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刺参养殖池塘有机物降解微生物的分离筛选 及其特性研究 学位论文完成日期: 指导教师签字: 答辩委员会成员签字: 竺蒸 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,并同意以下 事项: l 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许 论文被查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社用于出版和编入c n k i 中国知识资源总库, 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名c 往 签字日期:伽卜年多月日 导师签字x 础7 签字日期:p 7 年月日 剌参养殖池塘有机物降解微生物的分离筛选及其特性研究 摘要 刺参( a p o s t i c h o p u s j a p o n i c u ss e l e n k a ) 养殖业是一新兴海水养殖产业,主要分 布在大连和山东沿海。自2 0 0 2 年以来,刺参养殖业发展迅速,2 0 0 6 年全国刺参 养殖面积已达到8 4 万公顷,产量达到7 6 万吨,产值接近1 0 0 亿元,成为我国 海水养殖的重要的特色支柱产业。然而,相对于其迅速发展的养殖规模,与刺参 养殖技术相关的基础研究还相对滞后。由于刺参养殖生产带有很大的随意性和经 验性,导致刺参养殖相继出现了一系列问题,制约了该产业的健康发展。其中, 刺参池塘养殖过程中人工补充投饵所致残饵积累及其对池塘和近海造成的潜在 的影响已日益受到人们的关注。 有益微生物在改善和修复水产养殖环境、提高养殖动物生长速度和增强病害 抵抗力方面的应用已非常多,并得到了人们的广泛认可。因此,从刺参养殖池塘 土著微生物中筛选有益微生物,并利用其对刺参养殖池塘污染环境进行调控,改 善并修复养殖水体环境,保持刺参健康生长以及促进该产业的可持续发展具有十 分重要的理论和实践意义。 本研究通过采集刺参养殖池塘中底泥、水体和刺参肠道微生物样品,分别对 其中的常温和低温饵料降解菌以及常温和低温芽孢杆菌降解菌四种菌群进行了 富集驯化和分离筛选,同时,对筛选出的降解效果好的菌株进行了降解特性及优 化组合研究。主要研究结果总结如下: 1 刺参养殖池塘有机污染物降解菌的富集驯化与分离筛选 本研究在常温( 2 8 1 ) 和低温( 1 5 1 ) 两个温度下分别对刺参养殖池 塘中的常温饵料降解菌和低温饵料降解茵进行了富集驯化和分离筛选。根据细菌 对刺参饵料中的有机物、氨氮、淀粉和蛋白四种成分的降解利用效果进行了筛选, 最后筛选到5 株常温饵料降解菌( c r l 、c r 5 、c r l 8 、c r l 9 、c r 2 4 ) 和7 株低 温饵料降解菌( d r 3 、d r 4 、d r 7 、d r 8 、d r l l 、d r l 2 、d r l 3 ) 。研究结果表 明,不同菌株对刺参饵料中各个成分的降解利用效果有所差异。常温菌中,菌株 c r l 和c r 2 4 对c o d 和蛋白的利用效果以最好,5 d 时分别达到了4 1 0 4 4 5 和4 4 3 5 4 5 的去除率,淀粉的利用效果以c r l 8 和c r l 9 的最佳,5 d 的去 除率达4 9 4 - - - 5 7 2 ;低温菌中,c o d 的降解效果以d r 7 和d r 8 的最好,5 d 的去除率达3 7 7 - - 5 0 o ,氨氮的利用效果以d r 7 、d r 8 和d r l l 最佳,5 d 去 除率达9 5 0 9 9 8 。各菌株对淀粉和蛋白有一定程度的降解,但利用率普遍 不高。根据菌株形态特征、生理生化特性以及1 6 sr d n a 序列分析,将c r l 初 步鉴定为短小芽孢杆菌( b a c i l l u sp u m i l u s ) ,c r 5 归属为葡萄球菌属细菌 ( s t a p h y l o c o c c u ss p ) ,c r l 8 归属为芽孢杆菌属细菌( b a c i l l u ss p ) ,c r l 9 和c r 2 4 两菌初步鉴定为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ;将d r 3 、d r 7 、d r l l 、d r l 2 、 d r l 3 五株归属为假单胞菌属细菌( p s e u d o m o n a ss p p ) ,d r 4 归属为放线菌属细菌 ( p l a n t i b a c t e rs p ) ,d r 8 归属为副球菌属细菌( p a r a c o c c u ss p ) 。 2 刺参养殖池塘有益芽孢杆菌的富集驯化与分离筛选 在常温( 2 8 1 ) 和低温( 1 5 1 ) 两个温度下分别对刺参养殖池塘中对 有机污染物具有较好降解效果的常温芽孢杆菌降解菌和低温芽孢杆菌进行了富 集驯化和分离筛选。根据细菌对刺参饵料中的有机物、氨氮、淀粉和蛋白质等4 种成分的降解利用效果进行筛选,最后筛选到5 株常温芽孢杆菌( y 1 1 、y 2 0 、 y 2 2 、y 2 4 、y 2 6 ) 和4 株低温芽孢杆菌降解菌( y d l l 、y d l 3 、y d l 9 、y d 2 0 ) 。 研究结果表明,不同菌株对刺参饵料中各个成分的降解利用效果有所差异。在常 温芽孢杆菌中,y 2 0 、y 2 4 和y 2 6 对c o d 的降解效果最好,5 d 时达到了3 2 9 4 2 3 的去除率;蛋白和淀粉的利用效果普遍较好,以y 2 2 和y 2 6 的最佳,5 d 的去除率分别达3 4 4 - 4 9 1 、6 6 9 , - 。6 8 7 ;各菌株对氨氮利用普遍不佳, 相对而言,菌株y 2 4 和y 2 6 有一定的氨氮控制和去除效果;在低温芽孢杆菌中, 菌株y d l l 对c o d 和氨氮的降解效果最好,5 d 的去除率分别达5 0 0 、9 8 0 ; 而y d l 3 、y d l 9 、y d 2 0 对蛋白和淀粉的降解效果好;5 d 的去除率分别为2 9 8 6 3 9 、4 0 6 - - 5 3 2 。根据菌株形态特征、生理生化特性以及1 6 s rd n a 序列 分析,菌株y l l 、y 2 0 归属为芽孢杆菌属细菌( b a c i l l u ss p p ) ,y 2 2 初步鉴定为 腊样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) ,y 2 4 初步鉴定为短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) , y 2 6 初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌( b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ) , y d l l 、y d l 3 、 y d l 9 、y d 2 0 四株细菌归属为芽孢杆菌属细菌( b a c i l l u ss p p ) 。 3 几株有机污染物降解菌株特性研究 本研究以菌株对刺参饵料中的有机物和氨氮两种成分的降解利用效果为依 据,对刺参养殖池塘中筛选的3 株对有机污染物降解效果较好的低温饵料降解菌 ( d r 7 、d r 8 和d r l1 ) 的特性进行了比较研究。研究结果表明,3 菌株对饵料 中有机物和氨氮都有很好的降解去除作用,降解动态过程显著,其中以d r 8 的 降解性能最佳,该菌株以刺参饵料为唯一营养源,低温( 1 5 ) 、低接种量( 5 ) 条件下能同时高效降解饵料中的有机物和氨态氮,5 d 期间对富集培养基中c o d 和n i - 1 4 - n 的最高降解率分别达5 4 4 和9 9 。进一步研究表明,菌株d r 8 生长 适温1 5 - 3 0 ,生长适宜p h 7 - - 一1 0 ,降解刺参饵料中c o d 和n h 4 - n 的最适温 度条件为1 5 2 0 、最适p h 条件为8 0 - - 8 5 ;在最适降解条件下、接种量为5 o 时,对1 0 , 、, 2 0 9 l 高质量浓度的刺参饵料液中c o d 降解效果显著,3 d 时间去除 率达5 6 9 6 5 7 ,对1 , - , 2 0 9 l 质量浓度的刺参饵料液中n h 4 - n3 d 时间的去 除率达9 1 7 - 9 9 9 。根据形态特征、生理生化特性以及基于1 6 sr d n a 序列 分析,菌株d r 7 和d r i1 归属于假单胞菌属细菌( p s e u d o m o n a ss p ) ,d r 8 归属为 马氏副球菌( p a r a c o c c u sm a r c u s i i ) 。 4 几株有益菌株优化组合及其降解效果研究 本研究以菌株对刺参饵料中的有机物和氨氮两种成分的降解利用效果为依 据,对刺参养殖池塘中所筛选出的效果较好的有机污染物降解菌进行了优化组合 及降解效果研究。研究结果表明,与最佳对照单菌株比较,各组合菌对饵料c o d 和氨氮的降解效果有所差异。通过比较,常温饵料降解菌以c r 5 c r l 9 组合为最 佳,5 d 的c o d 和氨氮去除率分别为4 5 o 、7 0 3 ;低温饵料降解菌以 d r 4 d r 7 d r l1 最佳组合,5 d 的c o d 和氨氮去除率分别为4 9 4 、9 8 4 ; d r 7 d r ll 组合对氨氮降解效果亦较佳,去除率达到9 6 7 。常温芽孢杆菌中, 以组合y 1 1 y 2 6 对有机物和氨氮降解效果最佳,能同时有效利用饵料中有机物 和氨氮,而y 1i - y 2 4 组合对有机物降解效果最佳,5 d 的c o d 去除率为4 4 0 , 显著优于对照单菌株;低温芽孢杆菌中,有机物降解最佳组合为 y d l l y d l 3 y d l 9 ,5 d 的c o d 去除率为7 5 9 ,氨氮降解最佳组合为 y d l 1 - y d 2 0 ,5 d 的氨氮去除率达到了9 1 6 。 关键词:参池,降解微生物,富集驯化,分离筛选,降解特性 s t u d i e so hs c r e e n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no f m i c r o o r g a n i s m sw i t hh i g ho r g a n i c - p o l l u t a n t s - d e g r a d i n g c a p a b i l i t yf r o ms e ac u c u m b e r ( a p o s t i c h o p u s j a p o n i c u s s e l e n k a ) c u l t u r ep o n d s a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , f o u rk i n d so fb a c t e r i a , n o r m a lt e m p e r a t u r ef e e d d e g r a d i n gb a c t e r i a , l o wt e m p e r a t u r ef e e d d e g r a d i n gb a c t e r i a , n o r m a lt e m p e r a t u r eb a c i l l u sb a c t e r i a , l o w t e m p e r a t u r eb a c i l l u sb a c t e r i a , w e r ei s o l a t e da n ds e l e c t e dw i t has e r i e so fl a b o r a t o r y e x p e r i m e n tm e t h o d s ,r e s p e c t i v e l y , a f t e re n r i c h i n ga n dc u l t u r i n gt h eb a c t e r i a ls a m p l e s t a k e nf r o ms e ac u c u m b e r ( a p o s t i c h o p u s j a p o n i c u ss e l e n k a ) o u t d o o rp o n d s t h e nw e s t u d i e do p t i m i z i n ga n dc o m p o u n d i n go fh i g he f f e c t i v es t r a i n s ,s p e c i f i c d e g r a d i n g c h a r a c t e r i s t i c so fs o m es p e c i a ls t r a i n s ,a l lo fw h i c hw e l es c r e e n e df r o mf o u rk i n d so f b a c t e r i aa b o v e t h em a i nr e s u l t sa l ed e t a i l e da sf o l l o w s : 1 b o t ht h en o r m a la n dl o wt e m p e r a t u r ef e e d - d e g r a d i n gb a c t e r i aw e r ei s o l a t e da n d s c r e e n e df r o ms e ac u c u m b e rc u l t u r i n gp o n d sa f t e rt h ep r o c e s so fe n r i c h m e n ta n d d o m e s t i c a t i o nu n d e rt h en o r m a lt e m p e r a t u r eo f ( 2 8 士1 ) a n dl o wt e m p e r a t u r eo f ( 15 士1 ) ,r e s p e c t i v e l y a n df i v en o r m a lt e m p e r a t u r e s t r a i n sa n ds e v e nl o w t e m p e r a t u r es t r a i n sw e r es e l e c t e de v e n t u a l l y , n a m e dc r l ,c r 5 ,c r l8 ,c r l9 , c r 2 4a n dd r 3 ,d r 4 ,d r 7 ,d r 8 ,d r ll ,d r l2 ,d r l3r e s p e c t i v e l y a l lo ft h e s e s t r a i n sc a l lh i g h l yd e c o m p o s es o m ec o m p o n e n t so fs e ac u c u m b e rf e e d ,s u c ha s o r g a n i cc o m p o u n d s ,a m m o n i an i t r o g e n ,f e e da m y l u ma n dp r o t e i n s t h es t u d i e s s h o w e dt h a td e g r a d i n gc a p a b i l i t yo fs t r a i n sv a r yf r o me a c ho t h e ri nt e r m so fe a c h c o m p o n e n to fs e ac u c u m b e rf e e d i nn o r m a lt e m p e r a t u r eb a c t e r i a , c r la n dc r 2 4 a l et h eb e s td e g r a d i n gs t r a i n si nt e r m so fo r g a n i cc o m p o u n d sa n df e e dp r o t e i n s w i t l ll l i g hd e g r a d a t i o nr a t eo f41 0 - - 4 4 5 a n d4 4 3 - - - 5 4 5 r e s p e c t i v e l y , i n f i v ed a y s a st of e e da m y l u m ,c r l8a n dc r l9a r et h eb e s to n e sw i t hd e g r a d a t i o n r a t eo f4 9 4 - 5 7 2 i nf i v ed a y s w h i l ei nt e r m so fa m m o n i an i t r o g e n ,a l lo ft h e d e g r a d i n gs t r a i n sb e h a v e db a d l y i nl o wt e m p e r a t u r eb a c t e r i a , d r 7a n dd r 8a r e t h eb e s td e g r a d i n gs t r a i n si nt e r m so fo r g a n i cc o m p o u n d sw i t hh i g hd e g r a d a t i o n r a t eo f3 7 7 - 5 0 o i nf i v ed a y s a n dd r 7 ,d r 8a n dd r i1a r et h eb e s to n e si n t e r m so fa m m o n i an i t r o g e nw i t i ld e g r a d a t i o nr a t eo f9 5 0 - - - 9 9 8 i nf i v ed a y s a 儿t h es t r a i n sc a nd e c o m p o s ef e e da m y l u ma n dp r o t e i n s ,b u td e g r a d a t i o nr a t e sa r e n o tv e r yh i 曲b a s e do nt h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s t sa n dt h e16 s r d n a s e q u e n c es i m i l a r i t ya n a l y s i s ,s t r a i nc r lw a si d e n t i f i e da sb a c i l l u sp u m i l u s , c r 5a ss t a p h y l o c o c c u ss p ,c r l8a sb a c i l l u ss p ,c r l9a n dc r 2 4a sb a c i l l u s s u b t i l i s ,s t r a i n sd r 3 ,d r 7 ,d r ll ,d r l 2a n dd r l3w e r ei d e n t i f i e da s p s e u d o m o n a ss p p ,s t r a i nd r 4a sp l a n t i b a c t e rs p ,a n dd r 8a sp a r a c o c c u ss p 。 2 b o t ht h en o r m a la n dl o wt e m p e r a t u r eb a c i l l u sb a c t e r i aw e r ei s o l a t e da n ds c r e e n e d f r o ms e ac u c u m b e rc u l t u r i n gp o n d sa f t e rt h ep r o c e s so fe n r i c h m e n ta n d d o m e s t i c a t i o nu n d e rt h en o r m a lt e m p e r a t u r eo f ( 2 8 a :1 ) a n dl o wt e m p e r a t u r eo f ( 15 + 1 ) ,r e s p e c t i v e l y a n d f i v en o r m a lt e m p e r a t u r es t r a i n sa n df o u rl o w t e m p e r a t u r es t 阳i i 硌w e r es e l e c t e de v e n t u a l l y , n a m e dy ll ,y 2 0 ,y 2 2 ,y 2 4 ,y 2 6 a n dy d l l ,y d l 3 ,y d l 9 ,y d 2 0r e s p e c t i v e l y a l lo ft h e s es t r a i n sc a nh i g h l y d e c o m p o s es o m ec o m p o n e n t so fs e ac u c u m b e rf e e d ,s u c ha so r g a n i cc o m p o u n d s , a m m o n i an i t r o g e n , f e e da m y l u ma n dp r o t e i n s t h es t u d i e ss h o w e dt h a td e g r a d i n g c a p a b i l i t yo fs t r a i n sv a r i e sf r o me a c ho t h e ri nt e r m so fe a c hc o m p o n e n to fs e a c u c u m b e rf e e d i nn o r m a lt e m p e r a t u r eb a c t e r i a , y 2 0 ,y 2 4a n dy 2 6a l et h eb e s t d e g r a d i n gs t r a i n si nt e r m so fo r g a n i cc o m p o u n d sw i t hh i g l ld e g r a d a t i o nr a t eo f 3 2 9 4 2 3 i nf i v ed a y s a st ot h ed e g r a d i n go ff e e da m y l u ma n dp r o t e i n s ,a l l t h es t r a i n sb e h a v e dw e l l ,a n dy 2 2a n dy 2 6a r et h eb e s to n e s 谢n ld e g r a d a t i o nr a t e o f6 6 9 - 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