（基础兽医学专业论文）ige核酸适体生物传感器的研究.pdfVIP

摘要随着分子生物学和基冈i 。科领域的迅速发展，研究的不断深入，人人推动了对核酸的研究，人们对核酸的研究已经相当深入。利_ = j 寡核苷酸间的严格的识别和亲和力而设计的人l ：合成寡核营酸一适体( a p t a m e r ) 的出现，使抗体抗原反虑发生新的革命性变化，弥补了现有抗体的不足。也为传统免疫传感器发展开辟了一条新的道路。电化学阻抗适体阵列传感器就是一种全新的思路和尝试，与传统的监测技术相比，传感器具有快速、灵敏、操作简单，并具有分子识别功能。为此本实验以人免疫球蛋向e ( i g e ) 及其d n a 核酸适体为模型体系，在电极表面通电与不通电的方式将巯基修饰的适体【制定在光刻金阵列电极表面。通过电化学阻抗检测技术测定了适体修饰电极与人i g e 二者相互作用后阻抗值的变化关系。为今后高通餐阵列核酸适体传感器的定向、快速阉定探索一条新的途径。1 无标记电化学阵列传感器电极基底为i i 英，面积为3 6 m m 2 6 m m 。采 照相平板印刷的方法通过蒸镀使其沉积在涂有5 0 埃厚的铬的表面，沉积厚度为2 0 0 纳米每个| 作电极人小为2 m m 2 m m 。孵育电极面积为5 m m 5 m m 。在每次向定生物分子之前，芯片浸入浓p i r a n h a 酸溶液中3 0 分钟使其除去氧化层使用前清洗干净。将禽有2 4 孔的聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 覆盖在芯片表面，2 4 个】作电极从2 4 个孔中露出。在2 4 个金电极上每个加入1 5ul 适体溶液。放在湿盒内过夜使适体同定在芯片表面。适体i 矧定，| 亓，每个电极刚t e 缓冲液冲洗，水洗，氮气吹干，_ l | ；丁电化学测量。通过条件优化实验，加入、r 胱胺小分子浓度在0 1 m m o l l ，适体分子的定时间为9 0 分钟蛋白在芯片表面孵育时间达到9 0 分钟，可取得最佳实验效果。人i g e 的浓度检测限在0 i n m o l l ( 5f m o l 在5 0ul 样品内) 每个浓度实验重复4 次，在浓度范同5 o - i 0 0n m o l l芯片表面阻抗变化具有良好的重复性，平均相对标准偏若为7 4 。特异性实验中修饰适体斤芯片阻抗值为4 5 2 1 5 27 1q ，作川非特异性蛋白人i g g 后阻抗值为5 3 2 6 64 8 q ，而作州特异性蛋白人i g e 后阻抗值为9 7 8 1 5 25 5 q 著异显著。与i g e 抗体免疫传感器的灵敏性进行了比较，金电极表面首先修饰了抗人i g e 抗体。i g e孵育到i g e 抗体修饰的芯片表面l 小时斤，和背景相比检测信号增加4 2 4 。而i g e 适体修饰的芯片表面当孵育5 0n m o l li g e l 小时，雨背景相比检测信号增加2 1 6 4 ，结果筹异显著。和单链核酸适体传感器相比，杂交斤彳舣链适体闻定在芯片表面阻抗值5 4 6 + _ 9 9 1 5 q ，作用人i 酊及i g e 后阻抗值分别为7 5 6 7 5 3 7 q ，8 1 6 5 94 1 q ，作川蛋白后阻抗变化不明显，著异不显著。特异性实验结果由原子力显微镜进行了验证，显微镜幽象与芯片阻抗变化结果吻合2 电寻址适体阵列传感器通过条件优化实验，周定适体的电压范同在一0 2 v o6 v ，通电时间5 分钟，扫描速率5 0 m v s 时，适体【嗣定效果最佳。我们选择四种结构相似，序列组成不同的适体问定到电极芯片表面，米验证电极芯片与生物分子作崩的通性及比较不同结构适体与i g g 蚩向作川的亲和力强弱。同定适体厉电极v的阻抗值分别为4 1 3 1 2 q ，4 1 5 - - + 8 4 q ，3 8 8 1 7 5 q ，5 0 8 1 4 0 q 。作用人i g e 后阻抗值分别为1 8 9 0 4 6 7 q ，1 4 3 3 1 1 5 q ，1 4 5 0 5 0 7 q 1 4 5 0 2 5 9 q 。研究了适体上发卡环结构的不同对适体与人i g e 相互作用的影响。将适体序列i 及序列v 固定到芯片电极表面，并检测了其同定及作用人i g e 后阻抗值，发现适体发膏环碱基结构对适体与人i g e 蛋白作用影响显著。特异性实验结果由原子力显微镜进行了验证，显微镜图象与芯片阻抗变化结果吻合结论：1 我们研制了适体基础的电化学阻抗传感器。和传统的免疫传感器相比适体基础的传感器在传感性能上显示出更大的优势。2 适体的同定是适体生物传感器制备中极其重要的一步。通过以上实验，我们取得了电寻址嘲定方法的最佳条什，为微阵列生物传感器的制备提供了新的思路平技术基础。关键词适体；生物传感器：芯片；电化学vt u d i e so fe l e c t r o c h e m i c a lh u m a ni g ea p t a m e rbi o s e n s o ra b s t r a c tw i t ht h em o l e c u l a rb i o l o g ya n dg e n ee n g i n e e r i n gq u i c k l yd e v e l o p i n ga n da ni n - d e p t hr e a e a r c h i n g ，i ti sg r a e t l yd r i v i n gn u c l e i ca c i dr e s e a r c h t h ea p t a m e ram a n - m a d en u c l e i ca c i dh a sas t r i c t l yd i s t i n g u i s h i n ga n da f i n i t ya b i l i t i e s ，w h i c hh a sar e v o l u t i o n a r yc h a n g ei na n t i b o d y a n t i g e n er e a c t i o n sa n da l s oa f f e c t st h ea n t i b o d y sd e f i c i e n c y s i td e v e l o p e dan e ww a yf o rt h et r a d i t i o n a li m m u n es e n s o rd e v e l o p m e n te l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c ea p t a m e ra r r a ys e n s o ri san e wi d e aa n da t t e m p t m e n t c o m p a r e sw i t ht r a d i t i o n a lt e c h n o l o g y , t h ee l e c t r o c h e m i c a la p t a m e rs e n s o rh a st h ea d v a n t a g e so fr a p i d i t y 、s e n s i t i v i t y 、e a s y - u s i n ga n dh a st h em o l e c u l a rr e c o g n i t i o nf u n c t i o n i nt h ee x p e r i m e n t ，w ec h o s e dt h eh u m a ni g ea n di t st h ed n an u c l e i ca c i dh u m a ni g ea p t a m e ra sam o d e ls y s t e m t h ea t a m e rw a si m m o b i l i z e do i lt h eg o l d e na r r a ye l e c t r o d es u r f a c et h r o u g he l e c t r i ca d d r e s s i n gm e t h o d so rn o t ，t h e nw em e a s u r i n gt h ei m p e d a n c ev a l u e sb e f o r ea n da f t e ri n t e r a c t i o nw i t hh u m a ni g ea n dr e s e a r c ht h ei m p e d a n c ev a l u e sc h a n g ei nd i f f e r e n tc o n d i t i o n st h ep r e s e n t e dr a p i da n do r i e n t e da p t a m e ri m m o b i l i z e dm e t h o dw i l lb e n e f i tf o rt h ef a b r i c a t i o no fa p t a m e ra r r a ye l e c t r o d e s 1 l a b e l f r e ee l e c t r o c h e m i c a la p t a m e r - b a s e da r r a ys e n s o rt h ee l e c t r o d ep a t t e r nw a sf o r m e do nac r y s t a lw a f e rs u b s t r a t e ( 3 6 m m x 2 6 m m ) a2 0 0a mt h i c kp h o t o i i t h o g r a p h i cg o l df i l mw a sp r e p a r e db yv a p o rd e p o s i t i o n ，w i t ha nu n d e r l a y e ro fc h r o m i u m ( 5 0a 、o nt h es u b s t r a t e t h ed i m e n s i o no fe a c hg o l dw o r k i n ge l e c t r o d ew a s2 m m 2 m m p r i o rt ot h em o d i f i c a t i o n ，t h ec h i pw a si m m e r s e di nap i r a n h as o l u t i o n ( h 2 s 0 4 h 2 0 2 ：3 1 ) f o r3 0m i n u t e sa n dt h e nr i n s e dt h o r o u g h l yu s i n gw a t e ra n de t h a n 0 1 ah o m e c o n s t r u c t e dp o l y ( d i m e t h y l s i i o x a n e ) ( p d m s ；d o wc o m i n gi n c ) f l a m ec o n t a i n i n g2 4 一m i c r o w e l l sw a st h e na l i g n e do n t ot h ee l e c t r o d e ss u c ht h a te a c hw e l lc o u l de x a c t l ym a t c ht h ew o r k i n ge l e c t r o d e s p r i o rt ot h ei m m o b i l i z a t i o n ，a10g ms o l u t i o no ft h ea p t a m e ro rt h es c r a m b l e ds e q u e n c e sw a sm i x e dw i t h10 0p mc y s t e a m i n e ( t r i s - h c ib u f f e r ，p h7 4 ；im me d t a ，0 2mn a c i ，a n d1 0 0m md t t ) t om o d i f yt h ee l e c t r o d e s ，t h er e s u l t i n gs o l u t i o nw a st r a n s f e r r e di n t ot h er e l a t i v em i c r o w e l l so ft h ep d m sf l a m ea n ds u b s e q u e n t l yi n c u b a t e dw i t ht h eg o l de l e c t r o d e so v e r n i g h t a f t e rt h ei m m o b i l i z a t i o n ，t h ep d m sf r a m ew a sr e m o v e d ，a n dt h ea p t a m e r m o d i f i e dc h i pw a sr i n s e db yp h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ( p b s ；13 7m mn a c i ，3m mk c i ，10m mp h o s p h a t e ，p h74 ) ，f o l l o w e db yr i n s i n gw i t hd e i o n i z e dw a t e r t h er i n s e dc h i p sw e r et h e nd r i e du n d e ras t r e a mo fn i t r o g e n a tl a s t ，t h ec t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p ym e a s u r e m e n t sw e r ep e r f o r m e d t h r o u g ht h ec o n d i t i o no p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t s ，a tt h ec o n d i t i o no ft h ec y s t e a m i n em o l e c u l ec o n c e n t r a t i o no i m m o l l ，t h ei m m o b i l i z a t i o nt i m e9 0m i n u t e s ，t h eh u m a ni g ei n c u b a t i o nt m e9 0m i n u t e s ，t h ee x p e r i m e n tc a na c h i e v e dt h eb e s tr e s u l t s 东北农业大学教学顿i 学位论文a c c o r d i n gt ot h eo p t i m i z a t i o no ft h ei n c u b a t i o nc o n d i t i o n s ，ad e t e c t i o nl i m i to fa p p r o x i m a t e l y0 1n mr 5f m o li na5 0p ls a m p l e ) w a so b t a i n e do nt h eb a s i so ft h es i g n a l t o n o i s ec h a r a c t e r i s t i c sw h e nt h ei n c u b a t i o nt i m ei n c r e a s e dt o9 0m i n as e r i e so ff o u rr e p e t i t i v em e a s u r e m e n t so fl g es o l u t i o na tc o n c e n t r a t i o n so f o 1 ，o 5 ，2 5 ，5 0 ，1 00 ，2 5 0 ，5 0 0 ，a n d1 0 0n mw a su s e df o re s t i m a t i n gt h ep r e c i s i o na n dy i e l d e da c c e p t a b l e ，r e p r o d u c i b l es i g n a l s t h ea v e r a g eo ft h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s7 6 6 i nt h es p e c i f i c i t ye x p e r i m e n t ，t h ei m p e d a n c ei s4 5 2 1 5 2 7 1 2 a f t e ri m m o b i l i z e da p t a m e r , a n dt h ei m p e d a n c ew e r e5 3 2 6 6 4 8 q 、9 7 8 士15 2 5 5 0 a f t e rr e s p e c t i v e l yi n t e r a c t e dw i t hh u m a ni g ga n dh u m a ni g e i th a sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c e c o m p a r e dw i t ht h ea n t i b o d yi m m u n es e n s o r ，i no u re x p e r i m e n t s ，w h e n5 0n m g es a m p l ew a si n c u b a t e dw i t ht h ea n t i b o d y m o d i f i e de l e c t r o d e s ，t h ea v e r a g ei m p e d a n c ev a l u e sw e r ei n c r e a s e dt o3 2 5 0 nf r o m2 5 3 0 no ft h eb a c k g r o u n d t h ed e t e c t e ds i g n a li n c r e a s e db y4 24 r e l a t i v et ot h eb a c k g r o u n d t h ea v e r a g ei m p e d a n c ev a l u e so ft h ea p t a m e r m o d i f i e de l e c t r o d e s ，o nt h eo t h e rh a n d ，w e r ei n c r e a s e dt o9 7 8 qf r o m4 5 2 no ft h eb a c k g r o u n d ，a2 1 6 4 i n c r e a s e m e n tr e l a t i v et ot h eb a c k g r o u n d h e n c e ，i m p e d a n c es p e c t r o s c o p yw o u l db ea ne x t r e m e l ya t t r a c t i v ed e t e c t i o na p p r o a c hf o r t h ea p t a m e r - b a s e db i o s e n s o r s c o m p a r e dw i t ht h es i n g l en u c l e i ca c i da p t a m e rs e n s i r t h ei m p e d a n c ei s5 4 6 士9 9 15 nw h e nt h eh y b r i d i z e da p t a m e ri m m o l i z e do nt h ee l e c t r o d e a n dt h ei m p e d a n c ew e r e7 5 6 士7 5 3 7 q 、8 1 6 士5 9 4 1 f l a f t e rr e s p e c t i v e l yi n t e r a c t e dw i t hh u m a ni g ga n dh u m a ni g e t h es p e c i f i c i t ye x p e r i m e n tr e s u l th a sc a w i e do nt h ec o n f i r m a t i o nb yt h ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，t h em i c r o s c o p ei m a g ea n dt h ec h i pi m p e d a n c ec h a n g er e s u l tt a l l i e s2 e l e c t r i ca d d r e s s e da p t a m e ra m ys e n s o rt h r o u g ht h ec o n d i t i o no p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t s ，a tt h ec o n d i t i o no ft h ea p t a m e ri m m o b i l i z a t i o nv o l t a g es c o p e o 2 v _ o 6 v , i m m o l i l i z a t i o nt i m e5m i n u t e s ，s c a nr a t e s5 0 m v s ，t h ea p t a m e rc a na c h i e v e dt h eb e s ti m m o b i l i z a t i o nr e s u l t s i no r d e rt ot h ec o n f i r m e dt h ee l e c t r o d eg e n e r a l i t ya n dc o p m p a r e dt h ea f f i n i t ys t r e n g t ho fd i f f e r e n th u m a na p t a m e ri n t e r a c t i o nw i t hh u m a nl g e ，f o u rk i n d sa p t a m e r sw i t hs i m m i l a rs t r u c t u r e sb u t d i f i e r e n tb a s ec o m p o s m e n tw e r ei m m o b i l i z e do nt h ee l e c t r o d ec h i ps u r f a c e t h ei m p e d a n c ev a l u e s b e f o r ei n t e r a c t i o nw i t hh u m a nl g ew e r e4 1 3 1 2 q ，4 1 5 8 4 f ! ，3 8 8 士1 7 5 q ，5 0 8 1 4 0 x q a n da f t e ri n t e r a c t i o nw i t hh u m a ni g ew e r e1 8 9 0 士4 6 7 f 2 ，1 4 3 3 1 1 5 q ，1 4 5 0 5 0 7 f ! ，1 4 5 0 士2 5 9 f ! t h er e s u l t si n d i c a t e dd i f f e r e n ta p t a m e rc a ns i m u l t a n e i t yi m m o b i l i z e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c ea n da l lt h ea p t a m e ri m p e d a n c es i n g a id o n tr e d u c eb e f o r ea n d a r e ri n t e r a c t i o nh u m a ni g e w es t u d i e dt h ei n f l u e n c eo f d i f f e r e n th a i r p i ns t r u c t u r eo f a p t a m e r si n t e r a c t e dw i t hh u m a ni g e t h es e q u e n c eia n dvw e r ei m m o b i l i z e do nt h et h ee l e c t r o d es u r f a c e ，a n dt h ei m p e d a n c ev a l u ew e r em e a s u r e db e f o r ea n da f t e ri n t e r a c t i o nw i t hh u m a nl g e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea p t a m e rh a i r p i ns t r u c t u r e sh a sg r e a te f f e c t so nt h ea p t a m e ri n t e r a c t i o nw i t hh u m a nl g e vt h es p e c i f i c i t ye x p e r i m e n tr e s u l th a sc a r r i e do nt h ec o n f i r m a t i o nb yt h ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，t h em i c r o s c o p ei m a g ea n dt h ec h i pi m p e d a n c ec h a n g er e s u l tt a l l i e s c o n c l u s i o n ：o nt h ew h o l e ，1 ，w ed e v e l o p e daa p t a m e r - b a s e de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r u ms e n s o r i th a sag r e a ta d v a n t a g ei ns e n s o rc a p a b i l i t yc o m p a r e dw i t hi m m u n es e n s o r t h ea p t a m e ri m m o b i l i z a t i o ni sai m p o r t a n ts t e pi na d t a m e 卜b i o s e n s o rp r e p a r a t i o n t h r o u g ht h ee x p e r i m e n t s ，w eg o tt h eb e s tc o n d i t i o ni ne l e c t r i c i t ya d d r e s s i n gi m m o b i l i z e da p t a m e r , a n di tp r o v i d e dan e wi d e aa n dt e c h n o l o g yf o rm i c o a r r a ya p t a m e rs e n s o r k e yw o r d s ：a p t a m e r ；b i o s e n s o r ；c h i p ；e l e c t r o c h e m i c a lm a s t e rc a n d i d a t e ：x ud a w e is u p e r v i s o r ：p r o f l i ux i j i em a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l eb i o t o g研究生学位论文独创声明和使用授权书独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得( 洼! 如退直墓丝盂曼挂别座明的! 奎拦丑窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：；泉犬蚌日期：护多年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：锹炜日期：妒年月名只导师签名：参f 噌 李日期：。z 年月f ，日”辫黔”m睁蠹睁饥审薹|r，。：。i，妇。r 尊*、1 引言1 1 研究的目的意义随着分子生物学和基因工程领域的迅速发展，研究的不断深入，特别是人类基因组计划的完成，大大推动了对核酸的研究，人们对核酸的研究已经相当深入。核酸的分离及分析在卫生防疫，医学诊断、药物筛选以及毒理研究等环境科学领域发挥着越来越重要的作用。利_ j 寡核苷酸问的严格的识别雨i 亲和力而设计的人l 合成寡核苷酸适体( a p t a m e r ) 的山现，使抗体抗原反应发生新的革命性变化，弥补了现有抗体的不足。也为传统免疫传感器发展开辟了一条新的道路。1 9 9 0 年美国的s z o s t a kj 和g o l dl 等各自独立地建立核酸文库，并逐步发展成一种从核酸文库里筛选出与配体高效、专一结合的d n a 或r n a 片段的指数富集配体系统进化( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no f1 i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t s e l e x ) 技术。适体是一段由2 0 一6 0 个碱基组成的单链寡核苷酸，能特异性地结合蚩向质、多肽、有机物、金属离子等各种配体( 沈倍奋，2 0 0 1 ) 。一种单链d n a 或r n a 能形成多种热力学稳定的空间结构，是筛选各类靶分子适体的基础。适体的优越性可! j 纳为以f ) l 点：( i ) 适体的制各过程不依赖于动物或细胞，而是在体外人一f ：合成的寡核营酸，可冈需要而加以改变。( 2 ) 适体可经筛选及修饰而使适合诊断试验的需要。( 3 ) 对动物或细胞不能耐受的毒物或免疫原性很低的物质也能制备出适体。( 4 ) 适体的化学合成，有极佳的准确性和重复性，有很高的纯度，几乎消除了适体制备的批间误差。( 5 ) 荧光、酶或生物素分子等功能团可修饰在适体的特定位置，也可解离j l 丁检测。( 6 ) 适体可耐受变性，且变性是可逆的。冈此1 r 常稳定，可长期贮存和常温运输( 郑凌，2 0 0 1 ) 。核酸适体和抗体相比具有以上的特点，而传统的抗体介导的免疫传感器的重复使用受限，需要温和的条件以免破坏抗体的功能，利川适体替代抗体作为生物传感器分子识别元件引起了人们极人的兴趣。近几年，众多的新兴生物分析技术，为发展高灵敏、高特异的生物分析传感器注入了活力。m o r i 等( 2 0 0 4 ) 通过b l a c o r e 技术研究了与肿瘤坏死冈子( t n f ) 受体家族中n f kb 受体激活冈子( r a n k ) 具有高亲和力的r n a 适体与r a n k 之间的相互作用，取得了良好的试验结果。p o t y r a i l o 等( 1 9 9 8 ) 将抗凝血酶d n a 适体3 端进行荧光标记共价联接到玻璃载体表面，溶液中的凝血酶可以通过标记的适体消火波诱导的荧光强度的改变被特异性地检测 出来。s c h l e n s o g 等( 2 0 0 4 ) 研制了白组装膜声波传感器，将凝血酶和逆转录肽同定到传感器界面表面，凝血酶的检测限在7 2 p g c m 2 ，逆转录肽在7 7 p g c m 2 ，亲和常数为5 0 0 n m 。i k e b u k u r o等( 2 0 0 5 ) 研究了以凝血酶为检测目标的凝血酶适体电化学传感器。他们选取分别作_ 【_ h 丁i 凝血酶不同位点的两种适体构建一种“三明治”式的检测蛋白模式。这种传感器检测凝血酶的最低检测限可以达到1 0 n i ，凝血酶浓度在4 0 n m l o o n m 时有很好的线性关系。电化学阻抗适体阵列传感器就是一种全新的思路和尝试，与传统的监测技术相比，传感器具有快速、灵敏、操作简单，并具有分子识别功能。为此本实验以人免疫球蛋向e ( i g e )及其d n a 核酸适体为模型体系，通过在电极表面通电与不通电的方式将巯基修饰的适体【刊定在光刻金阵列电极表面。通过电化学阻抗检测技术测定了适体修饰电极与人i g e 二者相互作j 【 = | 后阻抗值的变化关系。通过以上实验，我们在世界上首次应_ 【_ f j 电化学阻抗法建立了无标记东北农业大学农学硕 ：学位论文核酸适体阵列传感技术。建立了巯基修饰适体快速同定化技术，为今后高通量阵列核酸适体传感器的定向、快速同定打下了基础。1 2 适体的生物学特性及应用1 2 1 适体的制备及生物学特性1 2 1 1 适体的制备数十年来，免疫学诊断试验发展迅速，尤其是各种形式的标记免疫分析，其灵敏度已1 0 1 0 “g ，而其特异性的改善主要依靠抗体品种丰富和质量的提高。自单克隆抗体( 第二代抗体) 技术问世之后，免疫学诊断及治疗步入新的阶段，对医学及整个生命科学的发展做出巨大贡献。近年，基因工程抗体( 第三代抗体) 的成功应用已露端倪，人源单抗、噬菌体展示抗体库，半抗原或小分子抗体相继出现。利用核苷酸间的严格的识别和亲和力而设计的人r ：合成寡核苷酸一适体( a p t a m e r ) 的出现，使抗原抗体反应发生新的革命性变化，它弥补了现有的抗体的不足。a p t a m e r 一词源于拉j 文a p t u s 意即适合、配合，故泽为适体。其实质是人r 合成的寡核苷酸，它能与抗原分子特异地配合且能经过筛选找出与其最适合的配体，它不仅具有抗体的特性，且在许多方面优于抗体。适体的制备方法主要为s e l e x 法，指数扩增的系统筛选配体法( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ，s e l e x ) ，是二十世纪9 0 年代初应州的新技术。s e l e x 技术的基本思想是体外化学合成一个单链寡核营酸库，川它与靶物质混合，形成靶物质一核酸的复合物，洗掉朱与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸，以此核酸分子为模扳进行p c r 扩增再进行下轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，最后得到高亲和力与高特异性的适体。1 s e l e x 技术的筛选基础核酸分子在一级结构上存在着核营酸人量不同顺序的排列组合。随机寡核苷酸的多种空间结构是s e l e x 技术的筛选基础，多达1 0 ”以上的随机寡核苷酸几乎涵盖了所有可能的立体构象，可作用丁自然界存在的儿乎所有种类分子。利用合成化学可以将一定k 度核苷酸的不同组合都合成出来，构建成一个包含这一长度核酸分子所有可能突变的文库，这样就可以在试管里模拟火自然的进化，有目的地施加选择压力，在很短的时间里筛选出符合特定要求的核酸分子。2 构建寡核营酸文库利用分子生物学技术，构建人 ：合成的单链随机寡核菅酸文库，其中随机序列长度在2 0 6 0 b p 左右，随机序列两端是带有限制性内切酶位点的同定序列，此同定序列是多聚酶链反应及其他酶学反应相关引物的结合何点。随机寡核茁酸库可以是r n a 文库，也可以是单链d n a 文库，d n a 或r n a 随机序列库的复杂性或多样性取决丁核苛酸数目，理论上4 0个核苷酸的随机组合库应有1 2 1 0 ”个单独序列，库容量明显高于其它组合化学库。3 特异适体的筛选与扩增用上述文库中的随机寡核苛酸序列与抗原或药物等靶分子混合并相互作用后州洗脱、过滤、亲和色谱、磁珠等方法筛选出与靶序列结合的寡核菅酸适体。侯选序列的d n a 片段汞i r n a 片段，可分别通过p c r i i r t p e r 扩增，再开始f 一轮筛选。随着每一轮筛选严谨度的不断增加，与靶目标高度特异结合的d n a 或r n a 分子节指数增欧，低亲雨i 力序列逐步被淘汰。约经1 0 1 5 轮筛选后可达到亲和饱和度，p c r 扩增产物即_ i = | 丁克隆、测序。通常情况下，最后轮富集侯选库中9 0 以上的序列都是能与靶分子特异结合的适体。初步筛选出的适体，可作为先导分子进行优化，包括寻找能发挥功能作用的最小核心序列，根据目的进行化学修饰，研制最佳适体( 付玉荣，2 0 0 5 ) 。化学修饰适体目的在于增强适体的稳定性，实用性和多样性，不经修饰的寡核菅酸，尤其是r n a 易被生物体液中的核营酸酶降解，如对寡核茁酸骨架进行修饰，可避免降解。常以一n i t z 、一f 、- 0 一c l f 潜代嘧啶核苷分子中的27 一o h ，修饰后后经s e l e x 过程制备的适体，可以抵抗核酸酶的降解，既适用于诊断，也适用治疗。b l e s s 等( 1 9 9 7 ) 从一个掺有弹性蛋白酶的小分子抑制剂( 颉氨酸二苯脂磷酸) 的s s r n a 库中筛选出高度特异性的弹性蛋白酶适体。也有许多尝试在d n a 或r n a 结构中插入多种基团进行修饰，或在p 5 位进行修饰，力图改善适体的鉴别力且避免在s e l e x 过程中被酶解。适体识别靶分子的作刚原理与其三维结构为基础的。一种单链d n a 或r n a 能形成多种热力学稳定的空间结构，是筛选各类靶分子适体的基础。在人多数情况f ，溶液中的单链r n a或d n a 的空间构象是不确定的，当靶分子存在时，单链d n a 或r n a 能发生适应性折叠，通过氢键、疏水作用力、范德华力与靶分子相互作川，与插入或包被的靶分子形成稳定的空间结构，特别是r n a 分子中除g c 、a - u 碱基配对外，还有g u 等变偶碱基对的存在，可以形成发卡( h a i r p i n ) 、假结( p s e u d o k n o t ) 、凸环( b u l g e ) 、g 四分体( g q u a r t e t ) 等特殊空间结构，适体与靶目标相互作_ l j 的特异位点多是苇环、假结、g 四分体、口袋等结构( 朱旭东，2 0 0 2 7 。1 2 1 2 适体的特性与优点1 严格的识别能力和反应的特异性单链寡核苷酸只识别其互补序列，此序列又经多次筛选而选定，故其与靶序列间的结合是有严格的特异性，适体的高度识别能力，与靶分子结合的特异性更强能够分辨出靶分子结构上细微的差别，可以区分1 个甲基或1 个羟基的著别。核苷酸、氨基酸的寡核营酸适体能将它们与突变体、镜像体| 叉：分开来。通过反向s e l e x 筛选，可以有效减弱以至消除既与靶分子结合，又与靶分子类似物结合的寡核营酸适体，从而筛选出高度特异结合靶分子的寡核营酸适体。2 与靶序列作用的广泛性适体所结合的靶分子不仅限丁蛋白质与核酸还能作_ l f 丁酶，生长网子、抗体、基因调节 灭1 子、细胞黏附分子、植物凝集素、完整的病毒颗粒、病原菌笛。适体也用丁小分子鹫物质的检测，包括金属离子，有机染料、药物、氨基酸、辅网子、氨基糖甙、抗生素、核酸碱基类似物、核营酸和肽等。筛选山的配基与靶分子结合更强：甚至强丁i天然配基，解离常数( k d ) 通常在p m o l l n m o l l 之间( g r i d o n n e a up ，1 9 9 9 ) 。3 适体反应条件的可修饰性己制备的单抗如在试验中证明其反应条件或参数不满意，一般只能另行筛选：而适体却可加以修饰，以适廊测定条件的要求，除上述2 位或c 2 5 位修饰外，还可以对适体进行确定条件卜韵再次选择，即进行偏倚文库生成的适体优化( a p t a m e ro p t i m a z a t i a nt h r o u g hb i a s e d1 i b r a r yg e n e r a t i o n ) 。4 用于诊断试验的普遍性适体与靶分子的结合类似抗原与抗体形成的复合物，其结合信号可以通过多种方式表现，如酶标记，放射性标记，荧光标记与生物索标记，通过标记物检测结合信号。另外还可应用于流式细胞技术，传感器、荧光偏振，分子灯塔以及毛细管电泳等检测手段，其应用的j “泛性远胜过抗体。由此对适体的优越性可归纳如f j l 点：第一，适体的制备过程不依赖于动物或细胞，而是在体外人工合成的寡核菅酸，可冈需要而加以改变。第一二，适体可经筛选及修饰而使适合诊断试验的需要。第三，对动物或细胞不能耐受的毒物或免疫原性很低的物质也能制备出适体。第四，适体的化学合成，有极佳的准确性和重复性，有很高的纯度，几乎消除了适体制备的批间误差。第五，荧光、酶或生物素分子等功能团可修饰在适体的特定位置，也可解离用于检测。第六。适体可耐受变性，且变性是可逆的。冈此非常稳定，可长期贮存和常温运输( k i r k h a mpm ，1 9 9 9 ：郑凌，2 0 0 1 ) 。1 2 2 适体在生物学领域的应用1 2 2 1 在流式细胞测量中的应用传统的流式细胞技术廊用荧光标记的单克隆抗体米检测细胞或颗粒表面的抗原。进一步应用结合有配体或抗体的不同大小或颜色的微粒子。由丁流式细胞仪可极好地分辨这些信号，故可精确地同时用于多项诊断试( m u l t i p l