（高分子化学与物理专业论文）选择性识别材料的设计与识别机制研究.pdf

摘要 具有分子识别功能的聚合物吸附材料在生物大分子分离，血液灌流用吸附剂等领域有 着良好的应用前景。但是出于生物大分子的的结构复杂，针对识别材料吸附机理的研究比 较困难，限制了选择性识别材料的设计利丌发。 本课题选择了从尿毒症患者及正常入的血清和尿液分离出的一种中分子毒物含 八个氨基酸残基的多肽作为分子识别的目标分子，以具有不同功能团结构的水溶性聚合物 为i 吸附材料模拟物。建立了聚合物分子识别的模型体系。 首先我们应用二维核磁技术对中分子毒物八肽进行了序列结构的专一性归属， 并且应用化学位移标识方法对八肽的二级结构进行了预测，获知八肽在水溶液中的优势构 象为a 螺旋结构。 然后，考虑到分子识别材料的应用领域，在分析八肽结构特征的基础上从聚丙烯酰胺 母体结构出发合成了一系列具有极性功能罄，疏水功能基结构的水浴性聚合物。通过二维 核磁技术研究了聚合物与多肽分子识别作用的过程。分析了多肽分子活性位点的选取以及 功能基结构对分子识别的影响。 实验结果表明，八肽构象对识别位点选取影响很大，其中端基t r p 为最重要的分子识 别位点。同时端基v a l ，a r g ，t h r ，t r p 2 也是聚合物与八肽识别的位点。聚合物与八肽识别 机制包括氢键作用，静电作用和疏水作用。同时具备产生上述作用功能基的聚合物与八肽 的相互作用最明显。我们合成的丁醛修饰聚丙烯酰胺即在此基础上，对八肽表现出很强的 分子识别能力。 在模型体系的指导下，选择性的合成了一系列交联聚合物。研究了交联型聚合物对设 计目标分子八肽的吸附性能。实验结果验证了应用2 dn m r 方法通过模型体系研究吸附材 料作用机制的可行性。 本文的另一部分工作是应用计算机模拟方法，研究了吸附剂与内毒素作用机制。为吸 附材料的吸附机理的研究和结构设计提供了一种计算化学的方法。 关键词： 分子识别，多肽，水溶性聚合物，二维核磁共振 a b s t r a c t p o l y m e rm a t e r i a l sf o ra d s o r p t i o nw i t hm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nh a v ef a v o r a b l ea p p l i c a t i o ni n t h ef i e l d so f s e p a r a t i o no fb i o m a c r o m o l e c u l ea n dp r e p a r a t i o no fa d s o r b e n t sf o rh e m o p e r f u s i o n e t c b u ta tp r e s e n t ，b e c a u s eo fc o m p l e x i t 3 ，o fb i o m a c r o m o l e c u l a rs t r u c t u r et h e s t u d yo nt h e i n t e r a e t i o nm e c h a n i s mo fm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nm a t e r i a l si sd i m c u l t w h i c hr e s t r i c t e dt h e e x p l o i t a t i o na n dd e s i g no f n e w m o l e c u l a rr e c o g n i t i o nm a t e r i a l s i no u rs t u d y , t h eo c t a p e p t i d et h a tw a ss e p a r a t e df r o mt h eb l o o ds e r u ma n du r i n eo ft h e u r e m i ap a t i e n t sa n dn o r m a lp e r s o n sw a ss e l e c t e d 骶t h et a r g e tf o rm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n t h e w a t e r - s o l u b l ep o l y m e r sw i t hd i f f e r e n tf u n c t i o n a lg r o u pw e r eu s e df o rs i m u l a c r u mo fa d s o r p t i o n m a t e r i a l sa n dp o l y m e rm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nm o d e l s y s t e mw a se s t a b l i s h e d f i r s t ，2 dn m r t e c h n i q u ew a sa p p l i e dt oa t t a c ht h es e q u e n c es t r u c t u r eo f t h eo c t a p e p t i d e a n dc s iw a su s e dt of o r e c a s tt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo ft h eo c t a - p e p t i d e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ec o n f o r m a t i o no f t h eo c t a - p e p t i d ei nt h ew a t e rs o l u t i o ni s qh e l i xs t r u c t u r e s e c o n d ，i nv i e wo ft h ea p p l i e df i e l d so fm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nm a t e r i a l sa n dt h es t r u c t u r e c h a r a c t e ro ft h eo c t a p e p f i d e p a mw a su s e d 嬲m a t r i xt op r e p a r eas e r i e so fw a t e r - s o l u b l e p o l y m e r sw i t hp o l a ra n dh y d r o l p h o b i cf u n c t i o n a lg r o u p s t h r o u g h2 dn m t h ep r o c e s so f m o l e c u l a rr e c o g n i t i o ni n t e r a c t i o no ft h ep o l y m e r sa n dp o l y p e p t i d ew a si n v e s t i g a t e d t h es e l e c t o fa c t i v es i t eo fp o l y p e p t i d em o l e c u l ea n dt h ei n f l u e n c eo fs t r u c t u r eo ff u n c t i o n a lg r o u po n m o l e c u l a r r e c o g n i t i o nw e r ea n a l y z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n f o r m a t i o no f t h eo c t a - p e p t i d eh a v eg r e a te f f e c t s0 nt h es e l e c t o fa c t i v es i t e ，t h e r ei n t ot h ee n dg r o u po f t i p w a st h eb e s ti m p o r t a n tm o l e c u l a rr e c o g n i t i o ns i t e a tt h es a m et i m e ，t h ee n d g r o u p so f ，a r g , t h r , t r p 2 w e r et h er e c o g n i t i o ns i t eo f t h ep o l y m e r s a n dt h e o c t a - p e p t i d e t h e m e c h a n i s mo f m o l e c u l a r r e c o g n i t i o no ft h ep o l y m e r sa n d t h e o c t a p e p t i d ei n c l u d eh y d r o g e nb o n di n t e r a c t i o n ，e l e c t r i ci n t e r a c t i o na n dh y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n t h ei n t e r a c t i o no ft h e o c t a - p e p t i d ea n dt h ep o l y m e rw i t hf u n c t i o n a lg r o u p st h a t h a v et h r e e i n t e r a c t i o n si sm o s to b v i o u s t h ep a mm o d i f i e dw i t hb u t y r a l d e h y d es h o wv e r ys t r o n gm o l e c u l a r r e c o g n i t i o na b i l l t yf o rt h eo c t a - p c p t i d e i nt h e g u i d a n c e o fm o d e l s y s t e m ，a s e r i e so fc r o s s l i n k i n g p o l y m e r s w e r ep r e p a r e d s e l e c t i v e l y t h ea d s o r p t i o nc a p a c i t yo ft h ec r o s s l i n k i n gp o l y m e r sf o rt h eo e t a - p e p t i d ew a s i n v e s t i g a t e d t h e r e s u l t so f e x p e r i m e n t sv a l i d a t e dt h a tt h ef e a s i b i l i t yt h a ts t u d y i n g o na d s o r p t i o nm a t e r i a l st h r o u g h m o d e is y s t e mb y2 dn m r t e c h n i q u e f u r t h e r m o r et h e c o m p u t e r s i m u l a t i o nm e t h o dw a su s e dt oi n v e s t i g a t et h e i n t e r a c t i o n m e c h a n i s mo f t h ea d s o r b e n t sa n dt h ee n d o t o x i n w h i c hp r o v i d ec o m p u t a t i o n a lc h e m i s t r ym e t h o d f o rt h es t u d ya n ds t r u c t u r ed e s i g no f t h ea d s o r p t i o nm a t e r i a l s k e y w o r d s ：m o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ；p e p t i d e ；s o l u b l ep o l y m e r , 2 dn m r 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第一章前言 第一节分子识别概述 分子识别无论是在生物学还是化学领域中，都是一种基本的现象。例如在有机分子的 结晶过程中，上百万个分子通过极其准确的相互识别，自我构造、组装为有机分子晶体。 这样的过程，是一个典型的分子识别的侈j 子】。在一些有机合成反应中，利用冠醚及其类 似物作为相转移催化剂，促进反应的进行，也利用了分子识别的原理。分子识别在生物和 生命活动中更是发挥着关键性的作用。著名的d n a 的双螺旋结构就是由源自氢键的碱基配 对而形成的。高效的酶催化反应和信息的传递也是通过精确的分子识别形成的分子聚集体 进行的。酶与底物，激素与受体，抗原与抗体的识别等成为各种生物功能的分子机制及调 控原理的重要基础。 分子识别可理解为底物与给定受体间选择性的结合，并产生某种特定功能的过程。其 中，底物与受体的概念是从生物学中借鉴过来的。在这里广义的把分子识别过程中相互作 用的化学物种称为底物及受体，较小的分子称为底物，较大的分子称为受体。有时又称为 主体( 对应于受体) 与客体( 对应于底物) 。 分子识别的研究具有重大的理论价值。八十年代以后，随着化学广泛的进入生命科学， 在分子水平上研究和认识生命运动的本质，成为国际上科学研究的一个主要发展方向。用 有机化学手段来探索和模拟生命过中的分子识别已显示出它的特殊地位，这为有机化学的 发展创造了一个可以大显身手的领域。 分子识别的研究也具有很高的应用价值。分子识别理论是指导新药分子设计的一个重 要工具。新药的开发研究已经从过去单纯依靠随机筛选方法发展成为有目的的分子设计。 此外在新材料、分子器件、催化反应、药物缓释、酶的固定化、天然产物( 中药) 提取等 众多领域分子识别也具有良好的应用前景。 正因如此，近年来，分子识别成为国际上一个十分活跃的研究领域。我国对这一领域的 研究也十分重视。在国家自然科学基金会鼓励研究的领域中就包括了“生物大分子( 蛋白 质、核酸、多糖) 与小分子的相互识别和作用”。在有机化学学科受理的重点项目申请中 包括了“生命体系中的小分子调控和功能模拟”。( 即，利用近代的化学与生物学的方法与 技术，对一些具有重要生物学和药理学意义的内源性生物活性小分子进行结构修饰和化学 模拟，研究它们的功能及其与对应的生物大分子相互作用的机理，研究以有机小分子为基 本结构单元的生物模拟体系在分子识别、手性识别及超分子催化体系中的作用。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第二节分子识别的作用机制 1 0 0 多年前菲舍尔( e f i s h e r ) 以“锁与钥匙”的匹配来描述专一性的结合，称之为识 别。就其实质而言，菲舍尔所指的是底物与受体的“互补性”。 受体对有机底物的成功识别，在于两者之间的精确互补，一般模型见图1 【孙。 图1 底物与受体的精确互补模型 底物与受体的互补性包括空间结构互补性和空间电学特性的互补性。 f i s h e r 所描述的“锁钥关系”指的就是空间结构互补性。但f i s h e r 的概念有一定的 局限性，因为给体与受体的空间结构并非是僵硬的和一成不变的。1 9 5 8 年k o s h l a n d 提出 了诱导配合( i n d u c e df i t ) 的概念。1 3 1 这一概念指出在底物与受体相结合时，受体将采取一 个能同底物达到最佳结合的构象。这个迁程也被称为识别过程的构象重组织。【4 】这一概念 的提出弥补了f i s h e r 概念的不足。 电学特性互补主要是指给体与受体之间能够满足氢键的形成，静电相互作用( 如盐桥 的形成) ，n 堆积相互作用，疏水相互作月等。1 5 】与普通分子中的离子键和共价键那样的强 作用力不同，这种维持给体与受体所形成的复杂体系的作用力被统称为弱相互作用力。换 句话说，弱相互作用力的形成具有很高的结构依赖性( 即作用位点之间三维空间排列的相 互匹配性) 。 尽管分子间弱相互作用力和化学键相比很弱，但分子间弱相互作用力可在一定条件下 起加合与协同作用，形成有一定方向性和选择性的强作用力，成为超分子形成、分子识别 和分子组装的主要作用力。以下是几种重要的弱相互作用力。 ， 2 南开火学硕士毕业( 学位) 论文 2 1 氢键 氢键是一种最常见也是最重要的分子问相互作用力。其强度虽然变化幅度较大但一 般在1 0 k 3m o l 2 5k jm o l 。之间。氢键具有方向性和饱和性。 氢键常常是引起受体和底物缔合形成络合物的推动力和引起分子识别的重要原因。在 生命科学中，基于氢键的分子识别作用占有很重要的地位。在生物遗传过程中，遗传信息 由母体细胞通过d n a 复制( 合成) 而传递给予代细胞。全部过程如图2 所示。 。h3旷oh-弋n h n l 挂糖 o h t 丁盯 ( 掸板) 。醐 t0t ：aa liiili ( 副链) ( 副链) 图2d n a 的转录途径示意图 两个包含有遗传信息的特殊序列相互识别过程，实质上是简单的化学碱基( 含氮杂环) 通过氢键的互相配对。 在氢键的形成方式中最重要的是一h 0 式，因而它在有机晶体中经常出现。 根据键能的不同，又可将其细分为强氢键和弱氢键。例如在s h a r m a 通过x 射线衍射 对一些含酸及吡啶络合物晶体进行研究畔, e 6 1 。原予坐标数据表明酸和吡啶之间可以形成一 对强氢键和一对弱氢键。 表1 列出了该类氢键的基本的结构参数。 其中：对氢键d - - h a - - x ，0 是指d - - h o 之间的夹角，而p 是指h a - - x 之间的夹角。 3 r 卜 一 * h弋 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 表1强及弱氢键的基本参数 n 一0 0 一i i 0c 一一o e n e r g y2 0 k jm o l 4 0k jm o l 1 2k jm o l 2 0k jm o l l b o n dl e n g t hh 00 1 8 o 2nn 1n h 0c h 00 3 o 4n m h 00 1 6 0 1 8l i r a0 一h oh o0 2 2 o 3n m b o n da n g l e01 5 0 0 1 6 0 。1 0 0 0 1 8 0 0 b o n da n g l e 平1 2 0 。1 3 0 0 c h 0 氢键虽然较弱，但在有些情况下甚至可以使得强氢键作用的几何或拓扑结构 发生改变。这种相互作用在决定结晶中原子结构排列方面至关重要。一般地讲，c h 0 氢键的强度和有效性取决于c h 的酸性及0 的碱性，两者的协同效应又会使之再增强。 另一类更弱一些的氢键相互作用是o f | _ 7 c 。这里的丌是具有足够电负性的碳原子( 炔、 烯、芳环、环丙烷等) ，它们具有和o h 形成类似氢键的趋势，从而稳定一些晶体结构。 由于基于氢键识别而形成的复合物结构，弱相互作用单一，便于研究，而且具有很高 的理论价值和开发应用前景，因而吸引了许多化学家从事氢键识别的研究。早在1 9 2 8 年 p a a l i n g 就肘氢键进行过理论处理。近年来人们对氢键的研究仍然方兴未艾。在理论研究方 面有计算机模拟【7 1 、半定量经验处理【明及数据库的建立【9 】。在实用方面越来越多的分子复合 物、超分子材料及自组装体系基于氢键的原理被开发。 2 2 堆积相互作用 堆积相互作用又常被称作芳环s t a ( ：k i n g 作用。有实验证明f l o j j 、【1 2 j ，芳环之间的 s t a c k i n g 作用力主要是芳环上及芳环附近电荷分布不均匀引起的静电引力及诱导偶极作 用力。根据电荷分布状况，芳环可以近于平行排列，也可以互成定角度排列。前者称为 面对面s t a c k i n g , 后者称为边对面s t a c k i n g 。 芳环s t c k i n g 作用具有十分重要的意义，例如d n a 中杂环碱基之间的s t a c k i n g 对双螺 旋结构的稳定作用，蛋白质中芳环侧链之间的s t a c k i n g 作用对三级结构的影响，芳香族 药物的芳环在d n a 杂环碱基对之间的插入作用等等。i t 3 【1 4 】、在设计人工受体时，必须充 分考虑到芳环s t a c k i n g 作用作为分子识别单元的重要性。 堆积相互作用的影响因素很复杂，如芳环的大小、芳环匹配性、金属离子、温度、 溶剂等。其作用强弱，通常被认为高于芳环脂肪链、脂肪链一脂肪链间相互作用。 4 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 2 3 疏水相互作用 1 9 5 9 年，k a u z m a n n 在蛋白质化学进展上发表了一篇题为“影响蛋白质变性的一些 因素”的文章，首次明确提出“疏水作用”的概念。这一概念用于描述非极性分子或基团 在水中倾向于聚集成簇的现象。 最初，人们认为疏水作用是一种化学键。随着认识的发展，人们发现疏水作用不具备 化学键的一般特征。与化学键相比，不论在作用强度，作用的范围，还是在作用的方向性， 饱和性等方面都相差甚远。于是，疏水作用又被解释为疏水范围内的范德华引力。这是因 为，在水环境中，非极性分子或基团相互趋近的趋势说明其间存在着一种作用力，有人称 之为疏水力，而疏水力的本质就是范德华引力的解释似乎比较合理。 现代研究表明，与范德华力相比，疏水力的产生要复杂得多。从热力学角度的研究认 为，疏水作用是受熵驱动的过程。造成熵增的原因在于水结构有序度的变化。冰中每个水 分子( 中心分子) 与邻近水分子形成四个氢键。当冰融化时，其规则的晶体结构将在多处 被破坏，有1 5 的氢键被切断。在液态水中，每个h 2 0 平均与3 4 个邻居形成氢键，因此， 液态水具有不完全的有序结构。氢键结合形成的聚集体不断的形成和不断的拆散。当非极 性化合物或基团进入水中时，它周围的水分子将排列成刚性的有序结构，即所谓“冰笼” 形结构。这种结构比冰更加有序。当发生疏水作用时，排列有序的水分子笼形结构被破坏， 水的混乱程度增加，即熵增加。虽然非极性分子或基团的聚集本身是一个局部有序化的熵 减过程，但这两种熵变的加和结果是整个疏水作用过程的熵变为正值。【i6 j 这一理论认为非 极性分子或基团的水化层中生成了更多更强的氢键，但是后来的热力学理论计算 1 7 1 【l 8 和中子散射实验【19 】却表明水化层中的氢键反而更少。 还有人认为保持非极性分子或基团聚集在一起的疏水力是一种来自水环境的排挤力， 一种压力( 源自水分子自身结合的高度的内聚力) 。 由于疏水作用不是疏水残基相互之间直接显示的作用力，因此有许多科学家认为疏水 作用本质上不是一种力，还有人认为非极性相互作用属于标准的l e n n a r d j o n e s 作用。 此外，疏水基团之间的相互作用通常被认为是没有方向性的，但是最近对剑桥晶体结 构数据库( c s d ) 和蛋白质晶体结构数据库( p d b ) 的研究发现 2 0 j ，疏水作用是有方向倾向性 的。例如，富电子的吲哚芳环与苯环通常以边对面的t 型方式接触图3 ( a ) ，而缺电子的 恶唑环则多与苯环面对面地平行接触图3 ( b ) 。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 ab 图3a ) 吲哚( 下) 与苯环( 上) 边对面t 型接b ) 恶唑环( 下) 与苯环( 上) 面对面 触 平行接触 由此可见，人们对疏水作用的认识还没有达成一致的认识。疏水作用与氢键作用，静 电作用，范德华作用同属非键作用，但是人们对后三种相互作用的研究比较深入，都已经 有了得到普遍认可和广泛使用的概念和定义。而疏水作用的研究则进展缓慢，至今仍然是 一个研究热点和难点。 疏水作用作为一种特殊的相互作用，在生命化学过程中发挥着极其重要的作用。 ( 1 ) 作为结构因素，疏水作用是维持生物系统结构的作用力。 疏水作用在维持蛋白质构象方面具有极其重要的作用。典型的例子是镰刀状贫血症。 患者和正常人的区别只是在血红蛋白a 链上一个氨基酸残基的突变( 谷氨酸g l u 突变成丙 氨酸v a ) ，氨基酸疏水性的翻转，造成蛋白质三级结构的改变，进而引起分子生理功能的 严重缺陷。 在d n a 的1 3 型双螺旋结构中，除了嘌呤碱基与嘧啶碱基之间的氢键相互作用外，碱基 平面之间的疏水作用在稳定双螺旋结构方面也起着重要作用。 此外，球状蛋白质分子疏水内核，生物膜的脂质双层结构的形成都是由疏水作用决定 的。 ( 2 ) 作为动力因素，疏水作用是促进生物分子有序化相互作用的推动力。 疏水作用一直被认为是底物的非极性区域与受体的非极性区域之间最重要的作用。作 为一种动力因素，它是生物大分子折叠，底物与酶结合，抗原与抗体结合，激素与受体结 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 合以及生物体系中很多其它分子间相互作用造成有序化的主要动力。 蛋白质的折叠是保证其生物活性的基础。现已确认，促进蛋白质疏水核的形成和肽链 折叠的最一般的力是疏水作用。 人工合成或经分离纯化的蛋白质，虽然其一级结构( 即氨基酸序列) 是正确的，但是受 周围环境的影响其立体结构却是错误的，没有生物活性，这种现象被称为蛋白质的变性。 研究蛋白质疏水折叠机制，设法使目标蛋白质可逆的恢复应有的天然构象和活性，被称为 蛋白质的复性。对蛋白质复性机制的研究，最终归结于对疏水相互作用的研究。 在酶的催化过程中，首先要形成一个酶与底物的复合物。实验发现，作为结合点的活 性中心通常是裂缝或裂隙，而裂缝的非极性增进了底物的结合。此外，底物疏水性的改变 对酶促反应速度有直接性的影响，一般底物疏水性增加，酶促反应的速度加快。 在生物学中。由细胞器的某些组分( 包括蛋白质，核酸，糖，脂及其它组分) 组装成 相应的细胞器或细胞器的局部碎片的过程是一个基于分子识别的自组装过程。生物大分子 之间的专一性结合，其装配和结合的作用点主要为疏水区，而维持聚集体结构的力主要是 疏水力。 第三节分子识别在生物医学领域中的应用 近l o 年来，生物医用材料的设计已经从最初单纯的载体材料发展为具有特定仿生功 能的生物医学功能型材料。在这一领域。我们可以这样来定义分子识别：即在包括与目标 分子结构及其接近的众多的分子中，一种聚合物具备与特定目标分子发生相互作用的能力 1 2 1 】。其识别的过程可以用这样一个化学反应式【2 2 】来表达： p + 耳一p 一7 i + e = li 十t 其中p 代表具有特定识别功能的聚合物，氕为目标分子。反应式表明聚合物p 从一系列 分子r ( i - - 1 n ) 的混合物中与n 发生专一作用生成p n 的复合物。 我们在这甩仅介绍其中的几个主要研究领域。 3 1 配体修饰型聚合物 配体修饰型聚合物是指直接在作为载体的聚合物表面通过化学键固载上配体。这些配 体既可以是一些生物活性物质，如酶和底物，抗体和抗原，激素和受体，核酸的互补链段， 多糖与蛋白质复合体等配对体中的一方，也可以是人工合成的结构。由于这类配体与目标 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 分子间具有专一性识别作用，因此该方法成为制备具有分予识别功能的聚合物最直接的方 法。目前，应用该方法已经成功设计出对酶，核酸，抗体抗原，氨基酸，蛋白质等具有专 一性识别功能的生物材料 2 3 2 9 】。 图4 是一种将环糊精固载到热敏性高分子链上制备的分子识别膜对客体分子识别机理 的示意图【3 0 1 。 一 _ o _ 占 t 岫_ m o i q o u l i 图6 杂聚物的设计思路 当然，要想获得高比例的和活性位点吻合的聚合物需要一定的合成条件以及对官能团 的选择。这种识别机理有悖于传统的“锁匙关系”的分子识别机制，是诱导配合机理的体 现，如图7 所示。 飞r 八r 八卜 毋心 图7 随机取代：祭聚物的分子识别机理 3 4 药物分子设计 药物和受体相互作用是药物里现药效的分子基础，这种相互作用便是一种分子识别作 用，它是在三维空间实现的，如果能够知道受体一药物复合物的结构特点，以及药物小分 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 子对生物大分子特定部位的识别作用对整个大分子构象产生的影响，就有可能实现定向分 子设计，开发出合理，高效的药物分子。 药物作用机制 随着计算化学和分子图形学的发展，药物和受体的三维结构模拟显示已经成为可能， 结合x 射线晶体衍射和二维核磁共振( 2 d - - n m r ) 技术，计算机辅助三维定量构效研究和 三维药物分子设计逐渐成为研究的热点。 在已知受体蛋白的三维结构的情况下进行有针对性的分子设计，这种设计方法被称作 全新药物设计( d e n o v od r u gd e s i g n ) 或合理药物设计( r a t i o n a ld r u gd e s i g n ) ，这方面 有代表性的方法有l u d i 、l e a p f r o g 、g r i d 、d o c k 等方法。例如：当所设计的药物是酶的 抑制剂，该靶标酶已被纯化，获得了单晶，并用x 射线衍射技术确定了其三维结构。在有些 情况下，某些复合物的三维结构也是已知的。有了靶标酶的，特别是某些复合物的三维结 构，就有了关于配体( 药物) 和受体( 酶) 之间在空间适配性，结合位点( b i n d i n gs i t e ) 的 某些较可靠的知识。形象地说，就可以在蛋白质“口袋”已知的条件下，把设计中的分子“装 到”口袋中去。可以用计算机图形学的方法观察其大小、形状、构象、取向是否合适：其 疏水区是否和疏水口袋相吻合，在结合位点上能否合适地结合生成氢键、产生静电作用等， 并且可以用分子力学、量子化学等理论化学方法计算其相互作用能量，从而设计新的药物 分子。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 对已有药物的改造也是如此。以抗生素类主体分子对d n a 的识别研究为例。博莱霉素 ( b l e o m y c i n ，b l m ) 是一种研究较多的糖僵白抗菌素，其对d n a 分子的识别以沟内结合为 主。b l m 分子可分为c 一端( d n a 识别区) ，n 一端( d n a 断裂区) 和糖残基区三部分，后者 被认为是细胞识别的功能区【3 8 】。n 一端螯合金属离子后，b l m 断裂d n a 的能力增强，且由原 来的对d n a 富含a t 片段的优先识别变为对富含g c 片段的优先识别。【3 9 l 若对b l m 各区进行 修饰，可获得对d n a 分子有更高识别能力的主体分子，且使得利用手性识别d n a 成为可能 4 0 1 1 4 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第四节分子识别的研究手段 4 1 分子间弱相互作用力的研究方法概述 分子间弱相互作用力是研究分子识别的基础。早在3 0 年代，就开始对分子问弱相互 作用进行研究，限于技术的局限性，在此之后很长一段时间内对它的研究进展缓慢。如何 从总体效应及协同作用把握弱相互作用力，如何把握分子问弱相互作用力与分子组合体结 构及超分子结构的关系，以及弱相互作用力本质的研究则成为超分子化学急待解决的问 题。 目前对分子间弱相互作用力的理论研究可分为量子化学方法和热力学方法。 高精度的量子化学方法可以在电子结构水平上准确的研究分子间弱相互作用力，对其 深入的研究可望在深层次的理论水平上揭示生命现象的本质，为分子识别研究提供强有力 的理论基础。 4 q 用于弱相互作用力研究的量子化学方法有a b i n ir i o ，h f ，s c f ，m p ( 对称性 匹配的微扰方法) ，d p t ( 密度泛函理论) 等多种方法。这些方法在处理具体问题上都一个 共同的原则，就是把产生弱相互作用的分子当作一个整体，认为电子在新形成的超分子轨 道中运动，寻找势能面上的极小点。这些方法只是对部分简单体系有较高的准确性，对于 复杂体系，由于计算量太大，难于应用。对疏水相互作用这样的弱相互作用，也难于适用。 用热力学方法研究弱相互作用主要是研究主体和客体分子通过分子问弱相互作用力 相结合的过程中与过程有关的状态函数变量a g ，h ，as 【4 2 1 。其中对弱相互作用的熵变研 究较多，认为复合体系的形成是熵补偿效应的结果。 对分子间弱相互作用力的实验研究方法有多种。 用谱学方法研究分子间弱相互作用已成为实验研究的主要手段。 红外光谱法，形成了复合体系时，相互作用部位或基团伸缩振动受到影响，从而吸收 峰频率发生一系列的位移，根据位移可对复合体系间选择性作用力作半定量研究。 核磁共振法，形成复合体系时，选择性部位原子的化学环境发生变化，根据化学位移 发生变化的值可研究复合体系的弱相互作用。 其它的方法如电子能谱、紫外光谱、顺磁共振也是常用的分析手段。 分子散射法，对于简单复合体系( 如小分子二聚体中氢键系列的表征) 给出精确的分 子间相互作用势函数，根据散射数据可以确定复合体系的弱相互作用，但对复杂复合体系 无能为力。 x 射线单晶衍射法，则可通过键长及键角直观地确定复合体系的弱相互作用力。 南开大学顶：上毕业( 学位) 论文 另外还有、荧光光谱法、色谱法和生成热测定法等。 近年来，利用原子力显微镜( a f m ) 及扫描隧道电镜( s t m ) 直接观察及测定分子间的相互 作用力已取得重大进展m r a d ma c h e r 等【4 3 1 利用原子力显微镜直接观察了酶的活性。他 们利用a f m 观察了在缓冲溶液中溶菌酶，溶菌酶与底物，溶菌酶与底物及抑制剂的信号， 测得了酶的活性。d a e r i e 【4 4 】等刹甩a f m 观察到当c r o 蛋白同d n a 在专一性位点及非 专一性位点结合时d n a 的弯曲角度分别为6 9 土1 1 。，6 2 土2 3 。，这种角度变化是诱导构 象变化的结果。v t m a y 4 5 1 等利用a f m 测定了生物素一抗生物素蛋白第5 个体系的分子 间作用力，h 及a g 。 4 2 多维核磁共振技术 多维核磁技术是过去十几年中迅速崛起的测量生物大分子溶液三维结构的最重要的 方法。由于它可在接近生理条件的溶液中测定，已成为与x 一射线晶体学相互补充、不可 或缺的手段。 在核磁技术中，常用的参数包括化学位移( c h e m i c a ls h i f t ) 、耦合常数、核的欧佛 豪斯效应n o e ( n u c l e a ro v e r h a u s e re f f e c t ) 、弛豫( r e l a x a t i o n ) 等。 1 化学位移 核自旋周围的化学环境是产生化学位移的基本因素。空间的电场效应、局部磁各向异 性、核周围电子密度的极化、以及氢键效应等，对化学位移都有一定的作用。在不同p h 时，各基团的解离情况不同化学位移就有变化。在不同p h ，以各峰的化学位移对p h 作图， 即可得滴定曲线，称为化学位移的p h 滴定效应。由此可以测定大分子中处于不同位置的 同种的官能团不同的解离状况，从而得出相应的结构信息。 2 耦合常数 耦合常数j 可以通过一维谱、二维分解谱和二维相敏谱的峰间距得到。耦台常数的大 小与取代基及核的电荷密度有关，与耦合核的二面角有关。后者常可用来测定溶液构象。 3 核的o v e r h a u s e r 效应n o e n o e 时不同核之间通过空间( 不一定有共价键相连) 的偶极相互作用，其强度与核间 距的六次方成反比。 n o ef ( 1 ，) r 6 ( t ，为相关时间) 若两自旋核间的距离小于5 a ，则可检测到n o e 效应。 4 弛豫 弛豫过程包括自旋一晶格弛豫( s p i n l a t t i c er e l a x a t i o n t ) 和自旋一自旋弛豫 6 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 ( s p i n s p i nr e l a x a t i o n ，t 2 ) 。弛豫时问扎r 与生物分子的结构和运动性有关，是研究 生物大分子的分子动态学的重要参数。 由于生物大分子的结构复杂性使得其一维核磁谱谱峰重叠，难于归属，实际全识别困 难很大。二维相关谱( 或化学位移相关谱c o s y ) 、核欧佛豪斯二维谱( n o e s y ) 、三维谱、 异核三维谱甚至四维谱等的出现，较好的解决了谱峰重叠的问题。 由核磁共振分析所得的数据( 主要是二维核磁谱提供的中、短程。h 一h 质子间距，以 及二面角数据) 可以构建分子在溶液中的三维结构模型。这种方法与x 一晶体衍射分析通 过键长、键角构建晶体结构一样。首先通过距离几何算法，由几何制约转换成分子坐标， 建立三级结构粗模型，然后通过制约分子动力学计算进行结构精化。【4 6 j 由于溶液状态下，分子存在着比较灵活的构象变化。较单个晶体分子结构的高精度性， 由核磁共振测得的结构更能体现分子的构象运动性。 对于溶液中的不稳定小肽构象，n m r 法可以检测小肽的优势构象。对较大肽中的少量 二级结构也可以分析。 此外可以测定难以结晶的生物大分孑、，也是核磁共振测试方法的独到之处。 但是，核磁共振技术用于测定分子结构也存在着一定的局限性。随着分子量的增大， 谱线线宽几乎呈线性的增大，造成谱峰模糊，信噪比急剧下降，谱图无从分析。一般，分 子量小于2 0 k d 的蛋白质可以用n m r 解出溶液构象。 第五节蛋白质类分子的分子识别研究与应用 生命科学中的重要课题如生长发育、细胞分化、大脑活动、新陈代谢、免疫防御、生 殖控制、肿瘤病变、延缓衰老等无一不涉及蛋白质与活性肽以及其基本组成单位一氨基酸。 它们是生命活动的主要承担者，是沟通细胞间与器官间信息的化学信使，从而发挥 微妙的传讯功能，使机体协调组合成一系列高度严密的控制系统，调节生长、发育、繁殖、 代谢和行为等生命过程。因而氨基酸、多肽和蛋白质研究不仅在理论上，而且在实际应用 上，都有重要意义，尤其是在医学方面，许多疾病例如体液氨基酸失衡、心血管病、胃肠 道病、糖尿病、精神病、癌症、自身免疫或免疫功能低下症、性发育异常与性功能低下症、 老年性痴呆症，以及骨质疏松症与畸形病的起因与治疗均直接与蛋白质、活性肽、氨基酸 相关。 对蛋白质类化合物的研究涉及化学、生物学、医学等多个学科，研究的内容主要包括 三个方面。 ， 1 7 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 生物作用机制的研究 蛋白质的功能是通过与其相应配体相互识别，相互作用而体现出来，这是研究蛋白质 功能的核心问题。蛋白质的功能繁多，例如酶、蛋白激素、病毒蛋白、肌内蛋白、免疫蛋 白、毒蛋白等，它们表现的功能不同，与配体相互作用的方式也就不同。 氨基酸、多肽和蛋白质类药物的研制 氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱、蛋仨质缺损所引起的一系列疾病的重要生化药物，也 是具有高度营养价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。 多肽类药物主要是多肽类激素，这类物质具有很强的生理活性，在调节生理功能时起 着非常重要的作用。 氨基酸、多肽、蛋白质的提取、分离和纯化 鉴于氨基酸、多肽、蛋白质类物质的重要作用，基于分子识别相互作用的提取、分离 和纯化手段的研究成为这一领域的一项重要分支。与前两个分支不同的是，前者在底物确 定的情况下，研究氨基酸、多肽、蛋白质的改造与替代，而后者是以氨基酸、多肽、蛋白 质为目标物，寻找或人工合成相应的专一性的配体。 第六节课题的提出 对氨基酸、多肽、蛋白质的提取、分离和纯化研究的特点是基础与应用的紧密结合。 根据多肽，蛋白质研究的发展方向及高分子所现有的基础，我们将研究的重点放在氨基酸， 活性多肽，蛋白质的专一性识别规律，机理的研究上，从而为进一步开发对氨基酸，活性多 肽，蛋白质有专一性识别功能的新型聚合物吸附材料提供理论参考。 由于不同种类的氨基酸、多肽、蛋白质的结构，物理化学性质差异很大，本课题将研 lr 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 究的范田主要限定于芳香氨基酸以及端基带有疏水性氨基酸残基的多肽的专一性识别机 制的研究上，旨在建立对这类物质高选择性识别清除的方法。 分子识别材料设计的基础是对目标分子结构特征的把握。在深入分析目标分子电学特 性及空间构象的基础上，通过互补官能团的改性或修饰得到高选择性的吸附材料。因此， 高选择性识别材料设计的第一步必须明确目标分予。我们根据本课题组的实际情况，将储 结根博士从尿毒症患者和正常人尿液中通过分级分离对比得到的一种中分子物质八 肽作为目标分子进行了吸附材料的设计。其一级结构为： 的相互作用时干扰因素少。 ( 3 ) 八肽的序列虽然较短，但是依旧可以形成一定的空间构象，从而为识别机 制中空间互补性的考察提供信息。 ( 4 ) 在这个八肽的结构中n 端：f c 端分别是2 个缬氨酸( 支链氨基酸) 和2 个 色氨酸( 芳香氨基酸) ，均为疏水氨基酸。而中间的四个氨基酸残基属于极 性氨基酸，其中精胺酸为碱性氨基酸，半胱胺酸是蛋白质中二硫键形成的 位点。虽然其一级结构只包括八个氨基酸残基，却可以提供丰富的化学信 息。 本课题研究以聚丙烯酰胺为母体结构，经过化学修饰合成了一系列线性聚合物。利用 多维核磁技术研究了吸附材料的分子识别过程，探讨了聚合物对目标分子相互作用的机理 及规律。并依据实验结果合成了相应的吸附材料，考察了模型体系的合理准确性。 1 9 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 本研究从理论上研究了吸附材料对体内抗体，抗原和致病物质的分子识别过程和作用 机制，对进一步开发具有分子识别功能的血液净化材料，识别有毒物，具有非常重要的科 学价值。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 参考文献： 1 徐伟平，李光宪，化学通报，1 9 9 9 ，2 2 d u g a sh b i o o r g a n i cc h e m i s t r yp r o n t i e r