（麻醉学专业论文）nr1抗原与tfr融合蛋白真核表达质粒的构建.pdf

。 y 17 8 4 7 8 6n r l 抗原与t 依融合蛋白真核表达质粒的构建摘要目的：n 甲基一d 天门冬氨酸受体( n m e t h y l d a s p a n a t er e c e p t o r ，n m d a r ，n r ) 与兴奋性突触传递、突触可塑性、学习和记忆等许多中枢活动密切相关，其过度激活所介导的兴奋毒性与机体应激、药物成瘾性、疼痛、脑组织继发损伤等有密切关系。通过选择性干预n r 活动，可能为相关疾病提供有效的治疗手段。己有的n r 拮抗剂或阻断剂均为人工合成的小分子药物，容易弥散通过血脑屏障，但作用选择性低，常引起意识模糊、焦虑不安、幻觉等严重毒副作用，且存在难以超早期用药的问题，难以进入临床。n r l 是n r 的功能亚单位，预测n r l 抗原表位，制备n r l 口服疫苗是超早期干预机体应激、脑损伤、药物成瘾、疼痛等的可行方法之一。转铁蛋白受体( t r a n s f e m nr e c e p t o r ，t 爪) 抗体可能可以携带n r l 抗原通过血脑屏障，从而使得n r l 抗原能够更好的在中枢神经系统发挥作用。因此，本研究旨在用噬菌体展示技术预测小鼠n r l 抗原表位，选择小鼠t 依构建n r l t 依融合蛋白真核表达载体，为n r l 口服疫苗的制备做好前期准备。方法：用小鼠n r l 单克隆抗体( m o n c l o n ea n t i b o d y ，m a b ) 免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体m 1 3 外壳蛋白i i i 上的随机十二肽，经过三轮的生物筛淘后，从第三轮洗脱物中挑取所有5 6 个噬菌体克隆，提取噬菌体单链d n a 并测序。从g e n e b a n l ( 查到小鼠t 瓜编码序列( c o d i n gs e q u e n c e ，c d s ) ，编号为g e n b a n kn p0 3 5 7 6 8 ，将此序列和筛选所得n r l 抗原表位优势序列，通过设计引物、聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 合成融合表达基因序列( 将该基因片段命名为n r l t 瓜) 并连接到质粒载体p u c 5 7 ( 将该质粒命名为p u c 5 7 n r l t 瓜) 。通过限制性内切酶印甩i和肋口i 双酶切质粒p u c 5 7 n r l t 依获得n r l t 瓜片段，并连接到真核表达载体p c d n a 3 1 中，然后用氯化钙法转化到大肠杆菌d h 50 【，氨苄青霉素抗性筛选获得阳性克隆，扩增后提取质粒，进行肋船i 和劢口i 双酶切后电泳，并进行生物测序鉴定。结果：经过3 轮筛选后能与n r l 单克隆抗体特异性结合的噬菌体得到了有效富集，d n a 测序结果表明5 6 个单克隆噬菌体中有5 4 个表达为同一个氨基酸序列：d d w v i s t q s l k s ，其余两个单克隆噬菌体表达的氨基酸序列分别为：h s s h t s n t l p s v 和t n t p p s q r v h l s 。酶切、电泳证实n r l t 侬片段被成功的克隆到质粒载体p c d n a 3 1 中，测序结果证明重组质粒载体插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论：从噬菌体展示的随机十二肽库中成功筛选到了能与n r l特异性抗体结合的短肽d d w v i s t q s l k s ，该肽是n r l 单克隆抗体结合的优势序列，可能模拟了天然抗原的某个表位。成功构建该优势序列与小鼠t 爪真核表达质粒p c d n a 3 1 n r l t 侬，为n r l 口服疫苗的制备及其后续实验奠定了基础。关键词：n 甲基d 天门冬氨酸受体；抗原表位；转铁蛋白受体抗体；质粒载体；口服疫苗；应激c o n s t r u c t i o no ft h ee x p r e s s i o np l a s m i df o rn r la n t i g e na n dt f rf h s i o np r o t e i na b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：n m e t h y l d a s p a i r t a t er e c e p t o r ( n r ) p l a y si m p o i r t a l l tr o l e si nv a r i o u sp h y s i o l o g i c a lm n c t i o n s ，s u c ha ss y n a p t i cp l a s t i c i 吼s y n a p t i ct r a n s m i s s i o n ，s y n a p s ef o r m a t i o nu n d e r l y i n gm e m o 叫a n dl e a m i n gd u r i n gd e v e l o p m e n t t h e ya r ea l s oa s s o c i a t e dw i t hv a r i o u sp a t h o l o g i c a ls t a t e si n c l u d i n gs t r e s s ，d 九j ga d d i c t i o n ，p a i n ，n e u r o l o g i c a ld i s o r d e r sa n dp s y c h i a t r i cd i s o r d e r s e x c i t o t o x i c i t yc a u s e db yo v e r a c t i v a t i o no fn rw a sac o m m o np a t h o l o g i c a lc o n d i t i o nt ot h e s ed i s e a s e s s e l e c t i v ei n t e r v e n t i o no f n ra c t i v i t i e sc o u l dp r o v i d ee f - f e c t i v et r e a t m e n tt or e l a t e dd i s e a s e s t h en ra n t a g o n i s t so rb l o c k e r sn o to n l yo r e nc a u s e db l u r r e dv i s i o n ，a n x i e b ，h a l l u c i n a t i o n sa n do t h e rs e r i o u ss i d ee f f e c t s ，b u ta l s ot h e r ew e r es o m ed i f h c u l tp r o b l e m st ou l t r a e a r l ym a n a g e m e n t ，p o o ra c c e s st oc l i n i c a l n r1i sa ne s s e n t i a ls u b u n i to ft h eg e n ee x p r e s s i o no fn rc o m p l e x ，t h e r e f o r e ，p r e p a r a t i o nn r1o r a lv a c c i n eb yp r e d i c t e de p i t o p eo fi tc o u l ds o l v et h ee a r l yi n t e r v e n t i o np r o b l e m sw h e nn rla n t i g e nt h r o u g hb l o o d b r a i nb a r r i e rc a r r i e db y1 、r a n s f e r r i nr e c e p t o r ( t f r ) a n t i b o d y s o ，o u rs t u d i e sw e r et oc o n s t r u c tt h ee x p r e s s i o np l a s m i do fn r1 一t f r 如s i o np r o t e i nb yp h a g ed i s p l a ye p i t o p ep r e d i c t i o nn r lo fm i c e ，i tw a sv e r yi m p o r t a n tt op r e p a r a t i o no fn r lo r a lv a c c i n e m e t h o d s ：t i od e t e r m i n et h ebc e ue p i t o p eo fam o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tn r1 ，ar a n d o m - p h a g ed i s p l a y e dd o d e c a p e p t i d el i b r a r yw a ss c r e e n e dw i t ht h em o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tn r1 a r e rt h r e er o u n d so fb i o p a n n i n g ，t h ep e p t i d es e q u e n c e so fp o s i t i v ec l o n e sw e r ed e t e r m i n e d3 a n da n a l y z e db yd n as e q u e n c i n g c o d i n gs e q u e n c e ( c d s ) o fm i c ew a sd e s c r i b e di ng e n e b a n k ( n p 0 3 5 7 6 8 ) t h eg e n e ( n a m e da sn r l 一t f r ) e c o d i n gm s i o ne x p r e s s i o no ft h em i c et f ra n dn r1e p i t o p ew a sm a d eb yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) t h e n ，t h ep l a s m i do fp u c 57 一n r1 一t f rw a sc o m p l e t e d n r1 t f rd n a 仔a g m e n t sb yd o u b l ed i g e s t e dp l a s m i dp u c 57 - n r1 一t f rw i t h ，2 ia n d 勋口ie n z y m ew e r ec l o n e di n t ot h ep c d n a 3 1p l a s m i dv e c t o r a r e rt r a n s l a t i o nb a c i l l u sc o l id h 5o 【，t h er e c o m b i n a n tv e c t o ro fn r1e p i t o p es e q u e n c ea n dt f rg e n e 仔a g m e n tw e r es u c c e s s 如l l yc l o n e da n da m p l i f i c a t e d t h ep l a s m i dp c d n a 3 1 n r1 一t f rw a se v a l u a t e db ys e q u e n c i n g ，e l e c t r o p h o r e s i sa r e rd o u b l ed i g e s t i o n r e s u i t s ：a r e r3r o u n d so fs c r e e n i n gw i t ht h en r lm o n o c l o n a la n t i b o d ys p e c i f i c a l l yb i n d i n gp h a g ew e r ee f f e c t i v e l ye n r i c h e d ，d n as e q u e n c i n gr e s u l t ss h o w e dt h a t5 4m o n o c l o n a lp h a g ei na l l5 6s e q u e n c i n ge x p r e s s i o nf o rt h es a m ea m i n oa c i ds e q u e n c e ：d d r v i s t q s l k s ，t h eo t h e rt w os i n g l ep h a g ee x p r e s s i o nc l o n i n go ft h ea m i n oa c i ds e q u e n c e sw e r e ：h s s h t s n t l p s va n dt n t p p s q r v h l s d i g e s t i o nc o n f i l l l l e dt h a tm o u s en r1e p i t o p es e q u e n c ea n ds e q u e n c eo fm o u s et f rg e n ef - r a g m e n tw e r es u c c e s s m l l yc l o n e di n t op l a s m i dv e c t o rp c d n a 3 1 ，t h es e q u e n c i n gr e s u l t st h a tt h er e c o m b i n a n tv e c t o ro ft h ed e s i g no ft h et a 唱e tg e n es e q u e n c ea n df r a g m e n t sw e r ee x a c t l yt h es a m e c o n c i u s i o n s ：p h a g ed i s p l a yr a n d o mp e p t i d el i b r a 叫s u c c e s s m l l ys c r e e n e dw i t ht h en r1 - s p e c i f i ca n t i b o d yb i n d i n gp e p t i d ed d w v i s t q s l k s ，t h ep e p t i d ea n a l o gc o u l db ean a t u r a la n t i g e ne p i t o p e t h e r ew a sas u c c e s s 如lc o n s t r u c t i o no ft h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dp c d n a 3 1 - n r1 一t f r ，w h i c hc o u l de x p r e s st h em s i o np r o t e i no ft h ee p i t o p eo f m i c en r1a n dt f l ，i tc o u l db u i l dat e s tb a s i s4 o fo r a lv a c c i n ef o rn r l k e yw o r d s ：n m e t h y l - d a s p a r t a t er e c e p t o r ，e p i t o p e ，t r a n s f e r r i nr e c e p t o ra n t i b o d y p l a s m i dv e c t o r ，o r a lv a c c i n e ，s t r e s s5 -前言n 一甲基d 一天门冬氨酸受体( n m e t h y l d a s p a r t a t er e c e p t o r n m d a r ，n r ) 是谷氨酸受体的一种亚型，是一种配体门控型离子通道【1 1 ，位于突触前和突触后，参与体内神经发育、神经元的兴奋性突触传递、突触可塑性、中枢敏感化、神经元死亡等多种生理和病理过程【2 4 1 。海马n r 的过度激活是创伤应激致下丘脑一垂体一肾上腺轴( h y p o t h a l a m i c p i t u i t a 拶- a d r e n a la x i s ，h p a 轴) 过度兴奋的重要原因。糖皮质激素( g l u c o c o r t i c o i d ，g c ) 与海马糖皮质激素受体( g l u c o c o r t i c o i dr e c e p t o r s ，g r ) 结合通过负反馈控制着应激时h p a 轴的兴奋性”】，海马n r 导致的h p a 轴的亢进与n r 对海马g r 的影响相判8 1 。n r 介导的兴奋毒性机制及其干预研究一直是神经病学、神经科学与药学领域的一个重要内容，近来的许多研究表明，n r 与机体应激、脑保护、药物成瘾性、疼痛关系密切，通过作用于n r 进行应激调控、脑保护、戒毒、疼痛治疗的可行性研究已成为相关领域的热点。目前研究的n r 拮抗剂较多，大多时间窗太小或空间窗太大导致毒副作用比较大，并且存在难以早期用药问题，疗效欠佳，尚未能广泛进入临床【9 1 1 。d n a 疫苗( d n av a c c i n e ) 又称“裸”d n a 疫苗( n a k e dd n av a c c i n e ) 、基因疫苗( g e n e t i cv a c c i n e ) ，亦有核酸疫苗( n u c l e i ca c i di m m u n i z a t i o n ) 、多核苷酸疫苗( p o l y n u l e o t i d ev a c c i n e ) 等相关名称，是近年来基因治疗研究中所衍生并发展起来的一个新的研究领域。d n a 疫苗可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，它具有制备相对简单，运输保存容易，可方便构建多价疫苗和加入多种免疫佐剂分子等优点。d n a 疫苗的免疫方法主要有肌肉注射，皮内( 包括使用基因枪法) 、皮下接种。然而这些方法都存在d n a 摄取效率低或需特殊设备等缺点，采用重组减毒菌( 如沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌)6 通过粘膜自然感染途径运送d n a 疫苗是一类很有希望的方法【1 2 】。在n r 复合物中，已经发现的亚单位有n r l 、n r 2 和n r 3 。其中n r l 是基本亚单位，是实现通道功能所必需的，具有n r 的一切电生理和药理学特性。因此，制备n r l 沙门氏减毒口服d n a 疫苗可能是超早期干预n r 介导的兴奋毒性作用、治疗相关疾病的可行方法之一。目前关于n r l 疫苗的研究均以全长n r l 【b 1 为免疫原，且报道很少。但是，以全长自身分子为免疫原，对机体具有潜在的自身细胞毒危害，因此，用n r lm a b 在噬菌体随机肽库中筛选b 细胞表位h 】，构建n r l 单b 细胞表位疫苗可望有效解决全长疫苗的障碍性问题。然而，n r 广泛分布于各个脑区和脊髓，未在周围组织中发现n r 。因此，如何使得n r ld n a 疫苗产生的抗体通过血脑屏障进入中枢神经系统发挥作用是一个必须面临的问题。现在研究较多的能够协同大分子物质通过血脑屏障的物质是人胰岛素( h u m a ni n s u l i nr e c e p t o r ，h i r ) m a b 和转铁蛋白受体( t r a n s f e r r i nr e c e p t o r ，t 爪)j抗体【1 5 2 0 1 ，已证实它们分别与脑源性神经营养因子、神经胶质源营养因子、单链抗体、溶酶体酶、艾杜糖苷酶形成融合蛋白后，可协助这些大分子物质通过血脑屏障。虽然胰岛素受体的转运效率要比转铁蛋白受体高1 0 倍，但是由于其m a b 只与灵长类动物如恒河猴的胰岛素受体起交叉反应，因而不能用于本实验作为脑药物运转载体。因此，本实验中，t 依抗体可能是一个理想的介导n r l 抗体通过血脑屏障的分子。本研究拟用n r l 单克隆抗体在十二肽库中筛选抗原表位，构建n r l 抗原、转铁蛋白受体融合蛋白的真核表达质粒p c d n a 3 1 n r l t 爪，为制备n r l 口服疫苗，早期干预n r 奠定基础。7 第一部分n r l 特异性单抗表位分析噬菌体展示技术( p h a g ed i s p l a y e dt e c h n o l o g y ) ，是将外源蛋白或多肽的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，以融合蛋白的形式，在噬菌体表面表达出多肽序列，并保持特定的空间构像，利用特异性亲和作用来筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术。本实验通过用n r lm a b 在噬菌体肽库中筛选抗原表位，为制备n r l 口服疫苗，避免全长法抗原的诸多潜在毒性作前期准备。材料与方法1实验材料与仪器1 1 材料：n r l 单克隆抗体m a b 3 6 3m i l l i p o r e 公司噬菌体表面衣壳蛋白i i i 展示的随机1 2 肽库p h d 1 2n e b 公司p h a g ed i s p l a yl i b r a r i e s大肠杆菌e r 2 7 3 8n e b 公司四环素t e t r a c y c l i n e ，t e t购自上海生工标准琼脂糖b 1 0 w e s t低熔点琼脂糖b 1 0 、脆s t牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a )购自上海生工t w e e n 2 0购自上海生工p e g 8 0 0 0购白上海生工酵母提取物( y e a s te x t r a c t )购自上海生工r 胰蛋白脉( 哪p t o n e )甘氨酸甘油t e购自上海生工购自上海生工购自上海生工购白上海生工1 2 主要试剂配制方法1 2 1l b 液体培养基( l u r i a b e r t a n i ，l b ) 制备：1 ) 称取胰蛋白胨( 研p t o n e ) 1o g ，酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 5 9 ，n a c l5 9 ，溶于9 5 0 m l 去离子水中。2 ) 用5 m l n a 0 h 调p h 至7 5 。3 ) 加去离子水至总体积1 升，高压下蒸气灭菌2 0 分钟。1 2 2l b 一四环素( t e t r a c y c l i n e ，t e t ) 固体培养基制备：1 ) 四环素储存液( t e t - s t o c k ) ：称取o 1 9 四环素溶解于5 m l 无水酒精( 终浓+ 度是2 0 m g m 1 ) ，充分振荡混匀，2 0 。c 避光保存。2 ) 在1 2 1l b 液体培养基中每升加1 5 9 琼脂粉，高压灭菌2 0 分钟。3 ) 在超净工作台中，将上述液体冷却到7 0 0 c ，每升加入1 m lt e t s t o c k ，充分混匀后，约3 0 m 1 倒入9 0 m m 直径的无菌培养皿，缓慢冷却至培养基凝固。4 ) 将固体培养基倒置3 7 0 c 恒温箱中1 4 h ，4 0 c 避光保存。1 2 3l b i p t g x g a l 固体培养基制备1 ) i p t g x g a l ：称取1 2 5 9i p t g 和1 9x g a l 溶解于2 5 m l 二甲基甲酰胺中，2 0 0 c 避光保存。2 ) 在1 2 1l b 液体培养基中每升加1 5 9 琼脂粉，高压灭菌2 0 分钟。3 ) 在超净工作台中，将上述液体冷却到7 0 。c ，每升加入l m l i p t g x g a l ，充分混匀后，约3 0 m l 倒入9 0 m m 直径的无菌培养皿，缓慢冷却至培养基凝固。4 ) 将固体培养基倒置3 7 。c 恒温箱中1 4 h ，4 。c 避光保存。1 2 4 顶层琼脂凝胶：每升含1 0 9 胰蛋白胨，5 9 酵母提取物，5 9n a c l ，7 9琼脂粉，调p h 至7 5 ，5 0 m 1 分装。高压灭菌，室温保存。用时微波炉融化。1 2 5 封闭缓冲液：o 1 m n a h c 0 3 ( p h8 6 ) ，5 m g m l b s a ，o 0 2 n a n 3 。过滤除菌，4 0 c 贮存。1 2 6t b s ：5 0 m mt r i s h c l ( p h7 5 ) ，1 5 0 m 】n a c l 。高压灭菌，室温贮存。1 2 7p e g 瓜a c l ：2 ( w v ) p e g 8 0 0 0 ，2 5mn a c l 。高压灭菌，室温贮存。1 2 8 碘化物缓冲液：1 0 m mt r i s h c l ( p h8 0 ) ，l m me d t a ，4 mn a i 。室温避光保存。1 2 9 非特异性洗脱缓冲液：o 2 mg l y c i n e h c l ( p h2 2 ) ，1 m g m lb s a ，过滤除菌。1 2 1 0 抗体稀释液：n a h c 0 3 溶液，p h8 6 ，浓度o 1 m ，过滤除菌。1 3 主要实验仪器：s w c j 1 f 超净工作台苏州净化设备有限公司s o r v a l lb i o 凡g es t r a t o s 低温高速离心机g e r m a n yd l 1 0 1 4 恒温干燥箱b s 2 i 恒温水浴箱f o r m a 一8 6 0 c 超低温冰箱微量加样器e p p e n d o r f上海科析试验仪器厂北京医疗设备厂u s ag e r m a n y电泳仪l a s 3 0 0 0 凝胶成像仪细菌培养箱恒温空气浴摇床高速离心机蛋白核酸定量( n d 一10 0 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r )超低温冰箱f o m a 8 6 c立式电热压力整齐灭菌器l d z x 4 02 实验方法2 1 噬菌体滴度测定方法北京六一仪器厂日本富吉公司上海一恒科学仪器有限公司华利达实验设备公司日立公司u s au s a上海申安医疗器械厂2 1 1 接种e r 2 7 3 8 单菌落于5 l om ll b 培养基中，摇床培养( 2 5 0 r p m ，3 7 。c )至对数生长中期( 0 d 6 0 0 约为o 5 ) 。2 1 2 细胞生长时，微波炉融化顶层琼脂，3 m l 管分装，每个噬菌体稀释度一管。保存于4 5 0 c 5 5 0 c 水浴箱备用。2 1 - 33 7 。c 预温l b i p t g x g a l 平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。2 1 4 用l b 培养基1 0 倍比稀释噬菌体。稀释倍数：扩增的噬菌体培养物上清：l o8 1 0 1 1 ；未扩增的淘选洗脱物：1 0 1 1 0 4 。每次稀释都换用新的加样枪头，以免交叉污染。2 1 5 当菌体培养物e r 2 7 3 8 达对数生长中期时，分装至微量离心管中，每管2 0 0 p 1 ，每个噬菌体稀释度一管。2 1 6 每管加入l o p l 不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育l 5 m i n 。1 1 2 1 7 将感染细胞加入4 5 0 c 预温的上层琼脂培养管中，每次管，快速涡旋混匀，立即倾倒于3 7 。c 预温的l b i p t g x g a l 平板上。适当倾斜平板使顶层琼脂凝胶均匀铺开。2 1 8 待平板冷却5 m i n 后，于3 7 0 c 孵箱倒置过夜培养。2 1 9 噬斑计数以噬斑数为1 0 0 左右的平皿为准，噬斑数乘以稀释度就是每l o “l 噬菌体的滴度- 噬斑形成单位p m 。2 2 噬斑的扩增2 2 1 挑取e i 迎7 3 8 单菌落于l b t e t 培养基中培养过夜。2 2 2 将上述e r 2 7 3 8 过夜培养物l ：1 0 0 稀释接种于l b 培养基，分l m l 到培养管中。每个要鉴定的克隆一管。2 2 3 用灭菌牙签，穿刺接种分隔较好的蓝色噬菌斑到上述1 m l 上述培养管中。注意：从总量不到1 0 0 个噬菌斑的平板上挑选，从而保证每个噬斑仅包含单个d n a 序列。2 2 43 7 。c 摇床2 5 0 印m 培养4 5 5 小时( 不要过长) 。2 2 5 将培养物转入1 5 m l 微量离心管中，1 4 0 0 0 叩m 离心3 0 秒。上清转入一新的离心管中，再离心用移液枪将8 0 的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮存液，可以4 0 c 贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1 ：1 稀释后，2 0 0 c 贮存。2 3 测序模板的快速纯化2 3 1 按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将5 0 0 “l 含噬菌体的上清转入一新鲜离心管。2 3 2 加2 0 0 “lp e g n a c l 。颠倒混匀，室温静置1 0 分钟。2 3 31 4 0 0 0 叩m ，4 。c 离心1 0 分钟，弃上清液。2 3 4 短暂离心，小心吸去残余上清。2 3 5 沉淀物彻底重悬于l o o p l 碘化物缓冲液中，加入2 5 0 p 1 乙醇。室温孵育l o 分钟，可以选择性地沉淀单链噬菌体d n a ，而大部分噬菌体蛋白保留在溶液中。2 3 61 4 0 0 0 叩m ，4 。c 离心1 0 分钟，弃上清。用5 0 0 “l7 0 乙醇洗沉淀物，重新离心，弃上清，室温风干。2 3 7 沉淀重悬于3 0 肛lt e 溶液中。；2 3 8 将上述5 “l 模板用来测序。2 3 9 测序之后，分析结果，将含有共有序列的噬菌体上清加入5 0 的灭菌甘油，2 0 0 c 保存。2 4 特异性结合噬菌体的生物淘选2 4 1 将试剂盒中提供的e i 也7 3 8 菌株划线培养于l b t e t 固体培养基中，温箱中3 7 0 c 培养过夜。第二天取出平板，4 。c 冰箱中避光保存。2 4 2 用o 1 mn a h c 0 3 溶液稀释m a b 3 6 3 ，使其形成1 0 0 p m l 的靶分子溶液。2 4 3 包被：准备一个9 6 孔酶标板，取上述稀释好的m a b 3 6 3 溶液1 5 0 “l 加入一个孔，重复涡旋直到表面完全湿润( 这一步一定要多注意，尽量避免形成液珠) 。2 4 4 在湿盒中，4 。c 温和( 5 0 叩m ) 震荡，孵育过夜。2 4 5 挑e i 也7 3 8 单克隆( 噬菌体滴度测定时用来铺板的细菌培养物) 于1 0 m ll b 液体培养基中。3 7 0 c ，2 5 0 q ) m 震荡培养过夜。2 4 6 将过夜培养的菌液保存于4 0 c 。2 4 7 封闭：倒掉酶标孔中的包被液，将酶标板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。将包被孔加满封闭缓冲液，4 0 c 孵育至少1 h 。2 4 8 用力拍甩以除去封闭缓冲液。用t b s t ( t b s + o 1 v v 】t w e e n 2 0 ) 缓冲液快速冲洗6 次。每次均需反复旋转确保孔的底部及边缘均被沈到，倾倒除去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍击以除去残余溶液。这一步操作要快以避免孔干燥。( 注意每次更换纸巾，以免交叉污染) 。2 4 9 结合：用1 0 0 “l 的t b s t 缓冲液稀释噬菌体( 即l p l 的原始文库，含1 0 1 0 p 如) ，然后加至已包被好的孔中，室温温和摇动6 0 m i n 。2 4 1 0 倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。2 4 1 l 按照2 4 8 步骤所述用t b s t 缓冲液洗板1o 次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。2 4 1 2 向孔中加入1 0 0 “i 非特异性洗脱缓冲液分离己结合的分子，室温温和摇动( 不要超1 0 分钟) ，将洗脱液转入一个干净1 5m l 的微量离心管中。然后再加入1 5 “l 的1 mt r i s h c l ( p h9 1 ) 中和上述洗脱液。这就是m a b 3 6 3 第一轮筛选的沈脱物。2 4 1 3 取3 “l 的洗脱物，根据2 1 所述步骤测定洗脱物滴度。2 4 1 4 剩余洗脱物的扩增：将剩余洗脱物加入装有2 0 m le i 毪7 3 8 培养物的2 5 0 m l 锥形瓶中，3 7 0 c 剧烈摇动培养4 5 h ，转速为2 5 0 r p m 。2 4 15 将培养物转入一5 0 m l 离心管中，然后，4 。c1 2 0 0 0 r p m ，离心1om i n 。上清液转入另一5 0 m 1 离心管中，再次离心。2 4 1 6 将上清的上部8 0 转入一新的离心管中，加入1 6 体积的p e g n a c l 。让噬菌体4 0 c 沉淀至少6 0 m i n ，最好过夜。2 。4 1 74 。c ，1 2 0 0 0 叩m 离心过夜p e g 沉淀1 5 m i n 。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液，管壁上会有苍白色的噬菌体碎片。2 4 1 8 将沉淀物重悬于1 m lt b s 中，悬液转入1 5 m l 离心管中，4 0 c1 4 0 0 0 印m离心5 m i n 使残余细胞沉淀。2 4 19 上清转入另一新鲜1 5 m l 离心管，用1 6 体积的p e g n a c l 再沉淀。冰上孵育15 6 0 m i n 。4 。c ，1 4 0 0 0 叩m 离心1 0 m i n ，弃上清，再1 4 0 0 0 叩m 短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。2 4 2 0 沉淀物重悬于2 0 0 lt b s ，o 0 2 n a n 3 中。离心1 m i n ，将上清转入新的离心管中。此即为抗体m a b 3 6 3 第一轮扩增后的洗脱物。2 4 2 l 根据2 1 所述步骤测定平板测定扩增后的沈脱物的滴度。4 0 c 避光贮存平板。2 4 2 2 重复步骤2 4 1 2 4 21 ，进行下一轮筛选。注：一共筛选三轮。第二轮和第三轮洗脱液中t b s t 中t w e e n 2 0 的浓度为o 5 ，结合时间为4 5 m i n 。2 5 第三轮洗脱物不再扩增，挑取噬菌斑，按照2 2 扩增噬斑后，按照2 3 步骤提取d n a 模板，送上海生工测序。结果1m a b 3 6 3 抗原表位筛选特异性结合噬菌体的富集结果：每1 轮筛选中，洗脱液的噬菌体产量与投入的噬菌体总量之比值，反映了特异性结合噬菌体的富集程度。从表1可见，随着筛选轮次的增高，每一轮相对产率( 产出投入) 也在增高，说明每一轮筛选后与n r l 单抗特异性结合噬菌体得到富集。表1n r lm a b 噬菌体肽库的筛选1 a b l e1s c r e e no fp h a g ed i s p l a yp e p t i d el i b r a r yw i t hn rlm a b2m a b 3 6 3 抗原表位筛选序列测定及结果分析从第3 轮噬斑数为5 6 的平板上挑取所有5 6 个克隆，按试剂盒说明提取单链d n a ，经琼脂糖电泳鉴定d n a 纯度( 图1 ) ，进行d n a 序列测定，根据核苷酸序列得到相应的氨基酸序列( 表2 ，图2 ) ，共出现3 种序列，其中d d w v i s t q s l k s 出现频率最高( 5 4 5 6 ) ，可能是优势克隆或特异性克隆。图lm 1 3d n a 电泳图f 嘻l 姆d n a 洳i l i 蛔r c h 舡叫喊表2 筛选所得核苷酸及氨基酸序列t a b l e 2 a m i n 0 i d 辩q l 撇o f t kb i 司j n gd 吣懿氦基酸序列出现频率d 】d w s r q s l k s5 4n 盯嗍r m m sl图2m 1 3 测序结果图吓划线部分为目的片段)f i 啦d 1 蛆蹦驴髓c 吨r 酏0 f b 啦坶i u l 汕删p 砸0 f l h e 嘲q u 舶c c )1 7 讨论一抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个b 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体( m o n c l o n e觚t i b o d y n 认b ) 。i i 认b 具有高度特异性，利用i i 认b 开展蛋白质抗原表位的研究，对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义【2 1 1 。噬菌体展示的随机肽库是将随机十二肽融合到m 1 3 噬菌体次要衣壳蛋白( p i ) 上，将外源多肽与噬菌体的次要衣壳蛋白融合表达，融合蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸，十二肽后面是一段短小的间隔肽g l y - g l y - g l y - s e r ，然后是野生型p 蛋白。每个噬菌体表面只展示一种序列的外源肽，并保持其相对的空间构象和生物活性，而编码这个融*合蛋白的d n a 则位于该噬菌体内，从而使多肽与其d n a 序列之间建立了直接联系。该文库含有大约1 2 8 1 0 9 个电转化序列。外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，通过表型筛选就可以获得其编码基因。由于噬菌体展示技术是利用生物分子间的相互作用来筛选功能分子，经特定配体分子的亲和筛选，即可得到与配体特异结合的噬菌体克隆，并确定与配体特异结合的相应氨基酸组成及其关键性氨基酸序列，因此在疾病的诊断、治疗和疫苗研制中具有重要意义陇。2 引，证明获得表位的有效方法之一是通过抗体筛选噬菌体随机肽库。噬菌体肽库筛选的抗原表位有时与天然表位在氨基酸顺序上可能不一致，g e y s e n 将这种短肽称之为“模拟表位 i i l l o t o p e ) 。本研究洗脱特异性结合的噬菌体，再将洗脱的噬菌体进行扩增，然后进行下一轮的结合、沈脱、扩增循环，经过3 轮筛选后，与靶分子特异性结合的噬菌体得到了充分富积。筛选噬菌体随机肽库成功的关键是肽库的完整性及筛选方法是否正确。由于噬菌体肽库中每种噬菌体抗体的拷贝数很少，因此第一轮选择条件要尽量采用非严谨条件而在其后筛选中增加的严谨性。第一轮筛选要投入较大的文库，以保证经过第一轮筛选后其中展示我们需要的肽的噬菌体所占比例较原始文库高。另外，通过调控影响靶分子与噬菌体特异性结合的因素增加第二轮和第三轮筛选的严谨性：清洗剂( t w e e n 2 0 ) 浓度：第一轮筛选时低浓度的t w e e n 2 0 可以保证较高的结合噬菌体滴度，第二轮和第三轮增加t w e e n 2 0 浓度以增加靶分子和噬菌体结合的特异性。第二轮和第三轮缩短靶分子与噬菌体结合时间以增加结合的特异性。在筛选方法方面，淘沈次数多少也很重要，次数太少可能筛不到目的克隆，次数过多可能会出现一些非特异性克隆的干扰，本实验共淘洗三次。降低靶分子浓度可以增加结合的特异性。综上所述，本实验成功地用n r l 单克隆抗体从噬菌体随机十二肽库中成功筛到了能与n r lm a b 抗体结合的短肽，氨基酸序列为d d 、w i s t q s l k s ，此短肽可能模拟了天然抗原的某个表位。第二部分n r l 抗原t 爪融合蛋白真核表达质粒的构建血脑屏障的存在使得很多大分子生物制剂不能进入大脑，大脑因而成为免疫屏蔽区。t 依抗体是目前研究较多的协助大分子物质通过血脑屏障的物质。因此，合成小鼠t 侬的c d s 序列与实验前期筛选出的小鼠n r lm a b 抗原表位优势克隆融合表达d n a 片段，就可能制备出其产物能携带n r l 抗体通过血脑屏障的表达载体，实现中枢神经受体自身抗体透过血脑屏障的目的，使n r l 口服疫苗的研制成为可能。材料和方法1实验材料与仪器1 1 材料：限制性内切酶印，2 if e r m e n t a s 公司限制性内切酶勋口if e m e n t a s 公司限制性内切酶胁，2 d i i if e r m e n t a s 公司t 4d n a 连接酶f e m l e n t a s 公司m a k e r 0 r a n g e r p l e r t m 5o o b pd n al a d d e rf e m e n t a s 公司m a k e r 0 r a n g e r “l e r t m1o o o b pd n al a d d e rf e r m e n t a s 公司凝胶回收试剂盒o m e g a 公司小量质粒提取试剂盒o m e g a 公司标准琼脂糖b i o w e s t低熔点琼脂糖b i o 、e s t酵母提取物胰蛋白脉甘油真核表达载体p c d n a 3 1空载质粒p u c 5 7购自上海生工购自上海生工购自上海生工由本校神经生物学教研室王特为教授惠赠由本校神经生物学教研室王特为教授惠赠1 2 主要试剂配制方法1 2 1l b 液体培养基( l u r i a b e r r t a n i ) 制备：1 ) 称取胰蛋白胨( 珂p t o n e ) 1o g ，酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 5 9 ，n a c l5 9 ，溶于9 5 0 m l 去离子水中。2 ) 用5 m l n a o h 调p h 至7 5 。3 ) 加去离子水至总体积l 升，高压下蒸气灭菌2 0 分钟。1 2 2l b - 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ，a m p ) 固体培养基制备：1 ) 氨苄青霉素储存液( a m p s t o c k ) ：称取l g 氨苄青霉素溶解于1o o m l 去离子水中( 终浓度是1 0 m g m 1 ) ，充分振荡混匀，2 0 。c 保存。2 ) 在1 2 1l b 液体培养基中每升加1 5 9 琼脂粉，高压灭菌2 0 分钟。3 ) 在超净工作台中，将上述液体冷却到7 0 。c ，每升加入o 5 m la m p s t o c k ( 终浓度是5 0 “m 1 ) ，充分混匀后，约3 0 m l 倒入9 0 m m 直径的无菌培养皿，缓慢冷却至培养基凝固。4