支试管中加入3 m l 考马斯蛋白亮兰，加入1 0 山待测蛋白( 另设一标 准管一空白管) ，然后在标准管中加入已知标准蛋白( 约6 0 “1 ) ，空白管中 加入蒸馏水5 0 m ，混匀静置1 0 分钟。于5 9 5 n m 处，l c m 光径进行比色， 用蒸馏水调零 蛋白定量采用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒，主要步骤如下： 将c b b g 2 5 0 贮备液用蒸馏水稀释5 倍成应用液， 将蛋白标准用生理盐水稀释5 6 倍 上 取8 支试管，每支进行编号， 每管均加入3 m l c b b g 2 5 0 应用液 上 研究论文 空白管中加入5 0 1 1 1 蒸馏水， 标准管中加入5 0 i t l 稀释的蛋白标准，其余6 管每管均加 入4 5 1 x l 生理盐水和5 山待测样品 上 将各管内液体振荡混匀后静置1 0 m i n 上 将分光光度计的波长调至5 9 5 n m 处， 在t 档开盖调“0 ，闭盖调“1 0 0 ， 在a 档处开盖调“l ，。闭盖用空白管调“0 ” 土 读取标准管和各样品管的o d 值 上 计算各蛋白样品的浓度，应用公式 蛋白浓度= 测定管o d 值标准管o d 值标准管浓 度x 1 0 求出各蛋白样品的实际浓度。 2 3 3w e s t e n b l o t 测定a d m 蛋白表达 相关试剂的配n - 电泳液： i r i s1 5 1 5 9 ，甘氨酸7 2 0 5 9 ，三蒸水溶解至5 0 0 m l ，加入0 5 9 s d s 溶于其中，4 。c 保存。 电转移液： i r i s4 5 5 9 ，甘氨酸2 1 6 2 5 9 ，三蒸水溶解至1 5 0 m l ，再加入 2 2 5 m l 甲醇，三蒸水定容至1 5 0 0 m l ，4 。c 保存。 t t b s 液：t r i s1 2 1 9 ，氯化钠9 9 ，三蒸水溶解至9 8 0 m l ，调p h 值至7 5 ， 补水至1 0 0 0 m l ，再加l m lt w e e n 2 0 ，4 。c 保存。 i r i s e l s d sp h 8 8 ：t r i s18 2 9 溶于8 0 m l 三蒸水，调p h 值至8 8 ，补水 至1 0 0 m l ，再加入s d s 0 4 9 ，4 。c 保存。 i r i s e l s d sp h 6 8 ：t r i s6 0 5 9 溶于8 0 m l 三蒸水，调p h 值至6 8 ，补水 至1 0 0 m l ，再加入s d s 0 4 9 ，4 c 保存。 3 0 丙稀酰胺0 8 甲双丙稀酰胺：丙稀酰胺( 单体) 3 0 9 ，甲双丙稀酰 胺o 8 9 ，溶于1 0 0 m l 三蒸水中，棕色瓶4 c 保存。 1 0 过硫酸铵：o 1 9 过硫酸铵溶于l m l 三蒸水中，避光4 。c 保存 ( 1 ) 制备凝胶 研究论文 分离胶 1 2 倍1 0 分离胶配置：3 0 a c r6 m l t r i s c lp h 8 84 9 5 m l h 2 0 7 4 5 m l l0 a p s0 0 6 m l t e 哐do 0 1 2 m l 胶板灌至凹槽顶部距3 c m 处，分离胶上封水，约半小时后凝，再灌 浓缩胶，插梳子。 浓缩胶 浓缩胶配置： 3 0 a c r1 3 m l i r i s c lp h 6 82 5 m l h 2 0 6 1 m l 10 a p s0 0 5 m l t e m 匣do 0 1 2 m 1 ( 2 ) 上样 样本以裂解液补齐，并加入五分之一量的6 x b u f f e r ，快速离心， 沸水5 分钟变性，再快速离心放冰盒上准备上样。大齿梳最多可上 5 0 山，加入m a r k e r ，两边加1 x b u f f e r 防止条带跑散。 ( 3 ) 电泳 浓缩胶电压1 0 0 v 分离胶电压1 2 0 v待m a r k e r 条带跑散后即可。 ( 4 ) 转膜 i 膜的预处理 将膜依次放入甲醇、蒸馏水、转膜液中，其中甲醇1 2 分钟快速 激活，蒸馏水浸泡3 m i n ，转膜液浸泡1 0 m i n 左右。 i i 滤纸以转膜液浸透 i i i 切胶时注意连续切断，切角做标记( 由于蛋白质带负电荷，由 正极向负极转负极一海绵一滤纸一肜0 _ p v d f 膜一滤纸一海绵 一正极) 注意赶尽气泡，不能将顺序颠倒或打乱。 i v 转膜( 置4 。c 冰箱，以目的蛋白分子量大小调整转膜时间及电 研究论文 压) 膜条件： 3 - a c t i n 9 0 v a d m3 0 v 4 5 m i n 2 5 m i n v5 脱脂奶粉封闭，3 7 放置2 h 。 ( 5 脱脂奶粉液配制：脱脂奶粉l g ，t b s t 液2 0 m 1 ) ( 5 ) 一抗封闭 配制一抗：以上步封闭用脱脂奶粉稀释一抗抗体液，4 0 过夜。 稀释浓度：p - a c t i n 1 ：1 0 0 0 a d m1 ：4 0 0 ( 6 ) 二抗封闭 i 用1x t b s t 充分漂洗膜，每次1 5 分钟，漂洗3 次。 i i 配置二抗液：按1 ：7 5 0 0 比例以1x t b s t 稀释二抗原液。 i i i3 7 封闭9 0 m i n 。 i v 用1x t b s t 充分漂洗膜，每次1 5 分钟，漂洗3 次。 ( 7 ) 显影 i 显影、定影液配制： 显影液：显影液小袋粉剂4 9 溶于3 7 5 m l 水中，再溶入大袋粉 剂4 5 7 5 9 ，再加水至5 0 0 m l 。 定影液：定影液大袋粉剂8 7 5 9 溶于3 7 5 m l 水中，再溶入小袋 粉剂7 6 2 5 9 ，再加水至5 0 0 m l 。 i i 发光剂配s 0 - 发光剂a 瓶b 瓶液体按1 ：1 比例配制装入干净容器中。 i i i 显影、定影： 暗室中每张膜均匀滴满发光剂，每张膜大概用发光剂2 0 0 i t l ， 待出现条带后覆盖胶片放入暗盒，根据条带亮度掌握显影时间 1 0 卜- 3 m i n ，每张膜可曝片3 _ 5 张。曝片完毕后先在显影液中浸 泡待胶片出现条带后立即放入清水中漂洗两次后放入定影液中。 ( 8 ) 扫描仪扫描后专业软件分析。 2 4w e s t e mb l o t 检测结果判定 凝胶成像系统( u v p , 美国) l a b w o r k s4 5 软件对蛋白表达行半定量 分析，以积分光密度( i o d ) 值表示。以相对i o d 值比较蛋白表达高低。 研究论文 相对i o d 值= a d m 蛋白的i o d 值相应pa c t i n 蛋白的i o d 值。判定 标准：蛋白在相应位置出现条带即判断为阳性表达，以相对i o d 值为比 对数据测定各个处理组蛋白表达水平。 3 统计学处理 应用s p s s l 3 0 软件对结果进行统计处理。a d m 蛋白表达水平，用相 关样本t 检验或方差分析法检验。检验水准为o 0 5 。 结果 1da c t i n 蛋白检测结果 pa c t i n 蛋白分子量为4 2 k d ，w e s t e r n 杂交后在4 2 k d 位置出现阳性条 带。采用凝胶成像分析系统对杂交条带进行半定量分析，蛋白含量以积分 光密度值( i o d ) 表示。每次检测蛋白时均检测pa c t i n 蛋白，以其为标准对 所检测a d m 蛋白进行定量 2a d m 蛋白检测结果 a d m 蛋白分子量为7 k d ，w e s t e r n 杂交后在7 k d 位置出现阳性条带。 采用凝胶成像分析系统对杂交条带进行半定量分析，蛋白含量以i o d 表 示，以相对积分光密度比较蛋白表达高低。与正常组织相比，3 小时低氧 刺激组、6 小时低氧刺激组、1 2 小时低氧刺激组中a d m 的表达均呈较高 水平。其与正常对照组细胞均有显著性差异( 尸 o 0 1 ) 。且a d m 表达水平 与低氧刺激时间呈正相关性。 一 堑壅丝查 一一一_ 一 附图 。，。氐 。，。l ，。，。t - 2 - * t - 参t + - - ，和 参- 鑫霸t 象 8 0 一2 - - 舻 ，a i d m ，- - 7 l 旧 at h e e l e c t r o p h o r e s i s b a n do fp a c t i np r o t e i ne x p r e s s i o ni nd i f f e r e n tg r o u p b yw e s t e mb o l t t i n g 1 ：n o r m a l2 ：h y p o x i a3 h3 ：h y p o x i a 6 h4 ：h y p o x i a1 2 h bt h ee l e c t r o p h o r e s i sb a n do f a d mp r o t e i ne x p r e s s i o ni nd i f f e r e n tg r o u p b y w e s t e r nb o l t t i n g 1 ：n o r m a l2 ：h y p o x i a3 h3 ：h y p o x i a6 h 4 ：h y p o x i a1 2 h 研究论文 附表 t a b l e1t h e e x p r e s s i o no f a d mp r o t e i ni nd i f f e r e n tg r o u p n o r m a l 0 8 4 2 8 0 0 7 1 9 1 1 5 6 7 0 0 9 0 3 1 9 7 3 2 0 1 3 8 6 h y p o x i a1 2 h 1 0 2 3 2 7 0 0 3 5 8 0 t a b l e2t h ee x p r e s s i o no f a d m p r o t e i nb e t w e e nt h en o r m a l g r o u p a n dt h eh y p o x i a3 h g r o u ps t a t i s t i c s n m e a n xn o r m a l10 8 4 2 8 0 7 18 6 0 2 2 7 3 h y p o x i a3 h 1 01 1 5 6 7 0 9 0 3 00 2 8 5 6 i n d e p e n d e n ts a m p l e st e s t t - t e s tf o re q u a l i t yo fm e a n s f sigt d f s i g ( 2 - t a i l e d ) x e q u a lv a n a n c e sa s s u m e d4 3 65 18 e q u a lv a d a n c e sn o ta s s u m e d - 8 6 0 31 8 - 8 6 0 31 7 1 3 7 氏o 0 5 ；n o r m a lw h y p o x i a3 h ，弘- 8 6 0 3p = o 0 0 0 o 0 5 - - - - _ - _ _ _ 一一 1 5 研究论文 一一_ _ - - _ _ _ _ 一 t a b l e3t h ee x p r e s s i o no f a d m p r o t e i nb e t w e e n t h en o r m a l a n dt h eh y p o x i a 6 hg r o u ps t a t i s t i c s g r o u p nm e a n s t d d e v i a t i o ns t d e r r o rm e a n x n o r m a l10 8 4 2 80 7 18 6 0 2 2 7 3 h y p o x i a6 h 1 01 9 7 3 2 1 3 8 5 50 4 3 8 1 i n d e p e n d e n ts a m p l e s t e s t l e v 朝f 1 2 s t f o re q u a t y t - t e s tf o re q u a l i t yo fm e a n s 堕! 鱼塑璺璺鱼皇璺 一 f sigt d f s i g ( 2 - t a i l e d ) x e q u a l 垤哟n c e s 2 4 2 81 3 7 2 2 9 0 2 a s s u m 醐 e q u a lv a r i a n s - 2 2 9 0 2 13 5 150 0 0 n o ta s s u m 印 p o 0 5 ；n o r m a l v sh y p o x i a6 h ，t = - 2 2 9 0 2p = 0 0 0 0 0 0 5 t a b l e4t h ee x p r e s s i o no f a d mp r o t e i nb e t w e e nt h en o r m a l a n dt h eh y p o x i al2 hr a n k s g r o u p nm e a nr a n k s u mo fr a n k s x n o r m a l1