（分析化学专业论文）纳米粒子组装电化学发光免疫分析研究.pdf

纳米粒子组装电化学发光免疫分析研究 张毅 摘要 电化学发光( e e l ) 作为一种高灵敏度和高选择性的分析方法已经引起 人们极大的研究兴趣。e c l 分析方法是对电极旌加一定的电压进行电化学反应， 反应产物之间或反应产物与体系中某组分进行化学反应，产生激发态物质，激发 态物质回到基态时产生发光，用光电倍增管等测量发光强度，从而对物质进行痕 量分析的一种方法。电化学发光分析法以其无放射性、方法简便、灵敏度高、选 择性好、可控性强等优点受到人们的广泛关注。近年来，将特异性生物分析和性 能优电的纳米粒子引入分析化学的研究领域，为建立灵敏、快速的分析方法提供 了巨大潜力和发展空间 本论文研究工作旨在研究纳米粒子对电化学发光信号的增强作用。结合分子 识别物质抗原抗体的特异性，建立灵敏、快速、具有实用价值的纳米粒子电化学 发光分析方法和电化学发光免疫分析方法 本论文是由引言和研究报告两部分组成 第一部分引言详细介绍了电化学发光分析的原理、特点和纳米粒子在电化 学发光分析中应用，并对近几年来纳米粒子在电化学发光分析中的研究进展进行 了评述。 第二部分研究报告部分研究了金纳米粒子修饰石墨电极上中性介质中 n ( 4 氨基丁基) n 乙基异鲁米诺( a b e l ) 的电化学发光行为，克服石墨电极上的重 现性差和污染问题，建立了高灵敏检测a b e i 的电化学发光分析方法；以a b e l 为电 化学发光标记物，建立了金纳米粒子修饰石墨电极上测定人免疫球蛋白o l i g g ) 的均 相电化学发光免疫分析方法，克服非均相免疫分析分离步骤繁琐的问题，灵敏、 快速的实现h i g o 的测定l 合成了鲁米诺、地高辛掺杂的二氧化硅纳米粒子，建立 了纳米粒子多标记小分子均相电化学发光免疫分析方法，克服了小分予半抗原难 以标记的困难和提高了免疫分析的灵敏度，灵敏、快速的实现了地高辛及其抗体 的测定。 本文具体研究内容如下： 1 a b e i 在金纳米粒子修饰电极上的电化学发光行为及其测定的研究在金纳 米粒子修饰电极上，研究了a b e i h 2 0 2 的电化学发光行为。0 1 0m o l l 磷酸盐缓 冲溶液( p b s ，p h7 4 ) 中，在o 1 2 0v ( v s a g a g c i ) 范围内，a b e i 在+ 0 4 5 + 0 9 0 v 闻有两个氧化蜂，且a b e i 在金纳米粒子修饰电极上的电化学发光强度提高了数 十倍。基此建立了高灵敏检测a b e l 的电化学发光分析方法。考察了介质、p h 值、 h 2 0 2 浓度、电位施加方式及不问金纳米粒子粒径对a b e l 电化学发光强度和重现 性的影响。在优化的中性条件下可实现对a b e l 的高灵敏分析。a b e l 在1 o x1 0 。1 0 m o l l 一0 1 0 。4 m o l l 范围内呈良好的线性关系，相关系数为o 9 9 3 。对1 0 1 0 - l o m o l la b e l 进行1 1 次平行测量，相对标准偏差为1 9 ，结果满意。由于同一修 饰电极可重复使用5 0 次以上，且同批实验中f 司无需重新处理电极，重现性良好。 2 基于金纳米粒子修饰电极的a b e i 标记电化学发光均相免疫分析法的研究 以人免疫球蛋i ；1 ( h i g g ) 和羊抗人免疫球蛋白( a n t i - h g g ) 为模板考察了在金纳米粒 子修饰石墨电极上a b e l 标记均相电化学发光免疫分析的可行性。根据免疫反应后 a b e l 标记抗体分子与抗原结合形成刚性稳定结构发光较免疫反应前有极大的增 强，对未标记的h i g o 进行均相电化学发光免疫分析电化学发光信号分别与b i g g 浓度和a 埘埘g g 浓度在3 o x l o 1 1 9 m e - 1 o x l f f 5 咖l 和2 0 x 1 0 “g m l - 1 0 x 1 0 9 8 1 m i , 区间里良好的线性关系，该方法对h l g g 和a n t i - k l g g 方法检出限分别为1 0 x 1 0 n g m l 和。对1 0 1 0 l o g m l 的l l i g g 和a n t i - h i g g 进行1 1 次平行测定，相对标准偏 差为3 1 和3 4 将该法用于对血清样品中h i g g 和a n t i - h i g g 含量的测定，结果 满意 3 备米诺、地高辛掺杂二氧化硅纳米粒子( d i g - s i 0 2 1 u m i n 0 1 ) 多标记均相电 化学发光免疫分析法的研究用鲁米诺和地高辛同时掺杂合成二氧化硅纳米粒 子，每个二氧化硅微粒上标记了多个鲁米诺和她高辛分子，克服了电化学发光物 直接标记小分子难以将标记的和提高了标记率利用鲁米诺、地高辛掺杂二氧化 硅纳米粒子与地高辛抗体结合后，分子体积增大，空间位阻增加，单位时间内扩 散到电极表面的鲁米诺、地高辛掺杂二氧化硅纳米粒子数目减少，引起总的发光 值降低，基此建立了小分子地高辛( d i 弘蛐和兔抗人地高辛抗体( a n t i - d i g o x i n ) 均相 电化学发光免疫分析新方法。利用直接法测定地高辛抗体，竞争法测定地高辛的 含量。在选定的实验条件下，当将标记复合物的浓度为1 0 x1 0 6 9 m l ，抗地高辛 抗体稀释了4 0 0 0 0 - - , 1 6 7 倍时电化学发光强度与抗体浓度呈良好的线性关系，地高 辛浓度在5 o 1 0 一o g m i r 3 o 1 0 。g m l 问呈良好的线性关系，方法检出限为1 0 1 0 。1 0g m l 。对1 o x l o a 咖l 的地高辛和稀释1 0 0 0 倍的地高辛抗体进行1 1 次平 行测定，相对标准偏差为4 1 和3 5 。将该法用于血清样品中地高辛和地高辛抗 体含量的测定，结果满意 关键词：电化学发光金纳米粒子二氧化硅纳米粒子异鲁米诺鲁米诺 免疫分析 i l t h e a p p l i c a t i o no fn a n o p a r t i e l e i ne l e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e i m m u n o a s s a y y i z h a n g a b s t r a c te l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) h a sr e c e i v e dm u c ha t t e n t i o n o v e rc o n v e n t i o n a lc h e m i l u m i n e s c e n c eb e c a u s er e a g e n t sa n d p r e c u r s o r sp a r t i c i p a t i n gi n t h er e a c t i o na r c g e n e r a t e d i ns i t uw h e nr e q u i r e da ta r le l e c t r o d e e l e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e i m m t m o a s s a y e c l i aw h i c hu s e sa ne c l s p e c i e s 龋a l a b e lt os t u d y t h er e a c t i o no fa n t i g e na n da n t i b o d ya n dd e t e r m i n a t ea n t i g e n , h a p t e no ra n t i b o d yh a s b e c o m ea ni n c r e a s i n g l yp r o m i s i n gi m m u n o a s s a ym e t h o do w i n gt oi t sn o n - r a d i a t i o n , s i m p l ei n s t r u m e n t a t i o n ，h i g hs e n s i t i v i t y , w i d ed y n a m i cr a n g e 。r e p r o d u c i b i l i t y , s i m p l i c i t y a n d r a p i d i t ya n a l y s i s ，i t sa u t o m a t i o n f r o me l e c t r o c h e m i c a lc o n t r 0 1 t h i st h e s i si n c l u d e 3ar e v i e wa n dar e s e a r c hs e c t i o n i nt h er e v i e w , g e n e r a li n t r o d u c t i o nt oe l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e 饵c l ) a n d e l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ( e c l i a ) i n c l u d i n g i t sp r i n c i p l e ， s y s t e m a n dr e s e a r c h d e v e l o p m e n tw e r ep r e s e n t e d m o r e o v e r , t h ep u r p o s e o ft h i s r e s e a r c hw o r kw a s p r e s e n t e d 1 1 r e s e a r c hs e c t i o nc o n t a i n st h r e es u b a n i t s i nt h er e s e a r c hs e c t i o n , w eh a v ed e v e l o p e de c lo nm o d i f l e de l e c t r o d ew i t h n a n o p a r t i c l e s ，m o r e o v e r a b e i l a b e l e d a n t i - h i g g a n dl u m i n o l - d i g o x i n d o p e ds i 0 2n a n o p a r t i c l e s w a s a p p l i e d i n m u l t i l a b e l e dh o m o g e n e o u se c l i a 1 1 1 em a j o rc o n t e n t si nt h i st h e s i sa r ed e s c r i b e d 鹪 f o l l o w s ： 1 s t u a y o nt h ee l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c eb e h a v i o ro fn - ( a m i n o b u t y l ) - n - e t h y l i s o l u m i n o la tg o l dn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e dg r a p h i t ee l e c t r o d e f i r s t l ye c l b e h a v i o r so fa t g o l dn a n o p a r t i l e sm o d i f i e dg r a p h i t ee l e c t r o d e ( g n m g e ) i nn e u t r a l a q u e o u ss o l u t i o nc o n t a i n i n gh y d r o g e np e r o x i d ew a t ei n v e s t i g a t e d i tw a s f o u n dt h a t , a t g n m g e ，e c li n t e n s i t yo f a b e li np r e s e n c eo f h y d r o g e np e r o x i d ew a sd r a m a t i c a l l y e n h a n c e di nn e u t r a la q u e o u ss o l u t i o n 。t w oa n o d i cc y c l i cv o l t a m m e t r i cp e a k s ( c v p l ， c v p 2 ) w e r eo b s e r v e d a to 5a n do 9 v ( v sa g a g c i ) ，m o o v e rt h ew h o l ec u r r e n t b e c a m eb i g g e ro ng o l dn a n o p a r t i c l e sg r a p h i t ee l e c t r o d et h a nt h o s eo nb a r eg r a p h i t e e l e c t r o d e i td e m o n s t r a t e dt h a tg o l dn a n o p a r t i c l e sc o u l dc a t a l y z et h ea b e li np r e s e n c e i l l o f h y d r o g e np e r o x i d e t h ec a l i b r a t i o nc l l r v ef o ra b e lw a so b t a i n e df r o m3 0 1 0 。1 4t o 1 o 1 0 “m o l l ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw b s1 o 1o 。1 4 t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n w a s1 9 f o re l e v e n s u c c e s s i v e a s s a y sa t1 0 x 1 0 1 1 m o l l a b e i 2 h o m o g e n o u se l e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e i m m u n o a s s a y u s i n g n - ( a m i n o b u t y l ) - n - e t h y l i s o l u m i n o ll a b e l e dh i g gb a s e d o nm o d i f i e dg o l dn a n o p a r t i c l e s o ng r a p h i t ee l e c t r o d ei tw a sf o u n dt h a t ，a tm o d i f i e dg o l dn a n o p a r t i c l e so ng r a p h i t e e l e c t r o d e ，e c li n t e n s i t yo f a b e i l a b e l e da n t i h l g gw a sa l s od r a m a t i c a l l ye n h a n c e da n d a b e i - l a b e l e da n t i - h l g ga l s oh a ss e n s i t i v i t ye c l r e s p o n s ea tt h i sm o d i f i e de l e c t r o d e e c le m i s s i o nw a se l e c t r o c h e m i c a l l yg e n e r a t e df r o mt h ea b e i - l a b e l e da n t i - h i g ga n d i n c r e a s e d m a r k e d l y i nt h e p r e s e n c eo f a n t i g e nd u e t oam o r er i g i ds t r u c t u r eo f t h ea b e i m o i e t y t h e l u m i n e s c e n c e i n t e n s i t y o ft h ea b e i - l a b e l e d a n t i - h l g g - h i g gc o m p l e x e x c e e d e dt h a to fa b e i - l a b e l e da n t i - h l g gi t s e l f , s om g gt h u sc a nb es e n s i t i v i t i e d d e t e r m i n e do ng n m g e b ys u b t r a c t i n gt h eh t m i n e s e e n c ei n t e n s i t yo f a b e l - l a b e l e d a n t i h g gf r o m t h a to f t h ea b e i - l a b e l e d a n t i - h i g g - h i g gc o m p l e x a c a l i b r a t i o nc u r v e f o rh i g ga n da n t i h i g gw 粥s e p a r a t e l yf r o m3 0 x1 0 “t o1 o x1 0 4 9 r r l l c a l i b r a t i o n c n l v eo f h i g ow a so b t a i n e df r o m3 o 1 0 “1t o1 0 x1 0 g g m l n 坨r e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o nv 旧s3 1 a n d3 4 f o rh i g oa n da n t i - h g ow i t he l e v e ns u c c e s s i v ea s s a y sa t 1 0 1 0 1 0g r n la n d1 1 0 0 0d i l u t i o ns e p a r a t e l y s e n s i t i v i t ya n da c c u r a c yo fg o l d n a n o p a r t i d e s m o d i f i e dg r a p h i t ee l e c t r o d ef o rh i g oi nh u m a nc o n t r o ls e n l mw i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t s 3 h o m o g e n e o u s e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y f o r d i g o x i na n t i b o d y a n d d i g o x i n h a p t e n w a s d e v e l o p e d b a s e d o n a l u m t n o l - d i g o x i n d o p e d s i o z n a n o p a t t c l e s an o v e lh o m o g e n e o u se l e c l t o c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a yf o rd i g o x i na n t i b o d y a n dd i g o x i nh a p t e nw a sd e v e l o p e du s i n gal u m i n o l - d i g o x i nd o p e ds i 0 2n a n o p a t i c l e s e c le m i 嚣i o nw a se l e c t r o c h e m i c a l l yg e n e r a t e df r o ml u m i n o l - d i g o x i nd o p e ds i 0 2 n a n o p a t i c l e sa n dd e c r e a s e dm a r k e d l yi nt h ep r e s e n c eo fa n t i - d i g o x i na n t i b o d yd u e t o s t e r i ch i n d r a n c e t h ea n t i 1 0 0r i m ) 。表面原子可以忽略；但当粒子直径逐渐接近原子直径时表面原 子的数目和作用就不能忽略，这时粒子的比表面积、表面能和表面结合能都发 生了很大的变化。人们把由此引起的种种特殊效应统称为表面效应，表面原子由 于周围缺少相邻的原予，有许多悬空键，当遇到其他原子时，能很快结合使其稳 定，所以纳米粒子具有强烈的化学活性。 体积效应 因为纳米粒子是由有限个原子或分子组成的，故原来由无数个原子或分子组 成的集体属性，当粒子的尺寸下降到纳米量级时，它们的物理和化学性质骤然发 生巨大的变化。如金属的纳米粒子的电子结构与大块金属迥然不同。这就是纳米 粒子的体积效应。 量子尺寸效应 量子尺寸效应即k u b o 效应，是指当粒子尺寸下降到某一值时，费米能级附 近的电子能级由准连续变为离散能级的现象。早在二十世纪6 0 年代，k u b o 就提 出了著名的k u b o 公式【3 8 】： a = 2 e f ( 4 n ) 其中a 为能级问距，e f 为费米能级，n 为总电子数。对宏观物体包含无限个原子， n 一8 ，a 一0 ，即对大粒子或宏观物体，能级间距几乎为零；而对纳米粒子，所包含 的原子数有限，n 值很小，这就导致a 有一定的值，即能级间距发生分裂。当能 级间距大于热能、磁能、静磁能、静电能、光子能量或超导态的聚集能时，就必 须考廖k u b o 效应，这就是导致纳米粒子的磁、光、声、热、电及超导电性与宏 观特性有显著的不同 宏观量子隧道效应 微观粒子具有贯穿势垒的能力称为隧道效应。近来，人们发现一些宏观量 如微粒的磁化强度、量予相干器件中的磁通量及电荷等亦具有隧道效应，它们可 以穿越宏观系统的势垒丽发生变化，故称为宏观的量子隧道效应跚。 由于纳米救子具有上述四种效应，这使它莹现许多新异的物理、化学性质 下面介绍纳米粒子因其四种基本性质而产生的独特光学性质、电催化性质和光催 化性质。 1 4 2 纳米粒子的电化学发光光学性质 在纳米粒子光学性质中，红外吸收研究是近来比较活跃的领域之一 3 9 1 。其研 究主要集中在纳米氧化物、氮化物和纳米半导体材料上，如纳米a 1 2 0 3 、f e 2 0 3 、 s n 锄中均观察到了异常的红外振动吸收另外，半导体硅在通常情况下，发光效 率很弱，但当硅晶粒尺寸减小到5l - l l n 或更小时，能观察到很强的可见光发射另 方面纳米粒子本身的化学发光的研究也得到了人们的广泛关注。p o z n y a k 等研究 了量子点的化学发光行为【4 ”。b a r d 研究小组先后报道了纳米硅量子点、 c d s e z n s e 、c d s e 和g e 在有机溶剂中具有良好的电化学发光特性f 1 1 “j 。纳米粒子 化学发光的研究将促进发光器件的研究。j u 等人研究了c d s e 量子点的电化学发光 9 行为，并将其用于过氧化氢的测定，在c d s e 修饰石墨电极，施加电压可观察到电 化学发光行为，加入过氧化氢，可增强电化学发光，基于此检测氧化剂过氧化氢 的含量，检出限为1 0 n o l l 【4 5 1 。 1 4 3 纳米粒子的电化学催化性质 由于纳米材料具有很大的比表面积和高比例的表面原予数，而电化学中的电 催化反应往往需要电极材料表面原子的参与，因此它与传统材料相比具有更高的 电催化活性。 在研究电化学生物传感器研究中，固定化酶的同时引入纳米颗粒，( 1 ) 纳米颗 粒能够增加酶的催化活性，提高电极的响应电流值。( 2 ) 纳米颗粒增强酶在载体表 面上的固定化量；( 3 ) 纳米颗粒对酶在电极上起到定向作用，可以改变酶的微环境， 酶分子在定向之后，其功能会有所改善；( 4 ) 金属纳米颗粒具有良好的导电性和宏 观隧道效应，作为一种固体促进剂，可作为固定酶与电极之间有效的电子媒介体。 唐芳琼等d 6 , 4 7 1 首次研究了二氧化硅和金或铂组成的复合纳米颗粒对葡萄糖生 物传感器电流响应的影响，其效果明显优于这两种纳米颗粒单独使用时对葡萄糖 生物传感器的增强作用其原因是纳米粒子具有吸附浓缩效应、吸附定向和量子 尺寸颗粒效应，复合纳米颗粒比单独一种纳米颗粒更易于形成连续势场，降低电 子在电极和固定化酶间的迁移阻力，提高电子迁移率，因此复合纳米颗粒可以显 著增强传感器的电流响应s t o n e h u e r n e 等p s i 报道了在金溶胶中固定h r p ，鞠煜先 等研究了金纳米自组装在毕胱氨酸修饰的金电极上，h r p 在金纳米促进下的直接 电化学 4 9 1 以及在金溶胶修饰的碳糊电极中h r p 的直接电化学f 铷，董绍俊等【5 l 】 研究了将金纳米粒子自组装到含巯基的溶胶凝胶( m p s ) 三维网状结构上，实现 了h r p 的直接电予转移并制成第三代生物传感器。实验表明，金纳米颗粒可以大 幅度提高固定化酶的催化活性，增大响应电流 1 5 纳米粒子在电化学发光分析法中的应用 近年来，纳米粒子被广泛应用于电化学分析法和电化学生物传感器的研究中 s 2 - 6 2 1 然而，在电化学发光以及电化学发光免疫分析中的研究才刚刚起步。以下 我们对纳米粒子在电化学发光及其在电化学发光免疫分析中的应用研究进展作一 简要评述。 1 , 5 1 金纳米粒子在电化学发光和电化学发光免疫分析中的应用 金纳米粒子，自1 9 7 4 年被报道以后，因其良好的生物相容性，受到分析化学 e c l 1 ： l h 一- e 。呻l h u 哼r + h + ( e = + o 6 7 v ) ( 0 u - + 0 2 斗0 2 0 _ + l ( 2 ) i 少+ 0 2 + l 0 2 ( 3 ) l o ，2 一一a p 2 + n ， h ) a p 2 。- - a p 2 一+ h v ( 5 ) 研究工作者的广泛关注已被作为标记物广泛用于免疫分析和核酸分析中。c u ih u a 等【6 3 研究了中性和碱性溶液中鲁米诺在纳米金自组装金电极表面的电化学发光 性质。实验中发现纳米金自组装石墨电极对鲁米诺电化学发光体系具有优越的电 催化和氧化还原反应特性。中性介质中分别在金电极和纳米金自组装电极上施加 线性扫描电压，发现在纳米金自组装电极上的两个阳极和一个阴极e c l 峰被极大 增强，并且出现一个新的阴极e c l 峰 在碱性溶液里，在自组装电极上的两个阴极e c l 峰要比裸电极上的e c l 峰强 实验中的发现电压的扫描速度、溶液中n 2 、0 2 的浓度、溶液的p h 值以及鲁米诺的 浓度同样对自组装电极上e c l 峰的强度有影响实验结果表明，即使在较宽的电 位范围内进行线性扫描，在纳米金自组装电极上鲁米诺的电化学和电化学发光的 信号响应均有良好重现性和稳定性。该研究小组以认为金纳米粒子能够与电极反 应和后续化学反应向耦合，从而强烈的催化鲁米诺的在0 6 7v 和1 0 5v 处的e c l 峰，可以看出e c l 1 、e c l 2 与的p h 值、鲁米诺浓度成正比。并提出以下可能的 机理； e c l - 2 ： b r 。+ 2 0 h 。- 2 e _ b r o + h 2 0( 色= + 1 0 5 ) ( 1 ) 2 p + 3 b r o + 2 0 h 。_ 卜 2 a p 2 一+ 3 b r - + h 2 0 + n 2 ( 2 ) 首先，由于金纳米粒子有着庞大的比表面积，对周围环境里不同的氧化还原 反应中都具有高度的敏感性l 州。由此它得以加速电极与氧化还原反应之间电子直 接传递的方式来催化电极反应。其次，后续化学反应被催化1 6 ”。由于纳米金粒子 所带的是负电荷，因而在电极袭面不会团聚【6 6 1 。而另一方面，对于金、铂、玻碳 和裂解石墨电极存在着严重的电极污染问题，为了获得e c l 的重现性则必须在每 次测量前都将电极表面进行小心的预处理。然而金纳米自组装电极却不需要测量 前繁琐的预处理。且这种金纳米自组装电极储存在亚沸水中寿命可达3 0 天。 汪尔康小组研究了n 以4 二甲基氨基酪氨酸( d m b a ) 为电化学发光标记物，利 用金纳米放大对生物分子如牛血清蛋i ；i ( b s a ) 和人免疫球蛋白( i g g ) 电化学发光的 测定信号，实验结果表明利用金纳米粒子的放大作用，是该方法的灵敏度提高了 6 - 1 0 倍。当被测连接有d m b a 的抗体分子与有一定r u ( b p y ) 3 2 + 浓度的溶液接触， e c l 信号与标记的抗体分子浓度相关。金纳米粒子由巯基丙醇二酸固定到金电极 表面，再以抗生物素生物素固定d m b a b s a 以及夹心法固定d m b a 1 9 g 。有了金 纳米粒子的放大作用使得更多的标记物d m b a 与r u ( b p y ) 3 ”分子反应，放大被测 e c l 信号。该实验的固定化b s a 和i g g 的示意图如下： 金纳米粒子作为生物分子识别物质的放大载体，得以在有限的电极表面所连 图1 - 5 金纳米粒子放人电化学发光信号检测b s a 和l g g 示意图 f i g 1 - 5s c h e m a t i cd i a g r a m so f i m m o b i l i z a t i o no f b s a ( a ) a n dt g g ( b ) o nt h e g o l de l e c t r o d ew i t hg o l dn a n o p a r t i c l ea m p l i f i c a t i o n 接的捕获分子成倍增加，电极表面的电化学发光活性物质的浓度同样也增加，电 化学发光信号由此被放大、灵敏度大大提高。该方法测定b s a 、i g g 的检出限分别 为1 0r t g m l 和2 0p g m l ，线性范围为1 8 0i _ t g m l 和5 1 0 0 l | t g m l ，灵敏度比直接将 生物识别分子固定在裸电极上高6 - - - 1 0 倍，比传统i 拘r u ( b p y ) 3 2 + 标记方法具有更优的 生物亲和性以及廉价的特点。 然而，金纳米粒子在该方法的应用也存在以下负面影响：( 1 ) 金纳米粒子在电 极表面的氧化电位是1 1 0 v ( a g a g c l ) ，在r u ( b p y ) 3 2 + 的激发电位之前，加过一次电 压后金纳米粒子就已经被氧化了，因而所制成的电极只能测量一次。( 2 ) 金纳米粒 子的氧化造成所固定的生物分子从电极表面流失。( 3 ) 标记在生物分子上的电化学 发光活性物质是d m b a ，仅是r u ( b p y ) 3 2 + 反应的催化剂，并不能像发光物质 r u ( b p y ) 3 2 + 一样可以循环重复使用的| 6 。 1 5 2 半导体纳米粒子在电化学发光和电化学发光免疫分析中的应用 具有生物亲合特点的纳米粒子应用于电化学发光分析以及电化学发光免疫分 析中的作用大致分为以下两类，一方面通过纳米粒子的高比表面积被测生物分子 与电极之间的实现加速电子转移，催化电极反应，从而使后继化学反应和电极过 程与电极反应耦合，增强e c l 信号，提高方法的灵敏度。另一方面，纳米粒子提 供更温和更适合生物氧化还原反应发生的微环境，可以模拟生物体系电子传递机 理和代谢过程，测定热力学和动力学参数，理解和认识生物分子在生命体内的电 子转移机制和生理作用。可用于开发出廉价、简便的生物分子传感器，为生物物 质的检测提供强有力的分析器件。 1 5 2 i 半导体纳米粒子本身的电化学发光 b a r d 研究小组先后报道了纳米硅量子点、c d s d z n s e 、c d s e 和g e 在有机溶剂 中具有良好的电化学发光特性- 4 4 。纳米粒子化学发光的研究将促进发光器件的 研究j u 等人研究了c d s e 量子点的电化学发光行为【4 引，并将其用于过氧化氢的测 定，在c d s e 修饰石墨电极，施加电压可观察到电化学发光行为，加入过氧化氢， 可增强电化学发光，基于此，检测氧化剂过氧化氢的含量，检出限为1 0 p m o l l 1 5 2 2 半导体纳米粒子与电化学发光修饰电极 董绍俊等人1 。1 研究了以层层自组装( l b l ) 技术将s i 0 2 纳米粒子与r 呱b p y ) 3 ”制 成多层复合薄膜对三丙氨( a ) 进行测定电化学发光方法用于探索此种薄膜 的电化学发光行为和性质测定t p a ，实验结果表明用l b l 技术和s i 0 2 纳米粒子 修饰的电极比其他方法固定的电极测定t p a 灵敏度要高一个数量级，电极寿命也 在3 0 天以上研究者们认为这样修饰电极有高的灵敏度和稳定性的原因在于，其 一，带正电荷的r u ( b p y 3 2 + 与带负电荷的s i 0 2 纳米粒子由静电作用力和层层组装技 术固定在氧化铟锡电极表面，不易从电极表面脱落其二，二氧化硅纳米粒子高 比表谣积和高的表面能使得r u ( b p y ) 3 2 + 极易被吸引而稳定的固定在纳米粒子组成 的多层薄膜里。层层组装技术( l b l ) 常常被用予制备由纳米粒子构成的薄膜 7 0 - 7 6 1 ， 由此方法构建的纳米粒子比用高分子聚合物固定法和原位聚合法形成的纳米粒子 有着坚固的构像和强的电子密度。 1 5 2 3 半导体纳米粒子与多标记免疫分析 生物分子例如蛋白、抗体、d n a 、r n a 、细胞的标记方法种类繁多，如染料 分子的标记、酶标记等方法发展较为成熟。纳米技术的发展。使得纳米粒子用于 生物分子标记成为近几年研究的热点修饰免疫金纳米粒子作为拉曼标记，使得 纳米粒子标记与表面增强拉曼光谱相结合实现免疫应答之间的识别检测【7 卜帅】。袁 亚莉等人以钉联吡啶配合物为核，二氧化硅为外壳的荧光纳米粒子制备生物荧光 纳米颗粒，探索了白细胞共同抗原的监测灵敏度和待测样品的荧光稳定性【8 l 】。t a n 等人将发光物质钌联吡啶包埋在有良好光学性质的纳米二氧化硅里，将抗体固定 于发光纳米二氧化硅粒子表面，利用免疫分析法对自血病细胞进行检测。并且以 发光物质掺杂二氧化硅使得每个抗体分子连接了多于原先1 0 0 0 倍阻上的标记量， 方法简便而灵敏度高悼”。 然而，半导体纳米粒子在电化学分析、电化学发光分析中的应用还比较少见， 其中存在半导体纳米粒子导电性不佳的问题，研究者们采用掺杂其他金属离子以 及加强粒子表面修饰的方法努力扩展它们的应用领域。 1 5 3 碳纳米管在电化学发光和电化学发光免疫分析中的应用 1 9 9 1 年i i j i m a 首次用高分辨透射电镜( 1 勘旧意外发现多壁碳纳米管【8 孙，1 9 9 3 年l i j i m a 又发现了单壁碳纳米管i 删。碳纳米管( c n t ) 是具有纳米尺度的圆柱形碳 薄片，具有高的电子传导率、高的化学稳定性和非常大的机械强度和系数。近年 来，c n t 在化学传感器和纳米尺径电子器件尤为引人注目。研究者们发现c n t 自 身极少有缺陷，电子的结构十分完整因丽将c n t 用做电极材料可以有效的提高 反应中分子的电子传导速率口卯但是c n t 几乎不溶于大多数溶剂【9 9 】，因而人们努 力寻找适合的溶剂充分溶解和分散，例如：二甲基甲酰胺【蚓、丙酮f 8 7 】、浓硫酸瞄8 】 等。 蘸绍俊等酬研究了由一种碳绒米管和阳离子交换型薄膜聚合物n a t i o n 结合 r u ( b p y b 2 + l 拘电化学发光，并用于测定草酸盐。阳离子交换型聚合物n a t i o n 包埋 c n t ，r u c o p y ) 3 2 + 通过与n a f i o n c n t 的较强结合作用被固定在玻碳电极表面在复 合膜中有较快的扩散系数，克服了单纯n a 6 0 n 包埋r u ”，的不稳定、泄露和 r u c o p y ) 3 2 + 在膜中扩散较慢等缺点采用c n t 包埋于聚合物膜中，既充当了富集 r u ( b p y ) 3 2 + 的场所，又作) b r u ( b p y b 2 + 氧化还原与电极反应的快速电子通道，其原 因在于n 娟0 n c n t - r u ( b p y ) 3 2 + 复合膜具有开放性的结构和较高的表面积。 综上所述，以纳米粒子在电化学发光和电化学发光免疫中的应用示意图i - 6 。 1 5 4 磁性微粒电化学发光免疫分析法 磁性微粒是指含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末而具有磁响应性的高分 子微粒。它除了具有纳米颗粒的特性外，还可以通过表面的功能基团进行各种表 面的功能化修饰因其具有磁性，可在外加磁场的作用下快速的运动和分离。磁 性微粒的发展在生物医学、细胞学、生物工程及免疫等领域有着广泛的应用前景。 在免疫分析中引进磁性微粒，是近年来才得以发展的方法。将抗原和抗体固定在 磁性微粒上。经免疫反应后，在固相磁性微粒上形成抗原和抗体的复合物，外加 图1 6 纳米粒子在电化学发光和电化学发光免疫中的应崩示意图 a 连接纳米粒子增加生物分子固定量b 包埋法同定纳米粒子修饰电极表面 c ，纳米粒子作为多标记载体放大信号d 纳米粒子固定于载体上以修饰电极表面 f i g1 - 6s c h e m a t i cd i a g r a m so ft h ea p p l i c a t i o nn a n o p a r t i c l ea n dn a n o m a t e r i a li ne c la n de c l i a a i m m o b i l i z a t i o no f b i m o l e c u l a rw i t hn a n o p a r t i c l ea m p l i f i c a t i o n b m o d i f i c a t i o ne l e c t r o d ew i t he m b e d m e n tn a n o p a r t i c l e0 nt h ee l e c t r o d es u r f a c e c a m p l i f i e a t i o ns i g n a lb yc o h e r ew i t hm u l t i l a b e ln a n o p a r t i c l e d 。c o n j u n c t i o nn a n o p a r t i c l ew i t ho t h e rm a t e r i a im o d i f i e do ne l e c t r o d e 磁场沉降复合物，然后洗涤多余的抗原和抗体，或不分离复合物和多余的抗原或 抗体，直接在游离的溶液中进行均相测定。从而使抗原和抗体的分离大大简化。 此方法因磁性微粒的易于分离，可实现均相免疫测定。y u j 9 0 l 等对近年来磁性微粒 在两种固相发光免疫中的应用进行了介绍。k i r s t i n i 引1 等评述了磁性微粒免疫分析 技术。对磁性微粒e c l i a 技术，b l a c k b u m l 9 2 等用e c l i a 技术测定地高辛，用双 抗体央心法测定促甲状腺激素等。邢婉丽等将钉联吡啶电化学发光和磁性微粒技 术相结合对甲磺隆进行测定娜i 。n a m b a 等一4 i 用钉联吡啶衍生物的电化学发光与磁 性微粒结合对a f p 进行了测定，检测限达到5p g m l ，利用此技术还对h l g g 9 5 1 进行了测定。国际上挪威的d y n a l 公司的b y n b e a d s 免疫磁微球产品，瑞士s e r o h o 公司的s e r o z y m e 免疫磁微球产品，加拿大的b i o e h e m i m m u n o s y s t e m s 公司建立的 磁分离均相酶联免疫定量测定技术及仪器等，为免疫领域的诊断提供了可靠的检 测技术。 优化磁微粒的大小、均匀程度和所加外磁场强度是磁微粒技术的关键，也是 近年来磁性微粒技术发展的重要方向之一。然而磁微粒技术仍存在以下缺点有待 克服： ( 1 ) 磁微粒不导电，这些不导电的顺磁性物质分散在大分