动物实验技术与方法.ppt

动物实验技术,在医学教学、科研和医疗工作中，不论是从事基础医学还是临床医学或预防医学，都需要用实验动物来进行各种实验。通过对动物实验的观察、分析，来研究需要解决的问题，动物实验方法已成为研究工作中必不可少的重要手段。,动物实验,动物实验前的准备实验动物的抓取和固定实验动物的麻醉实验动物给药方法各种检验标本的采集方法实验动物的安乐死及无害化处理,动物的购入动物外观健康检查动物编号标记动物被毛的去除,动物实验前的准备,动物的购入,购入或领取实验动物时，应向供应部门索取所用动物相应等级的质量合格证书，若是购入或领取清洁级以上实验动物，应采用带有空气过滤膜的无菌运输罐或带过滤帽的笼盒运输，并严格检查其密封状况。,皮毛：有无光泽、出血、干燥；眼：有无眼屎、流泪、白内障、角膜损伤等；耳：有无外伤、耳壳曲折、中耳炎等；四肢：有无弯曲、脱臼、外伤、关节炎；肛门：有无下痢、血便、脱肛等。,动物外观健康检查,编号标记目的：为了分组要求：清晰、耐久、简便、适用,颜料标记颜料标记适应于较大量的大、小鼠等小动物的编号。常用的颜料有5%苦味酸溶液(黄色)、2%硝酸银溶液(咖啡色)、0.5%中性品红溶液(红色)、煤焦油的酒精溶液(黑色)。颜料号的原则是先左后右，从上而下。,小鼠和大鼠标号示图,烙印用号码烙印钳在兔、豚鼠的耳朵烙号，然后在烙印部位涂上溶在酒精中的黑墨或煤粉。猪等大动物也可用此法在臀部皮肤烙号标记。也有将实验分组编号烙在狗脖套的皮带颈圈上。纹身用刺数钳在局部皮肤(兔多在耳朵内侧，猴多在前胸皮肤)刺上号码，再用棉签蘸上墨汁酒精涂沫刺号，多用于猴、兔的编号。,号牌将不锈钢或铝质号牌固定在狗或猴的链条或颈圈上。兔号牌则固定在耳朵上。少量动物时也可将号牌挂在笼具上，但应防止抓取操作后将动物放错笼具而混淆编号。,毛色利用动物的毛色将其编号，用于少量的狗、马、猫、猴等大动物的编号。剪毛用剪刀在狗背上剪出号码，此方法简单，字迹清楚、可靠，便于观察。打孔用打孔器在兔耳上打孔或剪口。,为了排除动物被毛对实验操作和观察结果的影响，实验中需要去除或剪短动物的被毛。,动物被毛的去除,脱毛剂1)8%NaSNaS8g+水至100ml；也可用硫化钠8克、淀粉7克、甘油4克、硼砂1克，用自来水加至100ml。常用于兔及小鼠等小型动物的脱毛。上述配制好的溶液57ml可用于1512cm2皮肤的脱毛。2)10%NaS硫化钠10克、氧化钙15克，自来水加至100ml。常用于狗、猪等较大动物的皮肤,动物的抓取与固定方法目的：限制动物的活动，持安静状态以便正确操作和记录要求：不损伤实验动物不影响观察指标实验者不被动物咬伤保证实验顺利进行小心细致、大胆敏捷，切忌粗暴。,一、小鼠用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。,小鼠的抓取与固定,小鼠的抓取,二、大鼠大鼠的门齿很长。实验者应戴上棉纱手套，右手轻轻抓住大鼠的尾巴向后拉，但要避免抓其尖端，以防尾巴尖端皮肤脱落，左手抓紧鼠两耳和头颈部的皮肤，并将大鼠固定在左手中，右手即可进行操作。,大鼠的抓取,三、豚鼠抓取幼小的豚鼠时，可用双手捧起来；抓取较大的豚鼠时，可先用手掌抠住豚鼠的背部，抓住其肩胛上方，将右手张开，用手指抓住颈部再慢慢将其提起,豚鼠的抓取,四、家兔一只手抓住兔的颈部皮毛，将兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背部皮肤提起来。因家兔耳大，故人们常误认为抓其耳可以提起，或有人用手挟住其腰背部提起均为不正确的操作。,兔的抓取方法,猫的抓取与固定方法,布制猪固定带,猪的悬吊式固定,为了观察药物对机体功能、代谢、形态的影响，需要将药物注入实验动物体内。由于实验目的、动物种类、药物剂型不同，给药途径和方法也多种多样。,实验动物给药方法,实验动物的给药剂量,D2=D1K2/K13W1/W2D:药物剂量(gkg-1d-1)W:动物体重(kg)K:常数,不同种类动物的K值,名称K值名称K值人10.6家兔10.1猴11.8大鼠9.1狗11.2豚鼠9.8猫9.8小鼠9.1,实验动物的给药途径和方法,（一）口服给药经口给药剂量准确，对动物安全，是动物实验中常用的给药方法，尤其是移植实验中受体动物的肠道灭菌处理，必须口服肠道不吸收的抗生素。,1灌胃法是借灌胃器将药物直接灌到动物胃内的一种常用给药方法，此法给药剂量准确。但是每天强制性操作和定时给药会给动物造成一定程度的机械性损伤和心理上的影响。因此必须充分掌握灌胃技术。,（1）鼠类：鼠类的灌胃器由注射器和特殊的灌胃针构成。左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的右口角插入口中，沿咽后壁慢慢插入食道，使其前端到达膈肌位置。灌胃针插入时应无阻力，如有阻力或动物挣扎则应退针或将针拔出，以免损伤、穿破食道或误入气管。,小白鼠灌胃方法,大白鼠灌胃方法,（2）兔、犬等：灌胃一般要借助于开口器、灌胃管进行。先将动物固定，再将开口器固定于上下门齿之间，然后将灌胃管（常用导尿管代潜）从开口器的小孔插入动物口中，沿咽后壁而进入食道。插入后应检查灌胃管是否确实插入食道。可将灌胃管外开口放入盛水的烧杯中，若无气泡产生，表明灌胃管被正确插入胃中，未误入气管。,兔灌胃方法,狗灌胃方法,（二）注射给药法注射给药剂量准确、作用快，是动物实验中常用的给药方法，给药时应注意针头的选择（鼠类用4#针头，兔、猫、犬、猪、猴用68#针头）。,1皮下注射皮下注射时用左手拇指和食指轻轻提起运动皮肤，右手持注射器，使针头水平刺入皮下，推送药液使注射部位隆起。拔针时，以手指捏住针刺部位，可防止药液外漏。皮下注射剂量为0.1-0.3ml/10g.,皮下注射一般选取皮下组织疏松的部位，大鼠、小鼠和豚鼠可在颈后肩胛间、腹部两侧作皮下注射；家兔可在背部或耳根部作皮下注射：猫、犬则在大腿外侧作皮下注射。,皮下注射,2皮内注射将注射部位脱毛、消毒，用左手拇指和食指压住皮肤并使之绷紧，在两指之间，用皮试针头紧贴皮肤表层刺入皮内，然后向上挑起并再稍刺入。随之慢慢注入一定量的药液,会感到有很大阻力.,缓慢注射，皮肤表面出现白色桔皮样隆起，若隆起可维持一定时间，则证明确实注射在皮内.如很快消失,就可能注入皮下,应重换部位再注射,如果注射完毕后马上拔针,药液会从针孔漏出,所以需注射后5min再拔出.,皮内注射,3肌肉注射肌肉注射一般选肌肉发达，无大血管通过的部位。注射时针头宜垂直迅速刺入肌肉，回抽针栓如无回血，即可注射。大鼠、小鼠、豚鼠可注射大腿外侧肌肉；家兔可在腰椎旁的肌肉、臀部或股部肌肉注射：犬、猴等大型动物选臂部注射。,4腹腔注射腹部向上，应尽量使动物头处于低位，使内脏移向上腹，将针头在下腹部腹白线稍向左的位置,注射器沿45角斜向穿过腹肌进入腹腔，此时有落空感，回抽无回血或尿液，即可注入药液。,小鼠的一次注射剂量为0.1-0.2ml/10g(体重)大鼠一次注射剂量为1-2ml/100g(体重).家兔：下腹部近腹白线左右两侧1cm处犬：脐后腹白线两侧边12cm处进行腹腔注射,小鼠腹腔注射方法,5静脉注射将药液直接注射于静脉管内，使其随着血液分布全身,迅速奏效。但排泄较快，作用时间较短。（1）小鼠和大鼠：常采用尾静脉注射。鼠尾静脉共有3根，左右两侧和背侧各1根，两侧尾静脉比较容易固定，故常被采用。注射时，先将动物固定在暴露尾部的固定器内，尾部用4550的温水浸润几分钟或用75%酒精棉球反复擦拭使血管扩张，并使表皮角质软化。,小鼠尾静脉注射方法,小鼠尾静脉注射方法,狗前肢内侧皮下静脉注射方法,狗后肢静脉注射方法,猪灌胃方法,各种动物一次给药能耐受的最大容量(ml)动物灌胃皮内注射皮下注射肌肉注射腹腔注射静脉注射小鼠0.90.11.50.21.00.8大鼠5.00.15.00.52.04.0兔2000.2102.05.010猫1500.2102.05.010猴3000.3503.01020狗5000.31004.0_100,实验动物样本的采集及时、准确地采集实验动物的血样或排泄(分泌)物等实验标本，是保证动物实验结果准确性的重要条件。采集不当时可严重影响实验结果，如狗或猴在实验台上较长时间剧烈挣扎后可使外周血白细胞明显升高；如抽血不顺利且时间较长，则血样中血小板计数可明显降低。,血样的采集根据不同的实验要求及不同种类的实验动物而采取不同的采血方法。如：心脏、胸主动脉、股动脉、静脉、剪(割、刺)尾、眼眶、断头,1小鼠和大鼠（1）剪尾采血：需血量较少时常用此法。先将动物固定，将鼠尾浸在45左右温水中几分钟或用酒精棉球涂擦鼠尾,使尾部血管充盈,剪去尾尖12mm(小鼠)或35mm(大鼠),使血液顺血管壁自由流入试管或用血红蛋白吸管吸取。采血结束时,伤口消毒并压迫止血。此法每只鼠一般可采血10次以上，小鼠每次可取血0.1ml左右，大鼠可取血0.30.5ml。,鼠尾静脉取血方法,（2）眼眶后静脉丛采血：操作者一手固定小鼠或大鼠，食指和拇指轻轻压迫颈部两侧，使眶后静脉丛充血，另一只手持毛细采血管，以45从内眼角刺入，并向下旋转，感觉刺入静脉丛后，再向外边退边吸，当得到所需血量后，放松加于颈部的压力，并拔出采血器，以防穿刺孔出血。若技术熟练，此方法在短期内可重复采血，小鼠一次可采0.2-0.3ml，大鼠可采血约0.5ml。如只进行一次取血，可采用摘眼球法。,小白鼠后眼眶静脉丛取血方法,大白鼠后眼眶静脉丛取血方法,（3）股动脉采血：大量取血时常用此法。需手术分离股动脉。小鼠的一次采血量可达0.5ml，大鼠可达2.0ml。（4）断头采血（5）心脏采血,狗股动脉取血方法,猕猴后肢静脉取血方法,小白鼠断头取血方法,大白鼠颈静脉取血方法,兔耳缘静脉取血方法,狗颈静脉取血方法,（6）心脏采血：将动物麻醉并仰卧固定置实验台上。心前区皮肤脱毛，常规消毒。于左侧第3、4肋间心尖博动最强处将针头垂直刺入心脏，由于心脏的搏动，血液可自动进入注射器。如无血液流出，拔出针头后重新穿刺，不能左右来回斜穿，以免造成气胸而导致动物很快死亡。经67天后可重复穿刺采血。,（二）尿液采集1.大、小鼠：代谢笼2.兔、犬：导尿管（三）脑脊液采集（四）胸腔积液（五）腹腔液（六）其他：胃液、胆汁、关节液,消化液采集(一)胃液的采集通过刺激，使胃液分泌增加，再用插胃管的办法抽取胃液。(二)胆汁的采集采集胆汁需要施行手术。(三)胰液的采集胰液的采集基本同胆汁的采集。,尿液采集(一)代谢笼动物排便时，可通过笼子底部的大小便分离漏斗，将尿液与粪便分开，达到采集尿液的目的。(二)压迫膀胱(强制排尿)将动物固定，按压骶骨两侧的腰背部或轻轻压迫膀胱的体表部位，使其排尿。,目的：防止动物挣扎，保持安静防止意外损伤，便于操作,实验动物的麻醉,全身麻醉,1%硫喷妥钠:15mg/kg，iv/ip2%戊巴比妥:40mg/kg，iv/ip盐酸氯胺酮:40mg/kg，sc/im复方氯胺酮:0.01ml/kg，sc/im,速眠新(846)注射液,每Kg体重:杂种犬：0.1-0.15ml纯种犬：0.040.08ml猫、兔：0.20.3ml羊、猴：0.10.15ml鼠：0.30.8ml,麻醉方法,1吸入法乙醚、氯仿等挥发性麻醉剂用吸入法麻醉，适用于各种实验动物。大鼠、小鼠可将头部放入蘸有乙醚棉球的广口瓶或干燥器内，46分钟后即处于麻醉状态。如实验过程较长，可在其鼻部放棉花或纱布，不时滴加乙醚维持，也可用乙醚先麻醉后再用非挥发性麻醉剂维持麻醉。,在给药过程中，如果发现动物的角膜反射消失，瞳孔突然放大，应立即停止麻醉。如果呼吸停止，可进行人工呼吸，并配以咖啡因、可拉明等苏醒剂，待恢复自主呼吸后再进行实验。因乙醚易引起上呼吸道分泌物增多，导致窒息，可先注射阿托品预防。,2腹腔和静脉给药麻醉法非挥发性麻醉剂如戊巴比妥钠、硫喷妥钠等巴比妥类药物及水合氯醛、氨基甲酸乙酯等，可用腹腔或静脉注射麻醉。大鼠、小鼠、豚鼠常用腹腔给药麻醉；兔、犬、猴等多用静脉给药麻醉。此法主要用于需麻醉2小时以上的实验，麻醉过程平稳，但麻醉深度和使用剂量较难掌握和控制，一旦过量可引起血压下降和呼吸抑制，可用戊四氮、可拉明等急救。,局部麻醉1%盐酸普鲁卡因，局部注射2%盐酸可卡因，粘膜表面麻醉,局部麻醉方法很多，有表面麻醉，浸润麻醉和阻断麻醉等，使用最多的是浸润麻醉。浸润麻醉是将药物注射于皮内、皮下组织或手术野深部组织，以阻断用药局部的神经传导，使痛觉消失。常用的浸润麻醉药是1%盐酸普鲁卡因，此药安全有效、吸收快、显效快，但失效也快。,施行浸润麻醉时，用皮试针头先皮内注射，然后换局麻长针头，由皮点进针，放射到皮点四周，继续注射，直至要求麻醉区域的皮肤都被浸润为止。根据实验操作要求的深度，可按皮下、筋膜、肌肉、腹膜或骨膜的顺序，依次分别注入麻药，以达到浸润神经未梢的目的。每次注药前，应回抽，以防药液误注于血管内。,麻醉注意事项,所有麻醉药使用过量均可引起中毒，应特别注意各种麻醉药的剂量和用药途径。注射时，一般要求缓慢，并随时观察动物的肌肉紧张性、角膜反射、去痛反射等指标。动物麻醉后体温下降，要注意保暖。万一麻醉过量，应根据不同情况，积极采取措施，如给予苏醒剂，或注射强心剂。,急救与处死原因：麻醉过量、大失血、窒息措施：人工呼吸强心剂：0.1%肾上腺素呼吸兴奋剂：尼可沙米山梗菜碱快速输血、输液处死：安乐死(时间短、痛苦少),空气栓塞：免40ml,狗100ml急性失血：大动物麻醉股动脉放血,实验动物的处死方法,化学药物：二氧化碳，三氯甲烷乙醚，氯化钾，乙醇,脱臼断髓：颈椎脱臼,小鼠颈椎脱臼处死法,废弃物及尸体的无害化处理,一、组织管理在各单位实验动物管理委员会的指导下，所属的动物实验中心（或室）对废物的无害化实行专人领导和专人负责制，并制定相应的规章制度强化动物实验中的废弃物的无害化处理的管理。