（微生物学专业论文）苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶基因的鉴定.pdf

摘要 摘要 淀粉质原料是迄今最为广泛应用的工业原料，淀粉酶是降解此类原料的一类酶，其 中包括洳淀粉酶、p 淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、解支酶等，特别是由于大量的支链淀粉的 存在使得解支酶显得更为的重要。但是由于种种的原因对解支酶的开发利用规模还较 小，所以近年来渐渐引起人们的关注。普鲁兰酶( e c3 2 1 4 1 ) ，能够专一性的催化支链淀 粉型多糖0 【1 ，6 糖苷键的水解，从而使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链形成一系列链 长不一的直链淀粉。普鲁兰酶就是一种典型的解支酶。普鲁兰酶的水解性质就决定了它 具有提高淀粉质原料利用率、降低粮耗的作用，在淀粉加工工业中有着重要的用途和良 好的市场前景。 本研究的目的是探索利用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌系统来表达来自于苏云金芽孢 杆菌的普鲁兰酶基因。经过序列分析可知苏云金芽孢杆菌有两段基因可能编码普鲁兰 酶，分别标注为a m y x 和p u l a 。本文通过p c r 的方法从苏云金芽孢杆菌的染色体上扩 增得到此普鲁兰酶基因，通过测序鉴定与报道的苏云金芽孢杆菌k o n k u k i a n 亚种的普鲁 兰酶基因的序列完全一致。分别构建表达载体p e t - 2 8 a - a m y x 和p h s g - p u l a 分别在大肠 杆菌和枯草芽孢杆菌中获得了表达。通过酶活的测定在两种重组菌中都检测到了酶活。 同时对重组芽孢杆菌所产的重组酶的酶学性质作了初步的研究。重组酶的最适作用p h 值约6 5 ，p h6 - 8 范围酶较稳定。最适作用温度大约在5 0 ，4 0 7 0 为酶的稳定温度 范围，同时将酶7 0 保温4 5m i n ，仍然保持约5 0 的酶活力。对重组质粒的稳定考察 发现p e t - 2 8 a a m y ) ( 在大肠杆菌中稳定性较好，而对于芽孢杆菌表达载体p h s g - p u a 在 传代过程中发生了质粒丢失的现象，无选择压力下连续转接5 次，几乎全部发生丢失。 对重组菌的发酵条件进行了初步的优化，分别考察了碳源、氮源、培养基初始p h 、 装液量、接种量以及诱导时机对产酶的影响。得到了最终的优化培养基，其成分为：可 溶性淀粉2 ，酵母膏1 ，蛋白胨1 ，n a c l1 ，k 2 h p 0 40 0 1 7 ，m g s 0 4 7 i - 2 00 0 1 2 ， m n s 0 4 7 h 2 0o 0 12 ，调节初始p h 值为8 0 ，装液量为2 5 0m l 摇瓶加入培养基2 0m l ， 接种量1 0 ，培养4h 后加入i p t g 诱导培养8h ，测定酶活。在此条件下重组菌的产酶 水平达到3 4u m l 。 关键词：苏云金芽孢杆菌，普鲁兰酶，枯草芽孢杆菌，酶学性质，发酵条件优化 a b s t r a c t s t a r c hi ss of a rt h em o s te x t e n s i v eu s e di n d u s t r i a lm a t e r i a l a n da m y l a s ei st h ee n z y m e w h i c hc a l lh y d r o l y z et h i sk i n do fm a t e d a l t h e r ea r em a n yk i n d so fa m y l a s es u c ha s 0 【一a m y l a s e 、1 3 - a m y l a s e 、g l u c o a m y l a s ea n dd e b r a n c h i n ge n z y m e sa n de c t a n dd e b r a n c h i n g e n z y m e sb e c o m em o r ei m p o r t a n tb e c a u s eo ft h ee x i s t e n c eo fa m y l o p e c t i n h o w e v e r , f e w d e b r a n c h i n ge n z y m e sh a v e b e e n u s e df o rm a n yr e a s o n s p u l l u l a n a s e ( e c3 2 1 41 ) ，a d e b r a n c h i n ge n z y m ec a p a b l eo fh y d r o l y z i n g 伍一1 ，6 一l i n k a g e so fp o l y m e r sa n dg i v ea m y l o s ea s t h ep r o d u c t p u l l u l a n a s ei so n eo fd e b r a n c h i n ge n z y m e s p u l l u l a n a s ec a ni m p r o v et h e u t i l i z a t i o nr a t eo fs t a r c hm a t e r i a l ，d e c r e a s et h ec o n s u m p t i o nf o ri t sh y d r o l y z i n gc h a r a c t e ra n d t h i sm a k ei tv e r yi m p o r t a n ta n dp r o m i s i n gi nt h ei n d u s t r y 硼1 eo v e r a l lg o a lo ft h i sr e s e a r c hi st ot r yt oe x p r e s sg e n e 曰垆f r o mb a c i l l u st h u r i n g i e n s i s i ne s c h e r i c h i ac o l ia n db a c i l l u ss u b t i l i s i ti n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r et w og e n e sw h i c h p r o b a b l yc o d et h ep u l l u l a n a s e ，a m y ) ( a n dp u l a t h et w og e n e sw e r ea m p l i f i e df r o mg e n o m i c d n ao fb a c i l l u st h u r i n g i e n s i s a n dg e n eb t ph a db e e nc l o n e di n t oe s c h e r i c h i ac o l ia n d b a c i l l u ss u b t i l i st h r o u g ht h ee x p r e s s i n gv e c t o rp e t - 2 8 a - a m y xa n dp h s g - p u l ai n d i v i d u a l l y , a n dt h ep u l l u l a n a s ea c t i v i t yh a db e e nd e t e c t e di nt h et w ok i n d so fr e c o m b i n a n t s e n z y m a t i c p r o p e r t i e sa n a l y s i so ft h er e c o m b i n a n tp u l l u l a n a s eo fb a c i l l u ss u b t i l i s ( p h s g - p u l a ) r e v e a l e d t h a ta l le n z y m a t i ca c t i v i t yo p t i m u ma tp h6 5 ，a n di t so p t i m a lt e m p e r a t u r ef o re n z y m a t i c a c t i v i t yw a sa b o u t5 0 r e s e a r c ho nt h es t a b i l i t yo fr e c o m b i n a n tp l a s m i d si n d i c a t e dt h a t p e t - 2 8 a - a m y xw a ss t a b l ei nt h ee s c h e r i c h i ac o l i , w h i l ep l a s m i dl o s td u r i n gt h et r a n s f e ro f c u l t u r eo fr e c o m b i n a n tb a c i l l u ss u b t i l i s ( p h s g - p u a ) a n da l m o s tt h ew h o l e p l a s m i d sh a dl o s t a f t e rt h ef i v et i m e so ft r a n s f e ro fc u l t u r ew i t h o u tu s eo fs e l e c t i o np r e s s u r e t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fr e c o m b i n a n t sw e r eo p t i m i z e d c a r b o ns o u r c e 、n i t r o g e n s o u r c e 、i n c i p i e n tp ho f t h ec u l t u r em e d i u m 、v o l u m eo f m e d i u m 、i n o c u l u ms i z ea n di n d u c i n g t i m ea n a l y s i sg a v eao p t i m u mc u l t u r em e d i u m ：s o l u b l es t a r c h2 ，y e a s te x t r a c t1 ，p e p t o n e 1 ，n a c l1 ，k 2 h p 0 4 0 0 1 7 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 0 1 2 ，m n s 0 4 7 h 2 0o 0 1 2 ，i n c i p i e n tp h o ft h ec u l t u r em e d i u m8 0 ，v o l u m eo fm e d i u m2 0m l 2 5 0m l 10 o fi n o c u l u ms i z e a n d a d d e di p t ga f t e r4h o u r so fi n c u b a t i o n a n da c t i v i t yo ft h er e c o m b i n a n tp u l l u l a n a s ew a su d t o3 4i j m i k e y w o r d s ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，p u l l u l a n a s e ，b a c i l l u ss u b t i l i s , e n z y m a t i cp r o p e r t i e s ， o p t i m i z i n go ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我- - - n 工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 丝杰： 日 期： 丛! 么，玛 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 经盔3 导师签名： 壶熟 日 期：逊& ： 罩 第一章绪论 第一章绪论 1 1 概述 淀粉质原料是迄今最为广泛应用的工业原料，淀粉是由直链淀粉和支链淀粉构成的 混合物，其中直链淀粉只含有葡萄糖通过0 c 1 ，4 糖苷键连接形成，而支链淀粉还含有分 支链，连接分支处的是洳1 ，6 一糖苷键。淀粉酶是能对淀粉质原料加以水解利用的一类酶。 淀粉酶广泛存在于动物、植物以及微生物中，它是最早实现工业化的酶制剂，产量最大， 用途也最广【1 1 。常见的淀粉酶类如：a 淀粉酶、p 淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等等，它们的 水解方式、产物见表1 1 表1 - 1 常见淀粉酶类【1 2 3 1 t a b 1 1s e v e r a lk i n d so f a m y l o l y t i ce n z y m e s 解支酶是一类能分解淀粉a 1 ，6 糖苷键的酶的通称。常见的类型有植物r 酶( 植物 支链淀粉脱支酶a m y l o p e c t i n 6 一g l u c a n o h y d r a s e ) 、寡一1 , 6 一葡萄糖苷酶( e c3 2 1 1 0 ， o l i g o 1 ，6 g l u c o s i d a s e ) 、微生物普鲁兰酶( e c3 2 1 4 1 ，p u l l u l a n a s e ) 、异淀粉酶( e c3 2 1 6 8 ， i s o a m y l a s e ) 等等。解支酶的来源不同其性质上差别也较大。 目前工业上常用的淀粉质原料成分约7 5 一8 5 是支链淀粉，对于支链淀粉的利用就 必须有解支酶的参与，然而目前解支酶的生产应用规模却相对较小，所以为了提高淀粉 质原料的利用率就迫切需要加大研究开发解支酶的力度。其中，普鲁兰酶就是一种能专 一性切开分支点的q 1 ，6 糖苷键，剪下侧支形成直链的解支酶。近年来该酶普遍受到人 们的关注。 普鲁兰酶( e c3 2 1 4 1 ) ，能够专一性的催化支链淀粉型多糖a 1 ，6 糖苷键的水解，从 而使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链形成一系列链长不一的直链淀粉1 4 。由于该酶最 初人们发现时注意到的是它对普鲁兰糖的( 3 t 1 ，6 糖苷键的水解作用，所以叫其为普鲁兰 江南大学硕士学位论文 酶【3 1 。普鲁兰糖( p u l l u l a n ) 是 q 1 ，6 键连接的麦芽三糖单元构成的线性多糖。微生物来 源的普鲁兰酶对其具有水解作用。 水解的机制如图1 1 ： o 一o o 普鲁兰酶 o - o - - o , 乒一”2 ) 0 - - 0 - 0 t o o o 警擎侉兰 麦芽三二话 。为还礞性宋端。一。为q - 1 , 4 糖萤键 。一。为旺1 6 撼苷键 图1 1 普鲁兰酶的对普鲁兰糖的降解模式 f i g 1 - 1a c t i o np a r e mo f p u l l u l a n a s eo np u l l u l a n 该酶的水解条件是a 1 ，6 一糖苷键的两端至少有两个仅1 ，4 糖苷键相连的葡萄糖p 一。 有研究表明普鲁兰酶作用普鲁兰糖除产生麦芽三糖、麦芽三糖基麦芽三糖外，还产生麦 芽四糖和麦芽四糖基麦芽四糖【7 j 。 国外学者对普鲁兰酶进一步的深入研究细菌来源的普鲁兰酶包括i 型普鲁兰酶、i i 型普鲁兰酶、i 型普鲁兰降解酶、i i 型普鲁兰降解酶、i i i 型普鲁兰降解酶几大类佟j 。普 鲁兰酶相互之间结构上具有相当的保守性，几乎所有的普鲁兰酶其结构上都含有四个高 度保守的区域。但是几类酶之间的水解特性有所不同。i 型普鲁兰酶能够水解普鲁兰以 及支链型多糖的a 1 ，6 一糖苷键产生各种直链淀粉形式。i i 型普鲁兰酶同时具有普鲁兰酶 和a 淀粉酶的活性，可以水解淀粉以及多糖的q 1 ，4 糖苷键和o c 一1 ，6 一糖苷键。i 型普鲁兰 降解酶水解普鲁兰产生潘糖。i i 型普鲁兰降解酶水解普鲁兰产生异葡糖基麦芽糖。i i i 型 普鲁兰降解酶水解普鲁兰产生麦芽三糖、潘糖以及麦芽糖，此酶还可以降解淀粉、支链 淀粉等。 普鲁兰酶的水解性质就决定了它具有提高淀粉质原料利用率、降低粮耗的作用，在 淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。此外，由于目前淀粉原料加工过程 中所用的淀粉水解酶作用条件的差异，淀粉的水解必须分步进行。淀粉制糖的酶法水解 工艺分为液化和糖化两个步骤，液化过程采用中性o 【淀粉酶在9 0 1 0 5 c 高温下进行， 糖化过程采用酸性糖化酶在5 5 。c 6 0 c 的条件下进行。目前世界上以酶法( 0 【淀粉酶和糖 化酶) 生产淀粉糖的最高转化率d e 值为9 6 ，是酶法生产工艺的一个极限数值。这是因 为糖化酶对淀粉中的0 【1 ，6 一糖苷键作用力较弱，从而影响淀粉的最终水解度。降低淀粉 浆浓度或者增加糖化酶的剂量，在理论上可以突破这个极限，但前者大大增加了生产负 荷、提高了成本，后者能够诱发葡萄糖的聚合反应，生成异麦芽糖，影响最终收率。一 种有效的改进工艺是在淀粉制糖糖化过程中添加普鲁兰酶，水解残余的q l ，6 一糖苷键， 则可使d e 值提高至9 7 以上。由于糖化酶作用p h ( p h 4 5 5 o ) 较低，作用温度( 5 5 c 6 0 0 c ) 2 第一苹绪论 较高，在淀粉糖工业中与糖化酶配合使用的普鲁兰酶如能具有相似的作用p h 和作用温度 范围，则能大大开拓其市场。 1 2 普鲁兰酶的应用眦，3 】 由于普鲁兰酶能够专一地切开支链淀粉的a 1 ，6 糖苷键，剪下侧支，形成直链淀粉， 所以该酶可以单独使用于直链淀粉的生产。直链淀粉具有容易形成结构稳定的凝胶的特 性，所以可作为食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，涂布开展性好， 而且会形成一层保护层。而且其醋酸衍生物又可以作为纺织纤维，还可以用于浆纱、纤 维上光以及胶粘剂、包扎材料等。直链淀粉还适合于淀粉软糖的制造，用作果酱增稠剂， 特别适用于装盛油脂含量高的食品，以防止油的渗出。豆类的直链淀粉含量较高，因此 绿豆制成的粉丝相对韧性较好，谷物淀粉通过普鲁兰酶的处理后制成粉丝，从而可以提 高粉丝的质量。 另外普鲁兰酶与其他淀粉酶配合使用在生产上也有应用的例子，如饴糖的制造。目 前饴糖的生产过程包括液化和糖化两个过程。液化过程使用细菌的q 淀粉酶，然后利用 p 淀粉酶进行糖化过程。但是p 淀粉酶对于支链的水解到达分支点附近时就中止。当同 时加入普鲁兰酶时就可以水解分支点的a 1 ，6 一糖苷键，从而提高淀粉的水解度，降低糊 精的含量，提高麦芽糖的产率。 普鲁兰酶可作为啤酒酿造过程的外加酶制剂用于啤酒外加酶糖化过程。啤酒生产过 程中麦芽中的酶是洳淀粉酶、p 淀粉酶以及r - 酶。p 淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用， 可使淀粉分解成麦芽糖( 也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖) 和低分子糊精，使麦 芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化， 即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进 行糖化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加0 【淀粉酶和分解a 1 ，6 糖苷键的 普鲁兰酶制剂等。单独使用0 【淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三糖是很不完全的。又若分解 淀粉a 1 ，6 。糖苷健的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制 成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解伐一1 ，4 和伐1 ，6 一糖苷键的糖化型淀粉酶其反应 产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与0 【淀粉酶协同，效果良好，其分解产 物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。 普鲁兰酶和糖化型淀粉酶配合使用，使淀粉充分糖化。普鲁兰酶在酒精工业中应用 可以提高淀粉出酒率。在我国目前以淀粉为原料生产酒精的工厂，大多以甘薯为原料， 而对于甘薯淀粉，主要成分是由2 0 的直链淀粉和8 0 的支链淀粉组成，因此在酒精发 酵的过程中添加普鲁兰酶，可以大大提高淀粉利用率，出酒率也相应提高。目前普鲁兰 酶较成熟的应用到了高葡萄糖浆，高麦芽糖浆以及干啤酒的生产中。 1 2 1 普鲁兰酶在高葡萄糖浆生产中的应用 高转化率的葡萄糖浆可用来生产结晶葡萄糖或作为生产高果糖浆的原基料。七十年 代，全酶法水解淀粉成葡萄糖的生产发展很快，全世界葡萄糖浆的年产量约为3 0 0 万吨， 当时全酶法生产工艺中葡萄糖最高转化率为9 6 。这是因为糖化酶对淀粉的a 1 ，6 糖苷 江南大学硕士学位论文 键作用速度较慢，从而影响淀粉的最终水解度。降低淀粉浆浓度或增加糖化酶量，在理 论上可突破此极限，但前者必将影响企业效益，后者则会在增加成本的同时，导致葡萄 糖聚合生成异麦芽糖等，加入普鲁兰酶不但能提高伐1 ，6 键的水解速度，降低糖化酶用 量，而且不会发生聚合反应。双酶法生产葡萄糖可以进一步转化为一系列衍生物如葡萄 糖醇及葡萄酸，将可使该酶在医药领域大显身手。 通常全酶法葡萄糖浆的生产过程包括两个酶水解步骤一液化和糖化。以p r o m o z y m e 2 0 0 l 为例，液化过程中，通常在含3 0 3 5 固形物的淀粉浆中加耐高温a 淀粉酶，在 1 0 5 于蒸煮器中用直接蒸汽喷射液化，保温5 1 0m i n ，闪冷至9 5 1 0 0 ，保持1 2h 。 糖化阶段采用普鲁兰酶和糖化酶协同作用，可有效地提高淀粉的水解速度，降低糖化酶 用量，缩短反应时间，提高淀粉浆浓度。 1 2 2 普鲁兰酶在生产高麦芽糖浆中的应用 根据麦芽糖含量高低，麦芽糖浆分为普通高麦芽糖浆和超高麦芽糖浆。高麦芽糖浆 在食品工业和医药工业中都有广泛的应用。食品工业如高级糖果的生产，医药工业中如 可供糖尿病人使用的纯麦芽糖的生产。高麦芽糖浆代替酸水解的淀粉糖浆制造硬糖，不 仅口味柔和，甜度适中，产品透明度高，不易着色，可延长保藏期，而且由于高麦芽糖 浆绝少含有蛋白质，热稳定性比恰糖高，更适合于连续真空薄腊熬糖和浇制成型。用超 高麦芽糖浆制成纯麦芽糖代替葡萄糖静脉注射相对葡萄糖注射液有一个好处：即使以较 大浓度输入时亦不会升高血糖浓度。纯麦芽糖还可以用做生产麦芽糖醇的原料( 麦芽醇 是甜度与蔗糖相当，但热值低的甜味剂) 。另外麦芽糖通过异构化生产麦芽酮糖双歧因 子也是一个极有前景的开发方向。传统麦芽糖浆生产过程，糖化阶段只使用一种酶如p 一 淀粉酶，由于许多p 极限糊精无法被水解，使最大转化率不超过6 0 ，如用p 淀粉酶和 普鲁兰酶协同作用，可使3 0 的液化淀粉浆的转化率超过8 0 ，成为高麦芽糖浆，应用 此法无疑可大大提高大米等淀粉质原料的价值。 1 2 3 普鲁兰酶在干啤酒生产中应用 近年兴起的干啤酒的主要特色就是发酵度高，一般在7 2 以上，苦味低，口味淡爽， 原麦汁浓度低，比较符合大众消费口味。而要获得如此高的发酵度，必须提高麦汁中可 发酵性糖的含量，由于大麦中有4 5 5 0 ( 干物质) 的支链淀粉，有较多的a 1 ，6 。键，必 须加解支酶才能有效地提高麦汁中可发酵性糖含量。由于由细菌发酵得到的异淀粉酶和 由根霉及黑曲霉产生的糖化酶它们的应用条件不太符合麦汁生产和干啤酒的酿造，所以 在麦汁生产和干啤酒的酿造过程中一般要加普鲁兰酶才行。该酶一般在糖化时加入，通 过外加酶制剂协同糖化后可得到麦汁极限发酵度大于7 8 的1 0 0 麦汁，配合使用高发酵 度的啤酒酵母，可以酿造出优级干啤酒。在麦汁煮沸后，该酶即被钝化。 4 第一章绪论 1 3 普鲁兰酶的研究进展 1 3 1 普鲁兰酶的生产菌种 普鲁兰酶最初是由b e n d e r 和w a l l e n f e l s1 9 6 1 年通过产气气杆菌( 典型菌为肺炎克 雷伯氏杆菌k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ) 吲发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能( 酶最 适p h 5 5 6 0 ，最适温度5 0 c ) 。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地 区、微生物中获得了该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 早期的普鲁兰酶的生产菌种有蜡状芽孢杆菌覃状变种( b a c i l l u sc e r e u sv a r m y c o i d e s ) i i o 是y o s h i y u k it a k a s a k i 于1 9 7 5 年发现。该菌可同时生产两种酶：p 淀粉酶和普鲁兰酶。 酶最适作用p h 为6 0 6 5 ，温度5 0 ，转化率最大可以达到9 5 。在p h 5 0 ，温度6 0 c 时 该酶仍然保持大部分酶活。工艺条件的研究发现，氮源对产酶有很大的影响。没有有机 氮源，菌种生长非常贫瘠，蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白都是较为理想的氮源，摇瓶培养 时普鲁兰酶的产量随着氮源( 牛肉浸膏和蛋白胨) 浓度的增加而增加。通过对比不同的碳 源后发现，淀粉、糊精、麦芽糖和葡萄糖都是十分有效的碳源，而蔗糖则不能被利用产 酶。随着碳源浓度的增加，普鲁兰酶产量亦呈现增加趋势。此外，金属离子对产酶有重 要作用，c a 2 + 和b a 2 + 能有效地促进p 一淀粉酶的产生，m n 2 + 有效地促进普鲁兰酶的产生， 但严重抑制p 淀粉酶的产生。c 0 2 + 、z n 2 + 、f e 2 + 、m 9 2 + f f l s r 2 + 对产酶无影响。 八十年代，丹麦n o v o n o r d i s k 公司获得了一株嗜酸性分解普鲁兰多糖芽孢杆菌 ( b a c i l l u sa c i d o p u l l u l y t i c u s ) 1 1 , 1 2 。该酶的最适p h 为5 0 ，最适温度6 0 ，而且6 0 时，在 p h 4 5 5 5 ，7 2h 后仍然保留大部分酶活。生产普鲁兰酶的菌株是野生菌株n c i b l1 6 0 7 的 两个突变株n c i b l1 6 3 8 和n c i b l1 6 4 7 。发酵采用连续恒化培养。n c i b l1 6 3 8 的小试发酵 情况是：2l 的生物反应器，装以酵母膏，玉米浆，葡萄糖为主的培养基ll ，灭菌前培 养基p h 调至5 5 ，发酵温度在3 0 ，空气流速6 5 0m l m i n ( + 1 0 ) ，发酵期间，用2 硫酸 保持p h 5 5 士0 2 。接种2 2h 后，开始底物交换，稀释速率0 0 3l h ，5 8h 后达到稳定发酵条 件，此时细胞密度大约4g 干细胞l 培养基，普鲁兰酶活力为7 1 5u m l ，连续发酵6 天。该酶由于酶学性质的优点所以更加适合工业生产，所以该公司的酶长期以来占领了 中国乃至世界的大部分市场分额。 1 9 8 6 年，日本的y o s h i y u k it a k a s a k i 报道了一株菌能够产耐热、耐酸的普鲁兰酶的枯 草芽孢杆菌，命名为b a c i l l u ss u b t i l i st u 【1 3 j 。其最适温度为6 0 ，最适p h 为7 0 7 5 ，但是 在p h 在5 0 时约只有5 0 的酶活水平。 1 9 8 7 年，德国的e m a d i 和g a n t r a n i k i a n 等报道了一株能同时产a 淀粉酶、普鲁兰 酶和葡萄糖淀粉酶的菌种：耐热产硫酸梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o s u l f u r o g e n e s ) 1 4 】。其普鲁 兰酶的最适反应温度为7 0 * ( 2 7 5 ，最适作用p h 为4 9 5 2 。 还有一些如中间埃希氏杆菌，缓和链球菌以及链霉菌【l 捌等等都有产普鲁兰酶的能 力。 还有报道称筛选到的产碱性普鲁兰酶的菌株，酶能够在p h 6 0 1 1 0 有稳定的酶活。 在碱性条件下能专一性的水解茁霉多糖、淀粉、糖原、支链淀粉和相应低聚糖中的 江南大学硕士学位论文 c 1 ，6 糖苷键。碱性普鲁兰酶是洗涤剂的有效添加剂。对于碱性普鲁兰酶的研究是从 1 9 9 2 年a r a 和i g a r a s h i f l 2 】发现以来开始的，国内仅有马晓军等人报道筛选到一株稳定的耐 热产碱性普鲁兰酶的菌株：芽孢杆菌b a c i l l u ss p s x 1 2 c 6 7 e 1 5 】。 近年来人们开始从不同来源的基质中筛选产普鲁兰酶的菌株，筛选到了各种类型的 菌株，包括各种芽孢杆菌如：b a c i l l u ss p k s m l8 7 6f 1 6 】，b a c i l l u ss p s 一1i 1 7 】，且m a c e r a n s 【1 8 】， b a c i l l u sa c i d o p u l l u l y t i c u s 【1 9 1a n db a c i l l u ss p 【2 0 ，以及产耐热普鲁兰酶的菌株t h e r m o p h i l i e b a c i l l u ss p a n 7 等，特别是耐热酶的筛选越来越受到人们的关注。如丑s t e a r o t h e r m o p h i l u s ， c l o s t r i d i u mt h e r m o s u l f u r o g e n e s ，c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ，d e s u l f u r o c o c c u sm u c o s u s ， f e r v i d o b a c t e r i u m p e n n a v o r a n s ，p y r o c o c c u sf u r i o s u s ，p y r o c o c c u s w o e s e i ， t h e r m o a n a e r o b a c t e rs p ，t h e r m o c o c c u sa g g r e g a n s ，t h e r m o c o c c u sc e l e r ，t h e r m o c o c c u s ：e n s i s ，t h e r m o c o c c u sf u n d u s ，t h e r m o c o c c u s 五, , d r o t h e r m a l i s ，t h e r m o c o c c u s g u a y m a g e n s t sp r o j u n a u sh y a r o t o e r m a l t s， ， l i t o r a l i s 2 h 等等。但是这些嗜热菌的最适温度达到1 0 0 ，对于发酵工艺非常困难，而且 大多数酶是胞内酶，不分泌到细胞外。所以直接采用这些菌株生产普鲁兰酶的工业化困 难很大，人们试图用细胞固定化技术解决这一问题。i p s i t ar o y 2 2 】等人报道了普鲁兰酶的 固定化的尝试，但仍然还是处于探索阶段。所以随着重组基因技术的发展深入，基因工 程手段就越来越引起人们的关注。 1 3 2 普鲁兰酶基因工程研究进展 七十年代后期兴起的重组基因技术对传统的食品发酵工业产生了重大影响。人们利 用这一技术进行现有菌种的改良和新产品的开发。在酶制剂生产中应用该技术不仅可以 提高酶产量而且可以将编码某一特定酶的基因从一种微生物转移到另一种已知的安全 微生物如且s u b t i l i s 和酵母菌中，以解决新酶品种在食品中使用的安全性问题，以上两 点对食品酶工业非常重要，因而愈发引起研究人员的关注。 基因工程技术在普鲁兰酶工业化生产中的应用报道不多，而有关基础理论的探索还 是很多的。1 9 8 4 年，日本科学家把肺炎克雷伯氏杆菌的普鲁兰酶基因体内转移( i nv i v o ) 入大肠杆菌并在其中得以有效表达，但此大肠肝菌的酶活水平不高且在非选择性培养基 中表现极不稳定。1 9 8 5 年，t a k i z a w a 通过把p u l 基因( 包括结构基因和操纵基因) 克隆入 多拷贝数载体p b r 3 2 2 ，得到比野生菌株酶活水平高2 0 4 0 倍的工程菌，此工程菌能保持 较高的酶活水平两周。但是在上述研究中，大部分的酶都是胞内的，不分泌到胞外，而 k l e b s i e l l aa e r o g e n e s 则往往在细胞表面积聚普鲁兰酶，这种现象是工业生产中所不需要 的。19 9 9 年，t e a g u ew m a r t i n 等人从b a c i l l u sn a g a n o e n s i s ( a t c c 5 3 9 0 9 ) ( u s p t 0 6 ，3 0 0 ， 1 1 5 ) 9 分离出了普鲁兰酶基因，并在原核生物表达系统枯草芽孢杆菌中得到了表达，所 产生的重组普鲁兰酶具有很好的应用特性。该酶在6 0 时测得最适反应p h 为5 0 ，在 p h 4 5 条件下测得最适温度为6 2 5 ；在p h 4 5 ，6 0 保温5 5h 仍有5 0 的残余酶活，具 有较好的热稳定性 2 3 , z 4 。自此以后许多普鲁兰酶基因得到了克隆和表达。特别是进入九 十年代后，这些工作进展速度大大加快，相继有许多耐热普鲁兰酶基因被克隆、测序、 在大肠和枯草杆菌中表达。但真正形成产业化的还并不多见。 6 第一章绪论 用于克隆和表达普鲁兰酶基因的微生物见表1 2 ： 表1 2 用于克隆弄口表达普鲁兰酶基因的微生物 t a b 1 2m i c r o o r g a n i s m sf o rc l o n i n ga n de x p r e s s i n gt h eg e n ef o rp u l l u l a n a s e o f i # no ft h ec l o n e dp u l l u l a n a s eg e n e e x p r e s s i o ns y s t e r m b i l l 悄n n g 肼0 e n s i s 撕 b a c i l l u ss “b t i l i s r 1 d e s u l f u r o c o c c r sm u c o s u s t 。1 b 西c l l h 略口m v i o d e r n 吩0 s 毒2 6 b a c l l i 淞d e r a m l f l c a n s t 2 6 1 勋d 如历p 册淞脚口，加淞【2 6 1 n p “如所册甜a m y l o d e r a n o s 口【2 6 1 b 口c i l l 洒s t e a r o t h e r 、m o p h l - 略 2 7 b a c i l l u ss 珏b t i l i s k l e b s 渊0 蠲 t h e r m o p j i l i ct h e r m u s 2 9 1 e s c h e r i c h i ac o l i p y r o c o c c u sw s p 一3 川 e s c h e r i c h i ac o l i c l o s t r i d i u mt h e r m o p h y d r o s u l f u r i c u m 3 1 】e s c h e r i c h i ac o l i b i n 淞s t e a r o t h e r m o p h i l u st r s 12 8 姻b a c i l l u ss 珏b t i l i s r h e m 淞k m d 3 3 3 e s c h e r i c h i nc o t 泊口c m 凇s t t b t i l i s 暑h e m o d n m b i h mb r o c 酰p 4 1酞c h 盯i c h 口c o i 订b n c i l l 凇s 曲n l t s b 1 l 凇s p 。k s m l 3 7 8 3 e s c h e r i c h i ac o i i 1 4 枯草芽孢杆菌体系研究进展【3 6 】 枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，细胞壁不含内毒素，能形成芽饱，是一些重要工 业酶制剂的生产菌。自1 9 5 8 年s p i z i z e n 发现枯草芽孢杆菌1 6 8 菌株能摄取外源基因以后， 随着d n a 重组技术的发明，特别是金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 带抗性标志的 质粒可作为其载体的发现，枯草芽孢杆菌基因工程的工作迅速发展。作为很有吸引力的 外源基因表达的宿主，枯草芽孢杆菌有一些优点：非致病的土壤微生物，不像大肠杆菌 那样具有热源性脂多糖；遗传学特性先进，枯草芽孢杆菌已经测出基因组全部序列，很 多噬菌体和质粒适合于用作克隆载体，并有强的启动子可供利用；分泌蛋白能力强，当 分泌蛋白跨过细胞膜后，就被加工和直接释放到培养基中，这使得回收和纯化目的蛋白 较为简单；良好的发酵基础和生产技术。 枯草芽孢杆菌在工业上长期被用于生产蛋白酶、0 【淀粉酶等，在相对简单的培养基 中能生长到很高的密度细胞的生长特性和生理学性质都被广泛、深入研究，经过几十年 的努力，许多原核和真核基因在枯草杆菌表达系统里被克隆和表达，其中有的已应用于 工业生产，取得不少成绩。但是，也暴露出了问题：蛋白酶对目的蛋白的降解、质粒的 不稳定、真核蛋白分泌表达量低或不能分泌表达等。 枯草芽孢杆菌是发酵工业中生产多种食品用酶制剂如中温淀粉酶、蛋白酶的主要生 产菌种。与淀粉水解相关的耐高温q 淀粉酶，7 6 5 8 淀粉酶等分别是其近源的菌株地衣 7 江南大学硕士学位论文 芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌生产的。这些芽孢杆菌菌种均有很强的启动子控制酶基因的 高效表达。这些强启动子一方面通过改造或提高基因拷贝数可以进一步提高酶的产量另 一方面也可用于其他外源蛋白的高效分泌表达。 通过改造启动子，提高拷贝数等方法可有效提高胞内酶初始翻译水平，提高酶的产 量，但是在工业酶制剂生产菌中由于酶的表达水平已经很高，单纯采用这一方法往往会 导致酶在细胞内的积累。这不但难以提高产量，还会导致宿主菌生长缓慢。目前，我国 应用最广泛的耐高温a 淀粉酶和中温淀粉酶的生产菌就存在生长速度慢而易染菌的缺 点，因此单纯采用强启动子对改善芽孢杆菌生产性能是不够的。在表达外源蛋白时，蛋 白在细胞内积累的问题更为突出，很多古细菌来源的耐热酶具有优越的性能，但由于这 些分子往往疏水性很强，在高表达时往往在细胞内形成沉淀。通过提高与酶蛋白分泌相 关的分子伴侣的表达水平以加强酶分子向细胞外的输出一方面可以减少蛋白在细胞内 的积累改善细胞生长提高产量，另一方面能有效的改善分泌效率低的外源蛋白的表达。 1 5 本研究的立题意义和研究内容 1 5 1 立题意义 目前普鲁兰酶的基因工程还仅仅限于实验室探索阶段，也充分证明了利用基因工程 手段来对普鲁兰酶的改造是可行的。但是国内至今仍然没有能够从微生物中克隆得到普 鲁兰酶基因，构建基因工程体系以改善酶的报道。所以现在的普鲁兰酶市场都仍然是由 少数的大公司垄断，价格还是很昂贵。丹麦的n o v o 公司的普鲁兰酶长期占领着9 5 以上 的市场，其普鲁兰酶4 0 0 l 要1 6 5 元千克。丹麦诺维信和美国杰能科在中国都设有生产 厂和销售处，但是目前普鲁兰酶产品并没有在中国境内的企业生产，都是采用从国外进 口后，在国内的企业分装销售的模式。 对于这种现象，本课题在探索从微生物中获得该酶的基因，构建一个基因工程的表 达体系，改造酶的性质，为生产普鲁兰酶的工业化铺路。 1 5 2 研究内容 蜡状芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 具有产普鲁兰酶的能力，国内外对蜡状芽孢杆菌产生 的普鲁兰酶的酶学性质有详细的报道 3 7 , 3 8 , 3 9 。苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 是蜡 状芽孢杆菌近缘种，两者的基因组序列均已公布，通过对其基因组序列的分析显示，其 中有两条基因可能编码普鲁兰酶。本课题的研究是探索克隆苏云金芽孢杆菌的普鲁兰酶 基因，并将该基因在大肠杆菌及芽孢杆菌里的表达以鉴定该基因确实编码普鲁兰酶的性 质。到目前为止，有关蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶基因的实验研究国内外 均未见报道。本研究所研究的具体内容包括： ( 1 ) 苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶基因的克隆与鉴定以及大肠杆菌中的表达 ( 2 ) 普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达 ( 3 ) 重组枯草芽孢杆菌产普鲁兰酶酶学性质初步研究 ( 4 ) 重组枯草芽孢杆菌发酵条件的优化 第二章苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶基因a m y x 的鉴定 第二章苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶基因口蜘的鉴定 蜡状芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 具有产普鲁兰酶的能力，国内外对蜡状芽孢杆菌产生 的普鲁兰酶的酶学性质有详细的报道【3 7 , 3 8 , 3 9 】。苏云金芽孢杆菌是蜡状芽孢杆菌近缘种， 而且苏云金芽孢杆菌( b