（药理学专业论文）阿霉素致心肌细胞氧自由基释放的研究.pdf

l 目录 1iiiii i l li t l l l l l l l l i t b l11 tit 1itl 18 0 0 4 8 0 中文摘要1 英文摘要5 研究论文阿霉素致心肌细胞氧自由基释放的研究 引言1 0 一弓i 吾”一”“”“一“”“”“”。l 第一部分新生大鼠心肌细胞培养及腺病毒转染 前言1 2日u 舌“”“”“”“一”“”“”“一l z 材料与方法o oooooo oo000 000 000000 1 3 结果1 8 附图o ooo loo oo 1 9 讨_ i 念- 2 6 j 、结一”一”一”一”“”“”2 8 参考文献2 8 第二部分阿霉素致心肌细胞氧自由基释放的测定 前言2 9刖舌一”一“”“”“一”“”“”“”一”2 9 材料与方法3 0 结果3 3 附图3 5 讨论3 8 结论3 9 参考文献3 9 综j 苤4 1 致谢“”“一一4 8 个人简历4 9 摘要 阿霉素( a d r i a m y c i n ，a d r ) 属于蒽环类抗生素，是一种高效的广谱抗肿 瘤抗生素，临床上广泛用于治疗乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤。 但阿霉素在临床化疗中的毒性反应呈现出明显的剂量一效应线性关系，即 随着剂量的增加出现骨髓抑制、心脏毒性、脱发等毒副作用也愈加突出， 尤其是严重的心脏毒性，可引起各种心律失常、充血性心力衰竭甚至死 亡，因此大大限制了它的临床使用。 阿霉素引发心脏毒性的作用机制有多种学说，其中氧自由基学说被多 数研究者所认同。阿霉素的氧自由基学说认为，a d r 进入心肌细胞后。在 微粒体中由还原型辅酶i i ( n a d p h ) 及细胞色素p 4 5 0 还原酶提供一个电子 转变为带一个多余电子的半醌a d r 该半醌a d r 又把此电子传递给氧分 子( 0 2 ) ，使0 2 变成超氧阴离子( 0 2 ) ；在线粒体中由还原型辅酶i ( n a d h ) 及n a d h 氧化还原酶提供一个电子转变为半醌a d r 并与0 2 作用产 生0 2 。，同时伴有过氧化氢( h 2 0 2 ) 生成增加。0 2 与h 2 0 2 通过 h a b e r w e i s s 反应或f e n t o n 反应产生羟自由基( o h ) 。这些在心肌细胞中 产生的氧自由基( o f r ，包括0 2 。、o h 、h 2 0 2 ) 作用于细胞膜及各种细 胞器膜上的磷脂中的多价不饱和脂肪酸，形成脂质自由基，引发脂质过氧 化反应，使膜的结构发生改变、扭曲，并影响膜上功能蛋白质的位置及构 型，最终导致膜的完整性遭到破坏，膜的流动性降低，通透性增加，容量 调节功能及离子转运功能障碍，严重影响细胞的功能，造成心肌细胞损伤。 氧自由基造成的心脏损伤作用近年来被作为基础医学和生命科学领 域的研究热点。目前，在活体细胞中可标记氧自由基并对其进行实时监测 定量的指示剂种类还比较缺乏，寻找一种特异性高、灵敏、可进行定量的 氧自由基指示剂成为当前研究的一大重点。2 0 0 8 年，北京大学分子医学 研究所程和平教授研究组研究发现了一种新的细胞超氧自由基生成事件， 并命名为“超氧炫”( s u p e r o x i d ef l a s h e s ) ，这是首次在活体细胞中观测到局 部、间歇性、量子化超氧的产生。超氧炫为线粒体膜通透性转运孔道( m p t p ) 开放所触发，与线粒体电子传递链活性密切相关。上述发现是基于发明了 中文摘要 一种新颖的高特异性超氧指示剂，即基因编码的、定位于线粒体的可用于 实时测量的荧光蛋白。 本实验拟就阿霉素导致心肌细胞早期损伤的氧自由基学说进行研究， 采用上述这种新型高特异性超氧指示剂“超氧炫”荧光蛋白，研究线粒体 上氧自由基释放是否是阿霉素致心肌细胞损伤的早期事件，为阿霉素导致 心肌细胞损伤的氧自由基学说提供直接证据，同时，对药物所致细胞线粒 体上超氧阴离子生成情况进行研究，为进一步利用此种高特异性超氧指示 剂建立药物致心肌细胞损伤评价方法打下基础。 1 新生大鼠心肌细胞培养及腺病毒转染 目的：建立新生大鼠心肌细胞培养方法，完成“超氧炫”腺病毒的扩 增及转染，为下一步实验打下基础。 方法：( 1 ) 新生大鼠心肌细胞的原代培养取新生7 2 小时内的s d 乳 鼠，消毒，开胸，夹取心室部分，于冰浴的p b s 液中洗涤，剪碎。消化 6 8 次后，过滤，离心，收集细胞，用培养液混悬，差速贴壁8 0 分钟后， 收集培养液中的非贴壁细胞，种于2 4 孔板中，2 4 小时后换培养基，然后每 隔1 天更换培养基1 次。( 2 ) “超氧炫 腺病毒的扩增培养2 9 3 a 细胞， 当细胞密度达到7 0 8 0 时，换液，加入腺病毒液，4 8 7 2 小时后，当有 7 0 8 0 细胞变圆漂起时，收集病毒，8 0 3 7 反复冻融3 次，离心，收 集上清液。如此重复扩增3 轮。第四轮扩增时，当有5 0 细胞变圆漂起时， 收集病毒，离心，弃去上清液，用l m l 培养基重悬细胞，8 0 3 7 反复 冻融3 次，离心，收集上清液，分装，8 0 储存。( 3 ) “超氧炫 腺病毒 的滴度测定在6 孔板中培养2 9 3 a 细胞，当各孔细胞密度达到7 0 8 0 时， 换液，加入稀释为1 0 、1 0 、1 0 一、1 0 4 、1 0 6 的腺病毒液，没加病毒的一 孔细胞作对照。7 2 h 后选取刚好全部细胞变圆漂起或仅有少量细胞贴壁但 细胞形态也已回缩的一孔，认为此孔病毒的m o i 值约为1 0 。( 4 ) “超氧 炫”腺病毒转染心肌细胞向新生大鼠心肌细胞和成年大鼠心肌细胞中分 别加入适量的腺病毒，培养4 8 7 2 h 后，在激光共聚焦显微镜下观察转染 结果。 结果： ( 1 ) 心肌细胞形态学观察2 4h 后观察细胞已基本全部贴壁，贴壁后 为梭形或菱形，有一部分细胞已开始搏动。继而细胞逐渐在皿底表面铺展， 中文摘要 并伸出伪足，形成不规则的星形并相互接触交织成网，在培养7 2h 后可 形成呈放射状排列的细胞簇，其搏动已同步化。 ( 2 ) “超氧炫”腺病毒的滴度测定7 2h 后，对照孔的细胞已生长连接 成片；l o 。孔细胞全部变圆漂起，悬浮在培养基中；1 0 之孔细胞绝大部分漂 起，悬浮在培养基中，还有一小部分细胞贴壁，但细胞形态也已回缩；1 0 。3 孔和1 0 4 孔细胞回缩变圆漂起、悬浮在培养基中的数量随着加入病毒量的 减少而减少，贴壁细胞随之增7 j h ；i o 。5 孔中几乎没有细胞悬浮在培养基中。 故判定l o 之孔病毒的m o i 值约为1 0 。 ( 3 ) 在激光共聚焦显微镜下观察“超氧炫”腺病毒转染心肌细胞的结 果在激光共聚焦显微镜下可看到“超氧炫 腺病毒转染心肌细胞的效率 很高，9 0 以上的心肌细胞均已被腺病毒感染，并表达其所携带的荧光蛋 白，产生黄色荧光。 结论：本实验成功改进了新生大鼠心肌细胞的培养方法及腺病毒的 扩增、转染方法，使心肌细胞的成活率高，腺病毒的扩增操作简易、高效， 为后续实验打下了良好基础。 2 阿霉素致心肌细胞氧自由基释放的测定 目的：以“超氧炫”荧光蛋白为指示剂，直接观察阿霉素引起的心肌 细胞氧自由基释放情况。 方法：( 1 ) 验证“超氧炫”荧光蛋白是否可作为心肌细胞线粒体上的 超氧指示剂在激光共聚焦显微镜下连续观察单个心肌细胞给苍术苷( 2 0 um ) 前后“超氧炫荧光强度的变化。记录细胞x y t 平面内给苍术苷前 后“超氧炫 荧光强度，并计算二者比值。( 2 ) 阿霉素致心肌细胞氧自由 基释放的测定在激光共聚焦显微镜下连续观察单个心肌细胞给阿霉素 ( 1 8 4l am ) 前后“超氧炫”荧光强度的变化。记录细胞x 盯平面内给阿 霉素前后不同时间点的“超氧炫 荧光强度，并分别计算给药后不同时间 点与给药前的荧光强度比值。 结果： ( 1 ) 验证“超氧炫荧光蛋白是否可作为心肌细胞线粒体上的超氧指 示剂苍术苷使心肌细胞给药后3 0 0 s 的荧光强度平均增加到给药前的 1 1 1 0 8 3 6 3 ( n = 9 ) ，通过统计学分析可得，给药后3 0 0 s 心肌细胞的“超 氧炫 荧光强度比给药前显著增强( p o 0 1 ) 。由于苍术苷是i i l p t p 开放剂， 中文摘要 可促使m p t p 开放，线粒体跨膜电位降低，线粒体解联的呼吸链产生大量 活性氧，所以可以推断“超氧炫”荧光强度与心肌细胞线粒体上超氧阴离 子的生成呈正相关，进而验证了“超氧炫 荧光蛋白确实是一种定位于线 粒体上可用于实时监测的高特异性超氧指示剂。 ( 2 ) 阿霉素致心肌细胞氧自由基释放的测定心肌细胞在给阿霉素后 1 2 0 s 、3 0 0 s 、6 0 0 s 、1 2 0 0 s 、1 8 0 0 s 分别使其“超氧炫”荧光强度平均增 加到给药前的1 1 2 o o 2 9 9 、1 2 0 3 2 4 - 1 4 8 、1 2 3 5 0 3 4 1 、1 3 4 0 5 4 1 9 、 1 4 0 2 1 1 8 2 ( n _ 6 ) ，通过统计学分析可得，给药后1 2 0 s 心肌细胞的 荧光强度就比给药前显著增强( p o 0 1 ) ，随着时间的延长，其荧光强度逐 渐增强。由于“超氧炫”荧光强度与心肌细胞线粒体上超氧阴离子的生成 呈正相关，所以可以推断在本实验所用给药浓度的阿霉素作用下，给药后 1 2 0 s 心肌细胞线粒体上超氧阴离子生成显著增多( p 0 0 1 ) 。由于所用的阿 霉素的给药浓度是公认的阿霉素造成急性心肌细胞中毒的浓度，所以可以 认为在本实验中给阿霉素后会引起心肌细胞急性损伤中毒，因此认为，心 肌细胞线粒体上大量超氧阴离子的生成是阿霉素引起心肌细胞损伤的早 期事件。 结论：本实验利用“超氧炫”荧光蛋白作为心肌细胞线粒体上超氧自 由基生成指示剂，为阿霉素导致心肌细胞损伤的氧自由基学说提供了直接 证据，同时，为进一步将这种高特异性超氧指示剂应用于药物心脏毒性安 全性评价奠定了基础。 关键词：阿霉素；氧自由基；超氧炫；原代心肌细胞；腺病毒 英文摘要 t h es t u d yo na d r i a m y c i n i n d u c e dr e l e a s eo fo x y g e nf r e er a d i c a l s 一_ i nc a r d i o m v o c y t e s 一 - a b s t r a c t a d r i a m y c i n ( a d r ) b e l o n g st oa n t h r a c y c l i n ea n t i b i o t i c sa n d i sah i 曲1 y e f f i c i e n tb r o a d s p e c t r u ma n t i - t u m o ta n t i b i o t i c ，w h i c hi sw i d e l yu s e di nc l l m c a l 一一一一。- t r e a t m e n to fb r e a s tc a n c e r ，l u n gc a n c e ll y m p h o m aa n do t h e rm a l i g n a n c i e s h o w e v e r , t h et o x i c i t y o fa d rh a ss h o w e ds i g n i f i c a n td o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i pi nt h ec l i n i c a lc h e m o t h e r a p y a d rc a ni n d u c et h ei n c i d e n c eo f m y e l o s u p p r e s s i o n ，c a r d i a ct o x i c i t y , d e f l u v i u mc a p i l l o r u m a n do t h e ra d v e r s e r e a c t i o n s e s p e c i a l l yt h es e v e r ec a r d i a ct o x i c i t ym a y c a u s ev 撕o u sa r r h y t h m i a s ， c o n g e s t i v eh e a r tf a i l u r ea n de v e nd e a t h t h e r e f o r e ，c a r d i o t o x i c i t yg r e a t l y l i m i t st h ec l i n i c a lu s eo fa d r t h et h e o r yo fo x y g e nf r e er a d i c a l sh a sb e e na c c e p t e db yt h em a jo r i t yo f t h er e s e a r c h e r sa l t h o u g h t h e r ea r ea v a r i e t y o ft h e o r i e sa b o u t a d r i a m y c i n i n d u c e dc a r d i o t o x i c i t y i ti sc o n s i d e r e db yt h et h e o r yo fo x y g e n f r e er a d i c a l st h a ta d rc a nb et r a n s f o r m e di n t os e m i q u i n o n ea d r w i t ha l l e x t r ae l e c t r o na f t e ri ti sc a t a l y z e db yt h er e d u c e dc o e n z y m ei i ( n a d p h ) a n d c y t o c h r o m ep 4 5 0r e d u c t a s ei nt h em i c r o s o m e so fc a r d i o m y o c y t e s t h e nt h e s e m i q u i n o n ea d r t r a n s f e r st h ee l e c t r o nt oa no x y g e nm o l e c u l e ( 0 2 ) a n d m a k e si tt u r nt oas u p e r o x i d ea n i o n ( 0 2 ) m e a n w h i l e ，a d ri st r a n s f o r m e d i n t os e m i q u i n o n ea d ri nm i t o c h o n d r i ab yt h er e d u c e dc o e n z y m eif n a d h ) a n dn a d h o x i d o r e d u c t a s e ，a n dt h u s 0 2 。i sg e n e r a t e da c c o m p a n i e db yt h e i n c r e a s eo fh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) t h es u p e r o x i d ea n i o n ( 0 2 。) p r o d u c e s h y d r o x y lr a d i c a l ( o h ) w i t hh 2 0 2i 1 1 t h eh a b e r - w e i s sr e a c t i o no rf e n t o n r e a c t i o n t h e s eo x y g e nf r e er a d i c a l sp r o d u c e di nt h ec a r d i o m y o c y t e s ( o f r i n c l u d i n g 0 2 。，o h ，h 2 0 2 ) t u r ni n t ol i p i df r e er a d i c a l sb yr e a c t i n go nt h e p o l y v a l e n c yu n s a t u r a t e df a t t y a c i d si nt h ee e l lm e m b r a n ea n dv a r i o u s m e m b r a n ep h o s p h o l i p i d so fo r g a n e l l e s ，w h i c ht r i g g e rl i p i dp e r o x i d a t i o n ， c h a n g et h es t r u c t u r eo fc e l lm e m b r a n e s ，a f f e c tt h el o c a t i o na n d c o n f i g u r a t i o n 5 英文摘要 一一 o ft h ef u n c t i o np r o t e i n si nt h em e m b r a n e s ，e v e n t u a l l yl e a dt ot h ed e s t r u c t i o no f m e m b r a n ei n t e g r i t y t h el o w e dm e m b r a n ef l u i d i t y , i n c r e a s e dp e r m e a b i l i t ya n d d y s f u n c t i o no fv o l u m ec o n t r o la n d i o n i ct r a n s p o r ts e v e r e l ya f f e c tt h ef u n c t i o n o fc a r d i o m y o c y t e sa n dr e s u l ti nt h ei n j u r yo fc a r d i o m y o c y t e s t h em e c h a n i s mu n d e r l y i n gc a r d i a ci n j u r yc a u s e db yo x y g e nf r e er a d i c a l s h a sb e e nar e s e a r c hf o c u si np r e c l i n i c a lm e d i c i n ea n d l i f es c i e n c e sf o rt h ep a s t f e wy e a r s a tp r e s e n t ，f i n d i n g ah i g h l ys p e c i f i c ，s e n s i t i v e ，q u a n t i t a t i v e i n d i c a t o ro fo x y g e nf r e er a d i c a l sb e c o m e sae m p h a s i so fc u r r e n tr e s e a r c h b e c a u s eo ft h ep a u c i t yo fq u a n t i t a t i v ep r o b e sf o rr e a l t i m ed e t e c t i o no fo x y g e n f r e er a d i c a l si nl i v i n gc e l l s i n2 0 0 8 ，t h er e s e a r c hg r o u po fp r o f e s s o rc h e n g i n i n s t i t u t e o fm o l e c u l a rm e d i c i n e ，p e k i n gu n i v e r s i t y f o u n dan e w s u p e r o x i d e p r o d u c i n ge v e n ti nt h em i t o c h o n d r i a lm a t r i x ，n a m e d s u p e r o x i d e f l a s h e s i tw a st h ef i r s tt i m et oo b s e r v et h eg e n e r a t i o no fl o c a l ，i n t e r m i t t e n t ， q u a n t a ls u p e r o x i d ea n i o n si nl i v i n gc e l l s s u p e r o x i d e f l a s h e sw e r et r i g g e r e db y t h eo p e n i n go ft h em i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r ea n dc o r r e l a t e d w i t ht h ee t cc l o s e l y t h e s ef i n d i n g sw e r eb a s e do nt h ei n v e n t i o no fan o v e l ， h i g h l ys p e c i f i cs u p e r o x i d ei n d i c a t o r , w h i c h w a sa g e n e t i c a l l ye n c o d e d ， m i t o c h o n d r i a lm a t r i x t a r g e t e d f l u o r e s c e n tp r o t e i na n dw i t ht h ep r o t e i n s u p e r o x i d ea n i o n sw e r er e a l - t i m e m e a s u r e d i nm es t u d y , w ei n t e n d e dt oi n v e s t i g a t et h em e c h a n i s mu n d e r l y i n g a d r i a m y c i n i n d u c e de a r l yi n j u r y t oc a r d i o m y o c y t e sb a s e do nt h et h e o r yo f o x y g e nf r e er a d i c a l s b yu s i n gt h en o v e l ，h i g h l ys p e c i f i cs u p e r o x i d e i n d i c a t o r ( m t c p y f p ) ，w ea d d r e s s e dt h eq u e s t i o nw h e t h e r t h er e l e a s eo fm i t o c h o n d r i a l o x y g e nf r e er a d i c a l s w a st h ee a r l ye v e n to fa d r i a m y c i n i n d u c e di n j u r yt o c a r d i o m y o c y t e sa n dt r i e dt op r o v i d ed i r e c te v i d e n c ef o rt h et h e o r yo f o x y g e n 能er a d i c a l sa b o u ta d r i a m y c i n i n d u c e de a r l yi n j u r yt oc a r d i o m y o c y t e s i n a d d i t i o n ，t h ee x p e r i m e n tw a st op r o v i d eb a s i cd a t af o rm a k i n gf u r t h e ru s eo f s u c hh i g h l ys p e c i f i cs u p e r o x i d ei n d i c a t o rt oe v a l u a t ed r u g - i n d u c e di n j u r yt o c a r d i o m y o c y t e s 英文摘要 p a r t1c u l t u r eo fn e o n a t a lr a t c a r d i o m y o c y t e sa n dt r a n s f e c t i o n o f a d e n o v i r u se x p r e s s e dm t c p y f p o b j e c t i v e ：t o e s t a b l i s ham e t h o df o r c u l t u r i n g n e o n a t a l r a t c a r d i o m y o c y t e s a n d c o m p l e t e t h e a m p l i f i c a t i o n a n dt r a n s f e c t i o no f a d e n o v i r u s m e t h o d s ：( 1 ) p r i m a r yc a r d i o m y o c y t ec u l t u r e c a r d i o m y o c y t e s w e r e i s o l a t e df r o m7 2hn e o n a t a lr a th e a r t sw i t hm e c h a n i c a ld i s s e c t i o na n de n z y m e d i g e s t i o n ，t h e np u r i f i e db ym e a n so fd i f f e r e n t i a la t t a c h m e n tt e c h n i q u ea n d c h e m i c a ld r u gi n h i b i t i o n m o r p h o l o g i c a lc h a n g e so fc a r d i o m y o c y t e sw e r e d y n a m i c a l l yo b s e r v e du n d e rp h a s ec o n t r a s tm i c r o s c o p y ( 2 ) a m p l i f i c a t i o no f a d e n o v i r u st oa m p l i f yav i r u ss t o c k , 2 9 3 ac e l l sw e r er o u t i n e l yc u l t u r e da n d t h ev i r u ss u s p e n s i o nw a sa d d e dw h e nt h e yr e a c h e d7 0 _ 8 0 c o n f l u e n t a f t e r i n c u b a t i n g4 8 - 7 2 h ，t h ec e l l sw e r eh a r v e s t e d t h e nt h ec e l l sw e r es u b j e c t e dt o3 r o u n d so ff r e e z e t h a wb e t w e e n 8 0 a n d3 7 0 c c e n t r i f u g e da n dt h e s u p e m a t a n tw a sc o l l e c t e d v i r a ls t o c k sw e r es t o r e da t - 8 0 t h ea b o v es t e p s o ft h ea m p l i f i c a t i o nw e r er e p e a t e df o r3t i m e s i nt h ef o r t hr o u n do f a m p l i f i c a t i o n ，t h ec e l l sw e r eh a r v e s t e dw h e n5 0 o ft h e mr o u n d e du pa n d d e m c h e df r o mt h ep l a t e sa n dt h e nc e n t r i f u g e d 1 1 1 er e s u l t a n ts u p e r n a t a n tw a s d i s c a r d e d t h e nt h ec e l l sw e r er e s u s p e n d e da n ds u b je c t e dt oa n o t h e r3r o u n d s o ff r e e z e t h a w ，c e n t r i f u g e da n dt h es u p e m a t a n tw a sc o l l e c t e d v i r a ls t o c k s w e r es t o r e da t 一8 0 ( 3 ) t h em e a s u r e m e n to fv i r a lt i t e r2 9 3 ac e l l sw e r e p l a t e di n t oa6 一w e l lt i s s u ec u l t u r ep l a t e m e nt h e yr e a c h e d7 0 8 0 c o n f l u e n t t h ec e l l sw e r ea d d e di n t od i l u t e dv i r a ls t o c k so v e ra10 f o l ds e r i e sf r o m10 。1t o 10 。w i t ho n ew e l l “m e d i u mo n l y ( n ov i r u sa d d e d ) a sac o n t r 0 1 aw e l lw a s s e l e c t e di nw h i c ht h ec e l l sj u s tr o u n d e du pa n dd e t a c h e df r o mt h ep l a t ea f t e r 7 2 ha n dt h ev i m lm o ii nt h i sw e l lw a sa p p r o x i m a t e l y10 ( 4 ) t r a n s f e c t i o no f a d e n o v i r u sn e o n a t a la n da d u l tr a tc a r d i o m y o c y t e si np r i m a r yc u l t u r ew e r e i n f e c t e dw i t ha d e n o v i r u sc a r r y i n gt h em t c p y f p c o d i n gs e q u e n c ea n dc u l t u r e d f o r4 8 7 2h o u r s ，t h e nw eo b s e r v e dt h e mu n d e rc o n f o c a lm i c r o s c o p e r e s u l t s ： ( 1 ) m o s tc a r d i o m y o c y t e sw e r ea t t a c h e dt ot h ec u l t u r ep l a t ea n ds o m e 7 英文摘要 b e a t i n gc e l l s w e r ef o u n da f t e r2 4h o u r s 1 1 1 e y g o tt o g e t h e r a n db e a t s y n c h r o n o u s l yi nc l u s t e r sa f t e r7 2h o u r s ( 2 ) a f t e r7 2ho fc o c u l t u r ew i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fa d e n o v i r u s ， t h e2 9 3 ac e l l ss h o w e dd i f f e r e n te x t e n to fc p e t h ec e l l si n10 吐w e l lj u s t r o u n d e du pa n dd e t a c h e df r o mt h ep l a t ea f t e r7 2 h s ot h ev i r a lm o ii nt h i sw e l l w a s a p p r o x i m a t e l y10 ( 3 ) m o r et h a n9 0 o ft h ec a r d i o m y o c y t e sw e r ei n f e c t e db ya d e n o v i r u s a n de x p r e s s e dm t c p y f p , w h i c hw e r ef o u n dt oe m i ty e l l o wf l u o r e s c e n c e c o n c l u s i o n ：n em e t h o d sf o rc u l t u r i n gn e o n a t a lr a tc a r d i o m y o c y t e sa n d v i r a la m p l i f i c a t i o na n dt r a n s f e c t i o nw e r ei m p r o v e d ，s ot h a tt h es u r v i v a lr a t eo f c a r d i o m y o c y t e sw a sh i g h ，a n dt r a n s f e c t i o no fa d e n o v i r u sw a ss i m p l ea n d h i 曲l ye f f i c i e n t p a r t2t h em e a s u r e m e n to fa d r i a m y c i n i n d u c e dr e l e a s eo fo x y g e nf r e e r a d i c a l si ne a r d i o m y o c y t e s o b j e c t i v e ：t oo b s e r v ea d r i a m y c i n i n d u c e d r e l e a s eo fo x y g e nf r e e r a d i c a l si nc a r d i o m y o c y t e sw i t hm t - c p y f e m e t h o d s ：( 1 ) t ov e r i f yw h e t h e rm t c p y f pc o u l db eu s e da sas u p e r o x i d e i n d i c a t o ri nt h em i t o c h o n d f i ao fc a r d i o m y o c y t e sw eo b s e r v e dt h ec h a n g e so f f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yc o n t i n u o u s l yi ns i n g l ec a r d i o m y o c y t eb e f o r ea n da f t e r a d m i n i s t e r i n ga t r a c t y r l o s i d e ( 2 0 m ) u n d e r c o n f o c a l m i c r o s c o p e t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y w a sr e c o r d e db e f o r ea n da f t e r a d m i n i s t e r i n g a t r a c t y l o s i d e 。a n dc a l c u l a t e dt h er a t i o sb e t w e e nt h e m ( 2 ) t h em e a s u r e m e n to f a d r i a m y c i n i n d u c e dr e l e a s eo fo x y g e nf r e er a d i c a l si nc a r d i o m y o c y t e s t h e c h a n g e s o ff l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yw e r ec o n t i n u o u s l yo b s e r v e di ns i n g l e c a r d i o m y o c y t eb e f o r ea n da f t e ra d m i n i s t e r i n ga d r ( 1 8 4 i ，t m ) u n d e rc o n f o c a l m i c r o s c o p e t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw a sr e c o r d e db e f o r ea n d a f t e r a d m i n i s t e r i n ga d ra n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yr a t i o sw e r ec a l c u l a t e d b e t w e e nd i f f e r e n tt i m ep o i n t sa f t e ra n db e f o r ea d m i n i s t r a t i o no fa d r i a m y c i n r e s u l t s ： ( 1 ) t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw a si n c r e a s e dt o1 11 0 84 - 3 6 3 ( n = 9 ) a t 3 0 0 sa f t e ra d m i n i s t r a t i o no fa t r a c t y l o s i d e t h es t a t i s t i c a lr e s u l ti n d i c a t e dt h e 8 英文摘要 f l u o r e s c e n c ei