（光学专业论文）多光子显微成像技术用于硬皮病诊断的研究.pdf

福建师范大学理学硕士学位论文 i i 伽 遣 l 妒 詹 摘要 a b s t r a c t i i l ll li lli l l li l li l lu l 、t18 0 6 4 13 b a s e do nt h et w o p h o t o ne x c i t e df l u o r e s c e n c e ( t p e f ) a n ds e c o n dh a r m o n i c g e n e r a t i o n ( s h g ) ，m u l t i p h o t o nl a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ( m p l s m ) g a i n sa l la d v a n t a g e o v e rc o n v e n t i o n a l t e c h n o l o g i e sa n dc a np r o v i d et h ec o n s i d e r a b l ei n f o r m a t i o no n p a t h o l o g ya n dc l i n i cd i a g n o s i s t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yw a st od e m o n s t r a t em p l s m s r o l ei nd i s c r i m i n a t et h en o r m a ls k i nf r o mt h es c l e r o d e r m as k i n 1 1 1 em o r p h o l o g i c a l d i f f e r e n c e sb e t w e e nt h en o r m a ls k i na n dt h es c l e r o d e r m a t o u ss k i nw e r ef i r s t l y i n v e s t i g a t e d a n ds e v e r a lq u a n t i t a t i v ep a r a m e t e r sw i t hr e l a t i o nt ot h ec l i n i c a ls y m p t o mo f l s ，s u c ha st h et h i c k n e s so fe p i d e r m i s ，t h eo r i e n t a t i o nr a t i oi n d e xo fc o l l a g e nb u n d l e s ( o r i c b ) ，t h es p a c i n go fc o l l a g e nf i b r i na sw e l la st h es h gt ot p e fi n d e xo fd e r m i s ( s t i d ) ，w e r ed e v e l o p e dt od i f f e r e n t i a t et h es c l e r o d e r m a t o u ss k i nf r o mt h en o r m a ls k i n o u rr e s u l t ss h o w e dt h a tm p l s mh a da na b i l i t yt od i s c r i m i n a t et h es c l e m d e r m a t o u ss k i n f r o mt h en o r m a ls k i no nm o r p h o l o g ya n dp r o v i d ec r u c i a li n f o r m a t i o no ft h ed i s e a s e d t i s s u ea tt h es u b c e l l u l a rl e v e l o u rd a t ai n d i c a t e dt h a tt h ed i f f e r e n c e so ft h e s ed e v e l o p e d p a r a m e t e r sb e t w e e nt h en o r m a ls k i na n dt h es c l e r o d e r m a t o i l ss k i nw e r es i g n i f i c a n ta n d 廿1 e yw e r ea b l et ob eu s e da si n d i c a t o r st od i a g n o s es c l e r o d e r m aa n da s s e s sp h y s i o l o g i c a l a n dp a t h o l o g i c a ls t a t e so fl e s i o n a lf i s s u s e w i t ht h ea d v e n to fc l i n i c a lp o r t a b i l i t yo f t y p i c a l 中l s m t h i st e c h n i q u eh a st h ep o t e n t i a lt ob ea p p l i e di nv i v ot o c l i n i c a l d i a g n o s i so fl sn o n i n v a s i v e l ya sw e l la sm o n i t o r i n gt h et h e r a p yr e s p o n s e k e yw o r d s ：m u l t i p h o t o nl a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ；s c l e r o d e r m a ；t w o - p h o t o ne x c i t e d f l u o r e s c e n c e ；s e c o n dh a r m o n i cg e n e r a t i o n ；c o l l a g e n ；e l a s t i cf i b e r i i i 福建师范大学理学硕士学位论文 i v 吣 0 f 少 0 中文文摘 中文文摘 1 9 9 0 年，美国康奈尔大学的d e n k 和w e b b 等人在s c i e n c e 上撰文首次提出了双 光子激发荧光( t w o - p h o t o ne x c i t e df l u o r e s c e n c e ，t p e f ) 显微成像技术。从此之后， 该项技术的研究与应用越来越受到人们的关注。双光子激发荧光显微镜已经成为生 物学、医学、材料学等科研领域的重要工具。双光子激发荧光显微镜主要是利用内 源性荧光物质或者外源性荧光染料分子的双光子激发荧光信号来直接获取物质内部 的微观图像，例如在生物医学应用中，通过激发生物组织内源性双光子荧光信号， 在不用做染色处理的情况下，我们可以直接观察细胞及细胞间质的结构。二次谐波 ( s e c o n dh a r m o n i cg e n e r a t i o n ，s h g ) 显微成像技术于2 0 世纪8 0 年代被提出，而直 到2 0 世纪9 0 年代末才开始在高分辨率显微镜中得到应用。该技术也是利用生物组 织的内源性信号进行成像，主要是具有非中心对称结构的生物组织，例如胶原纤维， 生物膜等。由于双光子显微成像技术和二次谐波显微成像技术都涉及多个光子与物 质相互作用过程，因此在本论文中，我们将这两种技术合称为多光子显微成像技术。 鉴于多光子显微成像技术在疾病临床诊断和生物学基础研究中的优势，我们将这一 技术应用到临床医学中常见的一种皮肤病一硬皮病的研究中，旨在为临床早期诊断 硬皮病提供一种有效的途径，并为以后临床治疗提供指导。利用实验室现有的设备 一l s m5 1 0m e t a 多光子显微镜，通过设计合理的试验方案，我们获得了人体正常 皮肤和硬皮病病变皮肤组织的大面积的t p e f s h g 图像。在形态学上，我们对比了 两者的区别，特别是真皮乳突、毛细血管、胶原和弹力纤维的结构和含量的变化。 并且，在形态对比的基础上，我们提出了一些参数来定量分析两者的差异，例如表 皮厚度，胶原束方向比，胶原原纤维间距，二次谐波信号与双光子荧光信号强度之 比等。实验结果表明，多光子显微成像技术可以用于区分人体正常皮肤和硬皮病病 变皮肤，并且各个参数在正常皮肤和病变皮肤中有显著差异。因此，多光子显微成 像技术有望成为临床早期无损诊断硬皮病的有力工具。 在绪论中，首先介绍了本课题的研究背景，概述了硬皮病的基本知识，从硬皮 病的病理生理特性特征到临床表现都一一作了介绍，接着详细阐述了国内外硬皮病 临床诊断技术的研究概况，明确指出了硬皮病临床诊断的研究落后于实践对它提出 的要求。目前，利用光学方法，特别是现代激光技术来实现硬皮病的无损诊断越来 v 。 福建师范大学理学硕士学位论文 越受到人们的关注，这就是本论文的立题依据。最后列出本论文的主要内容。 在第一章中，首先阐述了多光子显微成像技术的基本原理一双光子激发荧光和 二次谐波，从物理概念及其理论推导出发，详细说明了这种技术的理论依据。为更 加深入地理解生物组织的荧光信号的来源，在讨论成像原理的基础上，接着介绍了 生物组织内的内源性荧光物质及其荧光特性。 在第二章中，首先介绍了多光子显微成像设备的三个主要组成部分一钛宝石飞 秒激光器( m i r ao p t i m a9 0 0 一f ，c o h e r e n t ) 、激光扫描共焦倒置显微镜( a x i o v e r t2 0 0 ， z e i s s ) 和m e t a 探测器，并对其各部分的性能参数作了详细描述。另外，经过不断 的科学实验，我们总结了一种对细胞和细胞外间质成分进行同时无损探测的方法。 在第三章中，基于生物医学光学的原理和技术，我们设计了测量硬皮病病变皮 肤光学特性参数的实验方案。利用多光子显微成像设备，分别对人体正常皮肤和硬 皮病病变皮肤进行成像( 激发波长是8 1 0n l n ，功率小于1 0 m w ) ，并获得了人体正 常皮肤和硬皮病病变皮肤的高分辨率、高对比度、大面积的t p e f s h g 图像。首先 从形态学上比较了两者的差异，发现真皮乳突、毛细血管、胶原纤维和弹力纤维排 列方式与数量的变化比较显著。另外，为了定量评价形态学上的差别，我们定义了 一些参数，例如表皮厚度、胶原纤维束方向比、胶原原纤维间距、二次谐波信号与 双光子激发荧光信号强度之比等，统计分析结果表明，这些参数的差异性非常显著 ( p 0 0 5 ) 。病变皮肤表皮最小厚度 为4 4 o 7 0 m ，与正常皮肤差异有显著性( p = 0 0 4 9 ) 。病变皮肤基底层与棘细胞 层之比( 黑色素含量) 为1 7 9 + o 2 4 ，显著高于正常皮肤的值( p = 0 0 0 8 ) 。病变皮 肤棘层与真皮乳突层之比( 真皮反射指数) 为1 0 6 + o 2 0 ，与正常皮肤相比，差异性 极其显著( p = 0 0 0 0 0 0 6 ) 。真皮乳突顶部与有血流血管的距离为1 8 o m - 2 2 7 m ， 中位值1 8 2 m ，与正常皮肤比较，差异有显著性( p 0 0 0 1 ) 。以上实验数据表明， 系统性硬皮病病变皮肤表皮最小厚度增加，与表皮钉突或者真皮乳突的消失有关。 病变皮肤中黑色素含量的增加反映了炎症后的色素沉积。在正常人体皮肤的真皮乳 突中，胶原纤维疏散分布，呈背景明亮的网状，胶原纤维束比周围基质有较强的反 射率，真皮乳突反射率比棘细胞层低；系统性硬皮病患者真皮乳突附近的基底层比 棘细胞层反射强，真皮乳突中由于过量沉积的胶原纤维而反射率较高，类似于棘细 胞层，且呈均质样；真皮血管网的毛细血管由于管壁纤维化造成管腔狭窄、血流受 福建师范大学理学硕士学位论文 限，而且由于胶原纤维的增生血管数目明显减少。而且，这些血管的反射率较低， 表明血流流速减慢。真皮乳突顶部与有血流血管的距离的增加就反映了胶原的沉积 对血管的影响，文章的图中可以看到真皮乳突顶部由胶原纤维形成了一个帽状结构。 与其他参数相比，真皮乳突顶部与有血流血管的距离似乎是诊断系统性硬皮病的一 个敏感参数，所有人体正常皮肤都显示与硬皮病病变皮肤有显著不同的数值。实验 结果证明系统性硬皮病病变皮肤的确具有激光扫描共聚焦显微镜可分辨的特征，因 此，激光扫描共聚焦显微镜技术在系统性硬皮病早期无损诊断方面有巨大的应用前 景。然而，由于自身构造的局限性，激光扫描共焦显微镜也有一些缺点：激光扫描 共焦显微镜大多采用短波长激光( 紫外光或蓝紫光) 作为光源，因此容易对生物组 织样本，尤其是活体生物组织样本造成不可逆损伤。而且根据生物医学光学原理， 人体皮肤是一个相对于可见光区是不透明的吸收体和散射体，随着波长的增加，光 在皮肤中的穿透深度会增大，即所谓的“光学窗1 ：2 1 ”理论瞄j ，因此，采用短波长的 激光作为光源会限制激光扫描共焦显微镜的成像深度。即使不使用短波长激光，由 于采用单光子激发荧光机制( 荧光物质的原子吸收一个短波长光子跃迁到激发态， 经一定弛豫时间，在返回到基态的过程中辐射一个长波长光子) ，导致激发体积相对 较大( 与双光子荧光显微镜相比) ，背景较强，从而引起焦点外区域的光学损伤和光 漂白现象，影响图像的对比度，降低图像质量，可能会影响病理信息的采集。以上 所列举的这些不利因素使得激光扫描共焦显微镜在疾病的早期诊断中的应用受到一 定的限制。基于双光子激发荧光和二次谐波技术的多光子激光扫描显微镜 ( m u l f i p h o t o nl a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ，m p l s m ) 是对传统共聚焦显微镜的一次 飞跃式的改进，在克服了普通共焦显微镜的缺点的基础上，又增添了一些无与伦比 的优势。多光子激光扫描显微镜【2 6 。3 0 】采用超快固态激光器( 多为钛宝石激光器) 作为 光源，波长在近红外到红外波段，脉冲宽度可以达到飞秒( 1 0 1 5s ) 量级，具有非常高 的峰值功率和较低的平均功率。由于双光子激发荧光可以把激发体积限制在非常小 的体积( 通常是l o 1 5l ) ，所以多光子激光扫描显微镜图像的背景更低，信噪比更高， 同时减少了光损伤和光漂白，对活体组织的病理生理研究有着非常重要的应用价值。 二次谐波是具有各向异性结构的物质对强激光的散射而生成的信号，因为其生成过 程不涉及能量的吸收和辐射，即该过程中物质本身的原子结构不发生任何变化，所 以二次谐波不会对活体组织产生任何光学损伤，是一种非常理想的活体成像技术。 多光子激光扫描显微镜配置高数值孔径的物镜聚焦激光束同时收集焦点处发出的荧 绪论 光信号( 包括散射和漫反射的荧光) ，在提高了分辨率的同时又大大提高了图像信噪 比。并且由于多光子激光扫描显微镜所用的激发光是红外或者近红外激光，波长较 长，激发光的散射损失很小，所以其对样品的穿透能力更强。最重要的是，多光子 激光扫描显微镜可以利用内源性物质的荧光信号进行成像，即在无需# l - 力n 其它荧光 染料的情况下，观察物质的自发荧光信号，例如角蛋白、黑色素、辅酶、黄素、弹 力纤维、胶原纤维等，这样就避免了外加荧光染料( 一般具有毒副作用) 对活体组 织的影响。因此，多光子激光扫描显微镜克服了以上各种无损诊断技术的缺点，并 且具有其它技术不可替代的优势，能够对生物组织进行高分辨率高对比度无损伤成 像，使得它在生物学和医学领域中发挥着越来越重要的作用。近来，多光子激光扫 描显微镜已经应用到人体皮肤去研究药物的皮肤穿透【3 1 3 3 1 ，皮肤癌【3 4 3 5 1 和皮肤光老 化【3 6 。7 1 等。 然而，就我们所知，到目前为止，很少有关于多光子显微成像技术用于研究硬 皮病的报告。本论文第一次将多光子显微成像技术用于鉴别人体正常皮肤和硬皮病 病变皮肤，并与传统的组织病理学方法作比较，旨在证明多光子显微成像技术可以 用于硬皮病的诊断，为以后多光子显微成像技术的临床应用提供第一手资料。本实 验结果填补了多光子显微成像技术在硬皮病研究方面的空白，将极大地促进硬皮病 发病机理、临床诊断和治疗的相关研究。随着小型化便携式多光子激光扫描显微镜 的出现，多光子显微成像技术必将成为临床无损诊断硬皮病的强有力的工具。 第二节本论文的主要内容 在本论文中，我们利用多光子激光扫描显微镜，分别对人体正常皮肤和硬皮病 病变皮肤组织进行成像，获得了人体正常皮肤和硬皮病病变皮肤的大面积的 ，i p e f s h g 图像。首先我们从形态学角度比较两者之间的差异，例如真皮乳突，胶 原纤维，弹力纤维，毛细血管等的变化。为了更加客观的描述这些差异，设置了相 应的参数分别对这些差异进行定量评价，例如表皮厚度的大小可以说明真皮乳突的 变化，胶原纤维束方向比可以证明胶原束的平行排列程度，胶原原纤维间距可以表 征胶原增生的程度，二次谐波信号与双光子激发荧光信号强度之比可以表明胶原在 真皮中的相对含量( 沉积程度) 等。统计分析结果表明在人体正常皮肤和硬皮病病变 皮肤中，这些参数的差异性非常显著( p 一x ，少专- y ，z 专一z 的坐标变换下，豆和尹都改变了方向，所以 一尸2 o ) = 岛z 2 q k ，) ：云q k 近k 一。+ ， ( 2 1 6 ) 埘- 月 ( 1 1 4 ) 根据中心对称的要求，声( 2 o ) 不应该改变，所以如果上式成立，唯一的可能是 又因为 剐o ) = 0 e ( c o m ) 0 e 慨) 0 ( 2 1 7 ) ( 2 1 8 ) 故只有 呻 z ( 2 h ，) = 0 ( 2 1 9 ) 因此，具有中心对称的介质，偶数阶非线性效应是不存在的。由于二次谐波是 一个二阶非线性效应，所以只有各向异性的介质才能产生二次谐波信号。反过来， 福建师范大学理学硕士学位论文 如果介质能观察到二次谐波，则说明该介质具有各项异性，因此二次谐波可以用于 描述介质材料的性质。 第四节生物组织的荧光特性 随着荧光标记技术和光学成像技术的发展，生物组织活体荧光成像已经发展成 为一种崭新的检测手段，在生命科学、医学研究及药物研发等领域得到了广泛应用。 按照荧光来源的不同，生物组织荧光物质可以分为内源性荧光物质和外源性荧光物 质。在此，我们只讨论内源性荧光物质。生物组织的内源性荧光物质按位置不同可 分为两类1 2 。4 】：一类是细胞内荧光物质，这些荧光物质主要是细胞内的氨基酸和维 生素衍生物，例如色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，维生素a ，核黄素，还原烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸( n a d h ) 和吲哚胺衍生物；另一类是细胞外荧光物质，这些荧光物 质主要是细胞外基质，包括胶原和弹力蛋白等。在此，我们将几种常见的荧光物质 的激发过程及激发波长列举在表l 中。 表2 1 _ 内源性荧光分子的多光子激发特性拌：2 p e 是指双光子激发，堋：3 p e 是指三光子激发， 串：s h g 是指二次谐波 t a b 1m u l t i p h o t o ne x c i t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fi n t r i n s i cf l u o r e s c e n t m o l e c u l e s 撑：2 p ed e n o t e s t w o p h o t o ne x c i t a t i o n ，群群：3 p ed e n o t e st h r e e p h o t o ne x c i t a t i o n ，木：s h gd e n o t e s s e c o n dh a r m o n i c g e n e r a t i o n 第一章多光子显微成像技术的基本原理 第五节本章小结 本章从双光子激发荧光和二次谐波的基本原理出发，详细叙述了多光子显微成 像技术的物理机制。通过对双光子激发荧光和二次谐波定义的解释，再结合公式推 导，以便更加深刻的理解这种技术的物理原理。另外，为了更好地理解荧光信号的 来源，我们描述了生物组织内常见的内源性荧光物质及其荧光特性。 j 福建师范大学理学硕士学位论文 - 1 4 第二章实验装置 第二章实验装置 第一节前言 本章主要介绍了实验中用到的仪器- l s m 5 1 0m e t a 多光子显微成像系统f m 】。 该系统主要包括钛宝石飞秒激光器( m i r ao p t i m a9 0 0 一ec o h e r e n t ) 、共焦扫描显微镜 ( a x i o v e r t2 0 0 ，z e i s s ) 和探测器等。本章详细叙述了该设备的主要部件的结构和性能 参数。另外，我们还描述了一种对细胞和细胞外间质进行无损实时检测的方法川。 第二节实验仪器及其性能 1 实验设备总体布局 本实验中使用的多光子显微成像系统主要有以下几部分构成：钛宝石飞秒激光 器( m i r ao p t i m a9 0 0 f ，c o h e r e n t ) 、激光扫描共焦倒置显微镜( l s m 5 1 0a x i o v e r t2 0 0 ， z e i s s ) 季l 探测系统，各实验装置分别如图2 - l 和图2 2 所示： 图2 - 1 钛宝石飞秒激光器( m i r ao p t i m a9 0 0 一f ) f i g 2 1t i ：s a p p h i r el a s e rf m i r ao p t i m a9 0 0 - f ) 福建师范大学理学硕士学位论文 图2 2 倒置激光扫描共焦显微镜和m e t a 探澳8 器 f i g 2 - 2i n v e r t e dl a s e rs c a n n i n ge o n f o e a lm i e r o s e o p e ( a x i o v e r t2 0 0 ) a n dm e t ad e t e c t o r ( 1 e f t ) 实验装置的光路图如图2 3 所示。钛宝石激光器作为光源，由激光器发出的光 经过声光调制器( a o m ) 把功率调节至适当大小，然后经过一个双色分光镜( m d b s ， 长波长光反射，短波长光透射) 反射到共焦扫描显微镜( a x i o v e r t2 0 0 ) 当中，经物 镜聚焦在实验样品上。激发光与实验样品相互作用产生的信号光包括透射光和后向 散射光。透射信号光被载物台下面的光电倍增管( p m ) 接收。本次实验中，我们 只研究由样品激发出的背向信号光。背向信号光经同一物镜收集沿原光路返回，再 经m d b s 透射( 信号光波长较激发光短，因此透射光中只包含信号光成分) 进入 m e t a 探测器。所有的探测器都与电脑相连，经电脑处理后即可获得样品的显微图 像。 第二章实验装置 图2 3 实验装置光路图a o m ：声光调制器，m d b s ：主二色分光镜，p m t ：光电倍增管 f i g 2 3s c h e m a t i cd i a g r a m so f t h ee x p e r i m e n t a ls e t u p a o m ：a c o u s t o - o p t i c a lm o d u l a t o r , m d b s ： m a i nd i c h m i cb e a ms p l i t t e r p m t ：p h o t o m u l t i p l i e rt u b e 2 钛宝石飞秒激光器( m i r ao p t i m a9 0 0 f ) 、 多光子显微成像系统的激发光源是锁模钛宝石飞秒激光器，它是美国相干公司 生产的m i r ao p t i m a9 0 0 f 型固态激光器，该激光器功能强大、高度灵活，已经成为 世界范围内超快激光器用户的首选。m 曲o p t i m a9 0 0 f 采用光泵浦，泵浦激光器是 一台功率为1 0 w 的固体y a g 激光器( v e r d id p s s ，c o h e r e n t ) ，波长是5 3 2n i n 。 m i r ao p t i m a9 0 0 f 的脉冲宽度为l l o 飞秒，频率是7 6i _ - i z ，输出功率是1 6w ( 8 0 0 n m 处) ，波长调谐范围是7 0 0n m 到9 8 0n m 。激光束的偏振方向是水平偏振。在本 次实验中，我们用到的激发光波长是8 1 0n n 。激光强度的衰减通过调节声光调制器 ( a o m ) 来完成，到达实验样品表面的功率小于1 0m w 。 3 l s m 51 0 激光共焦扫描显微镜 实验中所用到的激光扫描共焦显微成像系统是德国z e i s s 公司生产的l s m 5 1 0 福建师范大学理学硕士学位论文 a x i o v e r t2 0 0 倒置激光扫描共焦显微镜。激光衰减后经反射镜进入显微镜系统，经 一个高数值孔径的平场消色差油浸显微镜物镜( 6 3 ，n a = i 4 ) 聚焦到实验样品上。 实验样品中的内源性荧光物质受到激发，发射出双光子激发荧光信号和二次谐波信 号，这些信号又经过同一个物镜收集然后沿原光路返回，经二色分光镜到达探测器。 该显微镜的扫描系统由两部分组成，一是检流计驱动的x y 扫描振镜，步长是 1 tm ，负责完成x y 平面的样品扫描，另一个是步进马达( h r z2 0 0 ，z e i s s ) ，步 长是1 0n m ，负责完成样品在轴向( z 方向) 上移动来实现轴向扫描。把所有的x y 平 面的图像沿z 轴叠加，就可以获得实验样品的三维图像，实现光学层析。 4 探测成像系统 多光子显微成像系统中总共有四个探测器，分别为一个透射光探测器，一个 m e t a 探测器和两个荧光探测器。在本次实验中，我们主要利用m e t a 探测器。在 m e t a 探测器中，信号光首先经过一个高性能的反射光栅发生色散，然后进入3 2 通道的光电倍增管阵列。每个光电倍增管覆盖的波长范围是1 0 7n m ，3 2 个光电倍 增管覆盖了从3 7 7n m 到7 1 6n m 之间大约3 4 0n m 范围的光谱。信号光经光电倍增 管将光信号转变成电信号，在一系列发射波长谱带处得到x y 图像，所有图像的叠 加便构成了实验样本的多光子显微图像。 5 一种对细胞和细胞外间质成分进行同时无损探测的方法 目前，临床上对疾病的检测诊断是通过对细胞和细胞# b l 日- j 质主要成分胶原纤维 和弹力纤维的显微结构进行观察和检测来完成的。临床上的检测方法通常是传统的 组织病理学方法。该方法需要对病理切片进行固定、石蜡包埋、脱蜡、染色等一系 列处理，这些过程不但破坏了组织的一些有用的物质真实形态，而且处理时间往往 较长，每一步处理所花的时间都是以小时，甚至是以天计算。另外，样品处理不恰 当及染色时间没有把握好都有可能导致检查结果失去准确性。若想同时探测细胞、 胶原纤维和弹力纤维的显微结构，需要使用完全不同的染料对组织切片分别进行染 色后再观察。因此，克服组织病理学方法的种种缺陷、寻找一种高分辨率、无损实 时检测细胞、胶原纤维和弹力纤维显微结构的新型方法一直是大量科研工作者和临 第二章实验装置 床医生共同努力的目标。 我们发明了一种对细胞和细胞外间质成分进行同时无损探测的装置1 7 ，该装置 利用激光与物质相互作用发射的双光子激发荧光和二次谐波信号来实现对细胞和细 胞外间质成分显微结构进行同时无损探测的要求，能够在分子水平上对细胞、胶原 纤维和弹力纤维的显微结构进行高分辨率、高对比度、无损、快速和实时的检测。 该装置的构造示意图如图2 - 4 所示：激光器发出的光经过衰减后通过一个双色 分光镜入射到扫描器的扫描镜组上，通过扫描镜组的光束由物镜聚焦到检测样品上； 激光与检测样品相互作用产生的双光子激发荧光和二次谐波信号被相同的物镜收 集，再由前述扫描镜组及双色分光镜入射到一个半透半反镜上，将双光子激发荧光 和二次谐波信号组成的发射信号光分成两路，一路通过滤波片l 和光电倍增管1 将 二分之一渡片 图2 4 装置示意图 f i g 2 - 4s c h e m a t i cd i a g r a m so f t h ee x p e r i m e n t a ls e t u p 福建师范大学理学硕士学位论文 胶原纤维的二次谐波信号转换成电信号a ，另外一路通过滤波片2 和光电倍增管将 细胞和弹力纤维的双光子激发荧光信号转换成电信号b ，所述的电信号a 和电信号 b 分别接至计算机的输入端，最后由计算机同时显示细胞、弹力纤维和胶原纤维的 显微结构。本发明的显著优点在于：利用激光与细胞和细胞外间质成分的内源性分 子相互作用产生的双光予激发荧光和二次谐波信号对其显微结构成像，因此，不需 要染色等处理，直接可以实现对样品的高分辨率、高对比度、实时、无损检测。细 胞和弹力纤维显微结构的探测虽然都是通过双光子激发荧光信号，但是二者的结构 有明显的差别，例如，人体细胞的最小直径大约为4 m ，形状类似球形，而弹力 纤维的直径只有1 3n l n ，成波浪状，因此，二者的显微结构可以明显区分开。若选 择合适的激发波长，使胶原纤维以发射二次谐波信号为主，即可获得细胞、胶原纤 维和弹力纤维的高对比度显微结构图像。另外，扫描器的使用使装置具有快速检测 的功能。 在本发明的最佳实施例中，激光器的波长应该选用8 1 0 n m ，此时胶原纤维以发 射二次谐波信号为主，避免对细胞特别是对弹力纤维显微结构高对比度的探测。若 激光器的波长选用8 1 0 n m ，双色分光镜需要透过大于7 0 0 n m 的入射光，同时反射小 于7 0 0 n m 的发射光。滤波片1 的滤光范围在4 0 0 4 1 0 n m 之间，实现对胶原纤维二次 谐波信号的收集，而滤波片2 的滤光范围在4 4 0 6 5 0 n m 之间，实现对细胞和弹力纤 维双光子激发荧光信号的收集。 上述的激光器只要满足光与细胞、胶原纤维和弹力纤维相互作用产生双光子激 发荧光和二次谐波信号的条件，可以是不同类型的激光器，如飞秒激光器、皮秒激 光器等不同种类的激光器。 上述的激光器与双色分光镜间设有光强控制器和全反镜，上述的光强控制器由 二分之一波片和格兰棱镜组成。 在本次实验中，我们使用两个不同的通道：一个通道探测波长在4 0 0r i m - 4 1 0 n 1 范围内的荧光信号，此波段对应于实验样品的二次谐波信号。另一个通道探测波长 在4 4 0n m 6 5 0n l t l 范围内的荧光信号，此波段对应于实验样品的双光子激发荧光信 号。这两个通道的探测是相继完成的。然后，我们将从两个通道获取的图像进行叠 加，就n - - i 以得到实验样品的t p e f s h g 的复合图像。本实验中，每个像素的获取时 间是芝5 6 , u s ，获得一幅5 1 2 x 5 1 2 像素的图像所用的时间仅为几秒钟a 我们把 第二章实验装置 5 1 2 x5 1 2 像素的小图像并排放在一起( 4 x 4 矩阵) ，就可以获得样本的大面积图像 ( 5 8 5 x 5 8 5 p m ) 。所有的图像都有1 2 位像素深度。 第三节本章小结 本章首先介绍了多光子显微成像系统的总体布局，描述了实验光路图，接着又 详细叙述了激光器、扫描显微镜和探测器的主要性能指标。最后介绍了一种对细胞 和细胞外问质进行实时无损诊断的方法。 福建师范大学理学硕士学位论文 2 2 第三章利用多光子显微成像技术对人体正常皮肤和硬皮病皮肤进行成像 第三章利用多光子显微成像技术对人体正常皮肤和 硬皮病皮肤进行成像 第一节前言 本章将介绍利用多光子显微成像技术分别对人体正常皮肤和硬皮病病变皮肤进 行成像。实验中我们获得了正常皮肤和病变皮肤的大面积的t p e f s h g 图像。首先 我们从形态学上对人体正常皮肤和硬皮病病变皮肤进行对比，结果表明，真皮乳突， 胶原纤维、弹力纤维、毛细血管等存在显著的差异。针对这些差异，我们设置了相 应的参数分别进行定量分析，比如用表皮厚度来表征真皮乳突的变化，用胶原束方 向比来表征胶原纤维束的平行度，用胶原原纤维间距来说明胶原的过度增生，用二 次谐波信号与双光子激发荧光信号强度之比来表征真皮中胶原的相对含量( 沉积程 度) 。经过医学统计分析，所有参数的差异性都很显著( p o 0 5 ) ，实验结果证明了 这些参数可以更加客观的评价人体正常皮肤和硬皮病病变皮肤的差异。因此，随着 光学技术的发展，我们有充分的理由相信多光子显微成像技术必将会成为临床无损 诊断硬皮病的重要手段，从而使得硬皮病的早期诊断和治愈成为可能。 第二节样品准备 本实验中共用到3 个硬皮病皮肤样品和2 个正常皮肤样品，这些实验样品都是 由福建医科大学附属协和医院提供的。3 例硬皮病患者都经过临床验证患有局限性 硬皮病( 根据美国风湿病协会硬皮病诊断和治疗标准【1 】) ，年龄分别是3 5 ，3 7 ，6 8 ， 均为女性。2 例正常皮肤样本取自2 个患有其它疾病的女性患者( 均未出现硬皮病 临床表现) 。在实验前，所有样品都保存在液氮罐( 1 9 6 ) 中。实验时，对所有样 品都进行冰冻切片处理，切片厚度为1 2 0 , um ，每个切片的方向都垂直于表皮( 即 纵切) ，以便使每个切片都包括表皮层、真皮层及皮下组织。由于在实验过程中样品 会受到激光辐射，为了避免切片上的样品组织缩水，我们在样品组织上滴几滴磷酸 盐缓冲液( p b s ) ，然后盖上盖玻片，封片后放到多光子激光扫描显微镜下观察。 1 一 福建师范大学理学硕士学位论文 第三节数据处理方法 1 图像分析 图像分析是由i m a g e j ( h t t p ：r s b i n t o n i h g o v i j ) 软件完成的。该软件是一款免费 软件，操作简单，功能强大。我们利用这个软件可以完成图像中两点之间某一段距 离的测量，例如测量表皮厚度。另外，该软件中的快速傅立叶变换( f a s tf o u r i e r t r a n s l a t i o n , f f t ) 功能可以实现图像从时域空间变换到频域空间，从而可以更准确 的提取出时域图像中很难获得的信息，使得数据处理更为方便 2 - 4 。例如，在本实验 中，我们利用该方法计算了胶原纤维束的方向。在时域空间图像中，我们只能从主 观上觉察到胶原束平行的排列，很难对它们平行的程度作出定量的评价。在进行f f t 处理之后，时域图像变成了频域图像。在频域图中，每一个像素代表一定的频率。 从这些频域图中，我们可以轻松地获得更加客观的数据来说明胶原束的平行程度。 在频域图中，所有像素点会填充在近似圆形或者椭圆形的区域内。若是圆形，则说 明时域图中胶原纤维束随机排列，不具有特定的方向，而椭圆则说明时域图中胶原 平行排列，且排列方向与椭圆短轴共线。为了更加准确的描述这种差别，我们设置 了一个参数，即胶原束方向比( t h eo r i e n t a t i o nr a t i oi n d e xo fc o l l a g e nb u n d l e s ， o r i c b ) ，其定义式为 0 | 砌= 1 一矿h( 3 1 ) 此处形代表频域图中椭圆或者圆的宽度( 短轴长度) ，而日代表频域图中椭圆或者 圆的高度( 长轴长度) 。根据定义，o r i c b 的值介于o 和1 之间。当胶原束排列呈 现出完全各向同性，即完全随机排列时，矿= h ，此时o r i c b 等于o ；当胶原束完 全平行排列时，形“h ，此时o r i c b 等于1 ：所以，平行排列的胶原束的值会大 于随机排列的胶原束的数值。而且，胶原排列的越平行，该数值越大。 另外，我们还利用l s m 5 1 0 本身配置的图像处理软件对图像做了进一步的分析。 例如，我们测定了表皮厚度，胶原原纤维的间距，二次谐波信号与双光子激发荧光 信号强度之比。 2 统计分析 本实验中所有数据都是以平均值标准差的形式表示的。所有正常皮肤与病变 皮肤的形态学测量数据都通过双尾学生氏r 检验来评价其统计学意义，当p 值小于 0 0 5 时，我们认为该组数据差异性显著，具有统计学意义。 第三章利用多光子显微成像技术对人体正常皮肤和硬皮病皮肤进行成像 第四节结果与讨论 l 。人体正常皮肤与硬皮病病变皮肤的t p e f s h g 图像描述 为了描述人体正常皮肤与硬皮病病变皮肤的显微结构的区别，我们利用多光子 激光扫描显微镜获取了正常皮肤与硬皮病皮肤的大面积t p e f s h g 图像，如图3 1 所示。 图l a l a 3 表示人体正常皮肤的显微图像。从图中我们可以清晰地辨别出表皮中 发荧光的角蛋白、细胞质成分以及不发荧光的细胞核。其中角蛋白和细胞质的荧光 信号都是t p e f 信号( 图中用红色标记) ，在图l a 3 中更为明显。表皮细胞和他们的细 胞核形状规则，大小正常。在表皮真皮连接处，向上的真皮乳突与向下的钉突结构 非常明显，犬牙交错排列，整个界面呈波浪状。这种结构可以使表皮真皮连接更加 牢固且富有弹性。另外，在真皮乳突中，我们可以看到与周围荧光较强的的区域有 明显区别的圆形或者椭圆形的无荧光区域，这些区域是毛细血管网( 图1 a l 中箭号 所示) 。正如我们所知，真皮是一层主要由胶原纤维和弹力纤维构成的结缔组织。在 我们的实验图像中，真皮中胶原的s h g 信号( 图中用绿色标记) 和弹力纤维的t p e f 信号非常明显。胶原纤维随机取向，且排列宽松，这一点在单独的s h g 图像中更为 明显，如图l a 2 所示。弹力纤维呈绳索状，随机排列，它们盘绕起来就像一根根弹 簧给皮肤增加弹性。值得注意的是，在深真皮中，我们可以看到一个管状结构( 图 1 a l 中箭头所示) ，这个结构就是皮肤中的毛细血管【5 1 。 与正常皮肤相比，硬皮病病变皮肤的形态变化非常明显( 图l b l b 3 所示) 。首先， 表皮真皮连接处的界面起伏不明显，有变平的趋势，这就表明真皮乳突和钉突结构 减少或者几乎不存在。这种结构的缺失会给皮肤的柔韧性带来一定的影响。而且， 基底细胞与细胞核的形状和尺寸出现异常。第二，硬皮病病变皮肽的主要病征一胶 原纤维的大量沉积可以在图l b 2 中清楚地观察到。在浅真皮中，我们可以看到胶原 不再呈纤维状，而是大部分都破碎，无特定形状，且破碎的胶原大量堆积。在深真 皮中，胶原纤维变粗，呈粗束状，胶原束间距变小。并且，大部分胶原束平行于表 皮排列，这是诊断硬皮病的一个标准。在真皮乳突中，我们可以看到几乎全部乳突 、 a1 o ：娑夏手。气- 黧 第三章利用多光子显微成像技术对人体正常皮肤和硬皮病皮肤进行成像 都被胶原填充( 图lb l 中箭头所示) ，这说明毛细血管减少甚至消失。毛细血管可以 为活细胞提供生命所必需的营养物质和氧气，它的减少或消失可能阻碍营养物质和 氧气的输送，因此这可能会引起皮肤的萎缩。第三，弹力纤维的变化也很明显。在 浅真皮，弹力纤维分布不规则，且形状断裂。在深真皮，尽管弹力纤维仍是纤维状 结构，但是它们不再盘绕而是平行于胶原排列( 见图l b 3 ) ，这就使得硬皮病的皮肤 坚硬而没有弹性。 2 表皮厚度 为了定量描述表皮真皮连接处的形态变化，我们对表皮厚度进行了测量，如图 3 2 所示。测量表皮厚度可以由多光子显微成像系统附带的软件来完成。我们定义 表皮厚度是指从皮肤表面到基底膜的距离，其最大值对应于皮肤表面到钉突的最底 端，最小值对应于皮肤表面到乳突的最上端。每个样品我们分别测量5 次，然后取 平均值。实验结果表明，在人体正常皮肤中，表皮厚度是9 6 4 3 3 5 0 2 m ，而在硬 皮病病变皮肤中，表皮厚度是8 6 0 2 1 4 9 3 m 。此处，正常皮肤的结果中标准差较 大是由表皮真皮连接处的界面具有波浪状起伏的结构引起的。从上面的测量结果我 们可以看出，正常皮肤的表皮厚度明显大于病变皮肤的表皮厚度。统计结果显示p 小于0 0 5 。 另外，为了进一步比较表皮厚度的变化，我们还测量了所有样本的最小表皮厚 度和最大表皮厚度。在正常皮肤中，表皮厚度的最大值和最小值分别是 1 4 2 7 8 5 9 5 t m 和4 4 9 0 3 1 8 m ，而在硬皮病病变皮肤中，表皮厚度的最大值和 最小值分别是1 1 0 8 2 6 9 8 m 和6 1 2 7 4 6 5 m 。这两组数据表明，与正常皮肤 相比，硬皮病皮肤的最小表皮厚度显著增大，而最大表皮厚度显著减小。以上所有 数据都表明，在硬皮病病变皮肤中，真皮乳突变平或者消失，使得表皮真皮连接处 福建师范大学理学硕+ 学位论文 图3 2 表皮厚度测量示意图 f i g 3 - 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f m e a s u r i n gt h ee p i d e r m a lt h i c k n e s s s c a l eb a r = 1 0 0 c tm 不再是波浪起伏状，而是变平整。因此最小表皮厚度会增大而最大表皮厚度会减小。 这个结果与k s a u e r m a n n 等人的实验结果相一致【6 1 。 3 胶原纤维束方向比 胶原的形态结构对皮肤的强度和功能至关重要。为了定量描述病理特征中胶原 柬的平行度，我们用i m a g e j 软件对人体正常皮肤和硬皮病病变皮肤的胶原的s h g 图像进行f f t 处理。如图3 3 所示，正常皮肤和病变皮肤的频域图差别非常明显。 第三章利用多光子显微成像技术对人体正常皮肤和硬皮病皮肤进行成像 图3 - 3 人体正常皮肤( a ) 和硬皮病病变皮肤( b ) 的s h g 图像的功率图 f i g 3 3 ( a ) t h