（微生物与生化药学专业论文）洛伐他汀发酵产物中杂质成分的分离与鉴定.pdf

摘要i a b s t r a c t 彳i i 第1 章文献综述1 1 1 他汀类药物简介1 1 1 1 他汀类药物的发现1 1 1 2 他汀类药物的药理及应用1 1 2 洛伐他汀简介3 1 2 1 洛伐他汀的发现。3 1 2 2 洛伐他汀的结构：3 1 2 3 洛伐他汀的理化性质4 1 3 洛伐他汀药理研究进展4 1 3 1 调脂作用4 1 3 2 非调脂作用5 1 4 洛伐他汀生产现状。8 1 4 1 洛伐他汀的发酵生产8 1 4 2 洛伐他汀的提取纯化工艺9 1 5 洛伐他汀结构类似物研究进展1 0 1 5 1 洛伐他汀的生物合成1o 1 5 2 洛伐他汀结构类似物。1 1 第2 章洛伐他汀发酵产物中杂质成分的研究1 3 2 1 实验部分。13 2 1 1 仪器与试剂1 3 2 1 2 实验材料1 4 2 1 3 化合物分离纯化。：1 4 2 1 4 化合物纯度鉴定1 5 2 2 实验结果，17 讨论：! z i 参考文献2 5 附勇乏3 0 致谢一4 1 发表论文及参加课题一览表4 2 西南大学硕士学位论文摘要 洛伐他汀发酵产物中杂质成分的分离与鉴定 微生物与生化药学专业硕士研究生朱虎成 指导教师邓君副教授 摘要 本文在综述他汀类药物( 一类羟甲戊二酰辅酶a 还原酶抑制剂) 的药理作用 和临床应用，以及其中一个重要成员洛伐他汀的药理研究进展、生产现状等的基 础上，认为洛伐他汀的市场需求量还很大，甚至前景将更好。 但技术发展使社会对医药产品质量要求越来越高，美国药典要求洛伐他汀产 品中杂质总含量不超过1 o ，单杂质含量不超过o 2 ，除非能有充分的药理数据 证明杂质成分的药理作用与主成分一致，而且不具有其他的毒理作用。我国是洛 伐他汀原料药的主要生产国，为了适应各国药典对洛伐他汀药品的新要求，有必 要对洛伐他汀产品中的杂质进行深入研究。首先得到单体化合物，鉴定它们的结 构，明确它们的性质，然后阐明这些杂质成分是在生产的哪一环节产生的，如何 减少它们的产生，在纯化过程中如何除去它们；同时累积足够的杂质单体化合物， 进行药理和毒理研究。 本文的主要研究内容就是对洛伐他汀发酵产物的杂质成分进行了分离纯化， 并鉴定它们的结构。本文以洛伐他汀提取纯化最后步骤的结晶母液为原料，反复 应用硅胶柱色谱、硅胶制备t l c 、反相硅胶柱色谱、半制备h p l c 等方法，从中 分离得到6 个杂质单体化合物；综合运用波谱学方法，如f t - i r 、1 h - n m r 、1 3 c n m r 、 1 h 1 hc o s y 、h s q c 、h m b c 和m s 等，鉴定了它们的结构。这些化合物分别是： 1 ，脱水m o n a c o l i nl ( a n h y d r o m o n a c o l i nl ) ；2 ，脱水二氢洛伐他汀 ( a n h y d r o d i h y d r o m o n a c o l i nk ) ：3 ，m o n a c o l i nl 酸( a c i df o r mo fm o n a c o l i nl ) ；4 ， m o n a c o l i nl 酸甲酯( m e t h y le s t e ro f h y d r o x ya c i df o r mo f m o n a c o l i nl ) ；5 ，二氢洛 伐他汀( d i h y d r o m o n a c o l i nk ) ；6 ，二氢洛伐他汀酸( a c i df o r mo f d i h y d r o m o n a c o l i n k ) 。 关键词：洛伐他汀；杂质成分；分离纯化；结构鉴定 i 两南大学硕十学位论文 a b s t r a c t t h e p u r i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fi m p u r i t i e si nl o v a s t a t i n p o s t g r a d u a t ez h uh u c h e n g t u t o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rd e n gj u n a b s t r a c t t h i sa r t i c l er e v i e w e dt h ep h a r m a c o l o g i c a le f f e c t sa n dc l i n i c a la p p l i c a t i o n so f s t a t i n s ( ak i n d o fm e d i c i n e si n h i b i t i n gh y d r o x y m e t h y lc o e n z y m ear e d u c t a s e ) ，鹊w e l l 嬲 t h eu p d a t ep r o g r e s si nt h es t u d i e so np h a r m a c o l o g ya n dp r o d u c t i o no fl o v a s t a t i n o n e i m p o r t a n tm e m b e ro fs t a f i n s ，a n dm a d eac o n c l u s i o nt h a tt h ep r o s p e c to fl o v a s t a t i nw i l l s t i l lb eg o o do re v e nb e t t e r t h ed e v e l o p m e n to ft e c h n o l o g yp u tah i g h e rs t a n d a r do nt h ep h a r m a c e u t i c a l p r o d u c t s u s pr e q u i r e st h a tt h et o t a li m p u r i t i e si nl o v a s t a t i ns h o u l db el e s st h a n1 o a n das i n g l ei m p u r i t ys h o u l db el e s st h a n0 2 ，u n l e s ss u f f i c i e n td a t aa r ep r o v i d e dt o p r o v et h a t t h ei m p u r i t yh a st h es a m ep h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t i e s 鹊t h ep r i n c i p a l c o m p o n e n t ，a n dt h a tt h ei m p u r i t yh a sn oo t h e rt o x i c o l o g i c a le f f e c t s c h i n ai st h em a j o r s u p p l i e ro fr a wm a t e r i a l so fl o v a s t a t i nt ot h ew h o l ew o r l d i no r d e rt om e e tt h en e w n a t i o n a lp h a r m a c o p o e i ar e q u i r e m e n t so fl o v a s t a t i n , i ti sn e c e s s a r yt oc a r r yo u tb a s i c s t u d yo ni m p u r i t i e si nl o v a s t a t i n f i r s t c o m p o u n d ss h o u l db eo b t a i n e dt oi d e n t i f yt l l e i r s t r u c t u r e sa n ds t u d yt h e i rp r o p e r t i e s t h e nt h o s es h o u l dm a k ec l e a ri nw h i c hs t e p st h e s e i m p u r i t i e sa r eg e n e r a t e d ，h o wt or e d u c et h ep r o d u c t i o no ft h ei m p u r i t i e s ，a n dh o w t o r e m o v et h e m m e a n w h i l e ，e n o u g ha m o u n to fm o n o m e r i m p u r i t i e s s h o u l db e a c c u m u l a t e dt oc o n d u c tv a r i o u sp h a r m a c o l o g i c a la n dt o x i c o l o g i c a ls t u d i e s t h i sp a p e ri sa i m e da tp u r i f y i n gt h ei m p u r i t i e so fl o v a s t a t i na n di d e n t i f y i n gm e i r s t r u c t u r e s i nt h i ss t u d y , t h ec r y s t a ll i q u o ro fl o v a s t a t i nf r o mt h ef i n a ls t e po fe x t r a c t i o n a n dp u r i f i c a t i o nw a ss e p a r a t e db yr e p e a t e d l ys i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , s i l i c a g e lp r e p a r a t i v et l c ，r p - s i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , s e m i p r e p a r a t i v eh p l c a n do t h e rm e t h o d sa n d6p u r ec b m p o u n d sw e r eo b t a i n e d t h es t r u c t u r e so ft h e6 c o m p o u n d sw e r ee l u c i d a t e d o nt h eb a s i so fa n a l y i n gt h e s p e c t r a l d a t ao ff t - i r ， 1 h n m i l1 3 c - n m r ，1 h i hc o s y , h s q c ，h m b ca n dm sa n dt h e yw e r ei d e n t i f i e da s ： 1 ，a n h y d r o m o n a c o l i nl ；2 ，a n h y d r o d i h y d r o m o n a c o l i nk ；3 ，a c i df o r mo f m o n a c o l i nl ；4 ， m e t h y le s t e ro fh y d r o x ya c i df o r mo fm o n a c o l i nl ；5 ，d i h y d r o m o n a c o l i nk ；6 ，a c i df o r m o fd i h y d r o m o n a c o l i nk k e yw o r d s ：l o v a s t a t i n ；i m p u r i t i e s ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；s t r u c t u r ei d e n t i f i c a t i o n i l 西南大学硕仁学位论文第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 他汀类药物简介 他汀类药物是羟甲戊二酰辅酶a ( h m g c o a ) 还原酶抑制剂，其代表药物有 洛伐他汀( 1 0 v a s t a t i n ) 、辛伐他汀( s i m v a s t a t i n ) 、氟伐他汀( f l u v a s t a t i n ) 等。他汀 类药物具有良好的降血脂及心血管保护作用，自1 9 8 7 年洛伐他汀应用于临床始， 他汀类药物迅速成为临床上的首选降血脂药，至今仍是使用最广泛的治疗高血脂 和预防动脉硬化的药物。 1 1 1 他汀类药物的发现 1 9 7 6 年，日本的h k i r ae n d 0 掣1 1 从桔青霉( p e n i c i l l i u mc i t r i n u m ) 培养物中分 离得到一新化合物m l 2 3 6 b ( 美伐他汀) ，并且发现该化合物能够抑制h m g c o a 还原酶活性，阻断胆固醇( c h o l e s t e r o l ，c h ) 的生物合成。1 9 7 8 年，美国b e e c h e m 实验室在研究抗真菌代谢过程中，从短密青霉( p e n i c i l l i u mb r e v i c o m p a c t u m ) 中分 离得到该化合物，并命名为c o m p a c t i n 2 。1 9 7 9 年，e n d o 3 1 又从红曲霉( m o n a s c u s r u b e r ) 中分离得到一个结构类似物m o n a c o l i nk ，即洛伐他汀，它具有更高的 h m g c o a 还原酶抑制活性。1 9 8 0 年，a l b e r t s 掣4 】从土曲霉( a s p e r g i l l u st e r r e u s ) 发酵物中分离得到了洛伐他汀。 之后的几年里，很多结构类似的、具有相似活性的化合物陆续被发现，包括 m o n a c o l mm 、m o n a c o l i nx 、m o n a c o l i nl 、m o n a c o l i nj 等【5 7 1 。 通过对洛伐他汀等他汀类的结构修饰，得到了活性很高的半合成药物辛伐他 汀( s i m v a s t a t i n ) f 8 和普伐他汀q r a v 嬲t a t i n ) 9 】以及全合成的氟伐他汀( f l u v a s t a t i n ) 【l o 】、阿托伐他汀( a t o r v a s t a t i n ) 1 1 】、罗苏伐他汀( r o s u v a s t a t i n ) 1 1 2 】等。 1 1 2 他汀类药物的药理及应用 1 1 2 1 调血脂作用1 3 】 早在几十年前，人们就意识到总胆固醇( t c h ) 和胆固醇在血浆中的运载体一 一低密度脂蛋白( l d l ) 过高是引发冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的重要 因素。临床调查证实t c h 和l d l 的血浆水平与各种心脑血管疾病的发病率和死亡 r 。_ _ 。_ _ 。_ 。_ _ _ _ - 。_ _ _ _ _ 。 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 。_ _ 。_ 。_ 。_ _ _ - 。_ 。- 。_ _ 。 西南大学硕十学位论文第1 荦文献综述 率有密切关系。人体c h 来源于自身合成和食物吸收，而前者占到了7 0 8 0 。因 而，控制体内c h 的过多合成是心脑血管疾病治疗和预防的有效途径。 他汀类药物由于具有特殊的结构，与体内合成c h 的关键酶h m g c o a 还原酶 有很高的亲和力，对该酶产生竞争性抑制，阻断内源性c h 的合成。由于肝细胞合 成的c h 减少，阻碍极低密度脂蛋白( v l d l ) 的合成与释放；另一方面，通过自 身负反馈调节，代偿性地升高肝细胞膜上的l d l 受体数目和活性，致使血液中大 量l d l 被摄取利用，最终降低血浆中t c h 、l d l 和v l d l 水平，升高抗动脉粥样 硬化的高密度脂蛋白( h d l ) 水平。通过这一系列的作用，他汀类药物可起到调 节血脂浓度，保护心脑血管的作用。 1 1 2 2 抗肿瘤作用 近年的研究表明，他汀类药物对肿瘤有明显的抑制作用。其作用机制主要包 括以下几点：。诱导肿瘤细胞凋亡。未活化的r a s 介导的信号转导对细胞凋亡至 关重要，他汀类药物能抑制r a s 活化过程中的重要底物焦磷酸法尼酯的合成， 从而抑制r a s 的活化。降低肿瘤细胞侵袭力，诱导肿瘤细胞分化。抑制肿 瘤血管生成。放射增敏作用【1 4 , 1 s 。 1 1 2 3 肾保护作用 他汀类药物对肾脏的保护作用主要有两条途径：与降脂作用相关的肾保 护：他汀类药物通过降低血清中的l d l 水平可以减少。肾脏系膜区和小管间质中脂 蛋白的沉积，同时降低肾小球毛细血管袢内压，改善肾脏局部异常的血液流变学 指标。非依赖降脂的肾保护作用：他汀类药物不仅可以降低体循环的c h 水平， 而且还可以抑制多种肾脏固有细胞及炎性细胞合成和分泌炎症因子，从而起到肾 保护作用16 1 。 1 1 2 4 治疗骨质疏松症 近年的研究表明，他汀类药物通过激活成骨细胞，促进骨合成代谢，抑制骨 吸收，提高骨密度，降低骨质疏松发病率。该作用是他汀类药物与降脂作用无关 的新药理作用。美国一科研小组通过动物实验发现，切除卵巢的老年雌性大鼠给 予口服剂量的他汀类药物，用药3 5 d 后，骨小梁骨密度较用药前增加3 9 9 4 ， 2 两南大学硕士学位论文 第1 章文献综述 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇舅舅皇曼量量毫皇舅曼鼍曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量篁鼍寡皇鼍i i|i 毫曼曼量曼曼曼曼曼皇曼曼皇曼曼曼曼量皇曼曼 较安慰剂组增加近2 倍17 1 。 1 1 2 5 其他作用 随着研究的深入，已经发现的他汀类药物作用范围越来越广，如神经保护作 用、抗感染和抗类风湿作用等，并且发现其在高血压、阿尔茨海默病等重大疾病 中有一定的治疗作用【1 8 1 。 他汀类药物从开发至今已有近3 0 年，共有8 种他汀类药物被开发应用。2 0 0 8 年国际市场上他汀类药物总销售额合计约3 9 0 亿美元，占全球医药市场总销售额 的5 5 ，且自上世纪9 0 年代以来，他汀类药物的年销售额都以2 0 的年平均增长 率高速增长。而且随着他汀类药物的新药理作用不断被发现，他汀类药物的应用 前景将更广阔，医药界对该类药物的研究方兴未艾。 1 2 洛伐他汀简介 1 2 1 洛伐他汀的发现 1 9 7 9 年，e n d o 3 】从红曲霉( m o n a s c u sr u b e r ) 中分离得到一个活性很强的 h m g c o a 还原酶抑制剂m o n a c o l i nk ，即后来的洛伐他汀( 1 0 v a s t a t i n ) 。1 9 8 0 年， a l b e r t s 掣4 1 从土曲霉( a s p e r g i l l u st e r r e u s ) 发酵物中也分离得到了洛伐他汀。1 9 8 7 年，洛伐他汀作为第一个h m g c o a 还原酶抑制剂类降脂药，由f d a 批准上市。 由于其疗效确切，作用机制明确，安全范围广，耐受性良好，上市后很快就成为 首选降脂药，销量逐年飙升，被誉为治疗心血管系统疾病的里程碑。 我国于1 9 9 0 年开始进口洛伐他汀，1 9 9 2 年由四川抗生素研究所开始对其进行 研究，1 9 9 6 年开始自行生产。之后不久，全国许多制药厂家获得相关技术并开始 生产，不但满足国内市场需求，且逐渐面向国外发展客户，现在我国已是全球洛 伐他汀原料药的主要供应国。 1 2 2 洛伐他汀的结构 洛伐他汀，英文名为l o v a s t a t i n ，m o n a c o l i nk 等，化学式为c 2 4 h 3 6 0 5 ，分子量 为4 0 4 5 ，化学名为：【1 s 1q ( r 宰) ，3q ，71 3 ，81 3 ( 2 s ，4 s 木) ，8q1 3 】- 1 ，2 ，3 ，7 ，8 ，8q - 六氢3 ，7 - 二甲基- 8 - 2 一( 四氢- 4 羟基一6 氧代二氢吡喃一2 ) - 乙基】- 1 一萘基2 - 甲基丁酸 酯，( 【1 s 一 1q ( r 宰) ，3q ，71 3 ，81 3 ( 2 s 宰，4 s 牛) ，8q1 3 】一1 ，2 ，3 ，7 ，8 ，8q - h e x a h y d r o 一3 ， 气 两南大学硕十学位论文第1 章文献综述 7 - d i m e t h y l 8 - 2 - ( t e t r a h y d r a - 4 - h y d r o x y 一6 - o x o 一2 h p y r a n 2y 1 ) e t h y l - 1 一n a p h t h y l 一2 - m e t h 、 y l b u t a n o n a t e ) 。洛伐他汀具有两种结构形式：内酯形式和酸式，如图1 1 所示： l a c t o n ef o r ma c i df o r m ，o h 图1 1 洛伐他汀的两种结构形式 f i g 1 1t h et w os t r u c t u r ef o r m so fl o v a s t a t i n 1 2 3 洛伐他汀的理化性质 洛伐他汀在常温下为不透明的针状结晶，难溶于水，可溶于甲醇、乙醇、丙 酮、氯仿、和乙酸乙酯等有机溶剂，不溶于石油醚、汽油、正己烷及中性、酸性 水中，溶液无色。在1 甲醇溶液中的旋光度为【q 】2 5 d = + 3 2 3 。，在2 2 9 、2 3 7 、2 4 6 n m 处有紫外吸收峰，典型的红外吸收峰位于3 5 5 0 、2 9 7 0 、1 6 9 0c m 。1 处，熔点为1 7 4 5 p 【1 9 】 、，o 洛伐他汀酯式结构与酸式结构在一定条件下可以相互转化，如图1 2 所示： o o h 。 = ；= = = = = = = = = = = = h + 图1 2 洛伐他汀的两种结构形式的转变 f i g 1 2t h ec o n v e r s i o no f t h et w os t r u c t u r a lf o r m so fl o v a s t a t i n 1 3 洛伐他汀药理研究进展 1 3 1 调脂作用 4 西南大学硕十学位论文第1 章文献综述 c h 存在于人体各种组织器官中，对人体有很重要的作用，是维持细胞膜稳定 性不可或缺的成分。但是，血浆中c h 过高则会导致高c h 血症，引起动脉粥样硬 化，导致严重心脑血管疾病。随着生活水平的提高，人们从食物中摄入c h 增加， 心脑血管疾病在世界范围内的发病率和死亡率越来越高，成为威胁人类生命的最 主要疾病之一。 人体c h 来源于两条途径：一是食物中摄取，二是自身合成。所以，减少食物 中c h 摄入量和减少人体自身c h 合成是防治高血脂、降低心脑血管疾病发病率和 治疗心脑血管疾病的有效途径。 c h 的合成主要在肝脏中进行。肝细胞以脂肪酸代谢产生的乙酰辅酶a 为原料， 经甲羟戊酸等二十多个步骤生成c h ( 2 们。其大致过程如图1 3 所示。 其中h m g c o a 还原酶是c h 合成的限速酶，洛伐他汀的化学结构与h m g c o a 相似，且对h m g c o a 还原酶有极高亲和力，故对h m g c o a 还原酶产生很强的 竞争性抑制作用，阻断内源性c h 的合成。由于肝细胞合成c h 减少，阻碍了v l d l 的合成与释放；另一方面，细胞内c h 含量降低，反馈性地升高肝细胞膜上l d l 受体的数目和活性，加快了血液中l d l 的摄取利用，降低了血浆中t c h 、l d l 、 v l d l 水平。与此同时，血液中h d l 含量增加，进一步加速了c h 的清除。 临床上使用的降c h 的药物还有胆汁酸鳌合剂、烟酸类、苯氧芳酸衍生物和不 饱和脂肪酸类掣”】，这些药物降低血液中过度增高的c h 浓度，均是通过c h 类的 降解和排出，因此不可避免地代偿性增加c h 的生物合成，且副作用明显。而洛伐 他汀从源头上减少c h 的来源，相比之下，其药物不良反应小、用量少、疗效显著。 1 3 2 非调脂作用 洛伐他汀作为调脂药物上市后，对它的研究并未停止，近年来的研究发现， 洛伐他汀除了具有良好的降脂作用外，还具有许多其他药理作用。 1 3 2 1 抗肿瘤作用 a j i t h 掣2 1 1 发现洛伐他汀能够抑制淋巴瘤细胞，并推断该活性与洛伐他汀抑制 f e 2 + 诱导的脂质过氧化反应有关，认为洛伐他汀有可能成为抗癌药物。f e l e s z k o 等 【2 2 1 发现洛伐他汀与顺铂具有协同抗癌效应，能显著增强顺铂抗小鼠黑色素瘤活性。 5 ，- 西南大学硕十学位论文第1 章文献综述 曼曼曼詈曼曼皇曼! 一一i 皇曼皇曼曼曼曼曼量量曼曼曼曼! 曼! 曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼 f u k a m a c h i 等例则发现肿瘤细胞特殊的低p h 条件增强了洛伐他汀的细胞毒性，这 可能是其抗癌作用的机制所在。其他很多研究表明洛伐他汀对前列腺癌p c 3 细胞、 恶性黑色素瘤b 1 6 细胞、高转移卵巢癌细胞h o 8 9 1 0 p m 细胞、乳腺癌细胞、甲状 腺癌细胞等多种癌细胞都有一定的抑制或诱导凋亡作用【2 4 - 2 6 1 。 2 c h 3 c o - - s c o a 硫解酶卜l 墩诅 c h a c o c h 2 c o - - s c o a h o o c c h 2 彳c h 2 c o s c 0 a 他甄酶。删hmgc c 撇n 矿 o a 还原酶：“。1 h o o c c h 2 c i c h 2 c h 2 0 h p p - o c h 2 c h 2 气c h 2 c o o h 胛。o c h 2 咖c h 笥h 2 c h 3 即戏h 2 c h 2 芎q h 3 c h 3 图1 3 胆固醇的合成过程 f i g 1 3t h es y n t h e t i cp a t h w a yo fc h o l e s t e r o li nh u m a nl i v e r 6 冲 砷 a a o z 咆 州 i 5 i k k _ 。1 。- - 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ _ _ 。_ _ _ 。_ 。_ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 。_ 。1 。1 。1 1 。1 。1 。 两南大学硕士学位论文第1 章文献综述 1 3 2 2 抗氧化、改善血管内皮细胞功能作用 k u m a r 掣2 7 1 用大鼠研究了洛伐他汀的抗氧化作用，发现洛伐他汀增加了各组 织器官中过氧化氢酶、谷胱甘肽的含量。z h o uq i 等【2 8 3 研究了洛伐他汀对体外人内 皮细胞的作用，发现洛伐他汀能够升高细胞内谷胱甘肽活性，加速过氧化物的清 除，有很强的抗氧化作用。s c h m i d t 等【2 9 1 的研究表明洛伐他汀可加强干扰素活化的 人血管内皮细胞中e s e l e c t i n 、i c a m 1 和v c a m 1 的表达，促进内皮细胞分化成 熟，改善血管功能。李肖霞、马凤霞的研究也证实了洛伐他汀具有抗氧化作用和 对血管内皮细胞功能的改善作用【3 0 3 1 1 。 1 3 2 3 抗炎抗增殖 洛伐他汀具有抗炎和抗增殖的作用，能抑制肾系膜细胞的增殖和细胞外基质 的分泌，从而达到减轻肾小球硬化的目的【3 2 1 。洛伐他汀还能抑制血管平滑肌细胞 的增殖和迁移，促进血管平滑肌细胞凋亡，阻止动脉内膜的增厚，防治动脉粥样 硬化的发生。 1 3 2 4 肾保护作用 洛伐他汀在大鼠肾脏缺血再灌注试验【3 3 】中，可一定程度降低m c p 1 的表达， 减轻肾功能损害，提示洛伐他汀具有不依赖降脂的肾脏保护作用。对他汀类药物 治疗原发性肾病综合征患者微炎症状态疗效的临床研究表明3 4 1 ，洛伐他汀能显著 改善原发性肾病综合征患者的微炎症状态。 1 3 2 5 抗慢性心力衰竭 近期一些研究显示【3 5 1 ，他汀类药物具有一定的抗心力衰竭作用，这些抗心力 衰竭作用可能是通过其调脂作用间接产生的。a l l k e r 掣3 6 1 对五千余位慢性心力衰竭 患者进行了临床研究，发现他汀类药物能显著降低患者的死亡率，但其抗心力衰 竭作用的发挥是独立于降脂作用的，这可能是他汀类药物又一新的药理作用。 1 3 2 6 神经保护作用 肖雁等在体外研究洛伐他汀对p c i 2 神经细胞中q7 尼古丁受体的上调作 用时发现，洛伐他汀具有神经保护作用。张静芳【3 8 1 提出他汀类药物能够诱导内源 性血管生成因子的表达，促进血管生成，有助于缺血性卒中后神经再生和突触形 7 西南大学硕十学位论文第1 章文献综述 成，促进神经功能恢复。 洛伐他汀作为他汀类药物的主要代表，又是合成辛伐他汀的原料，其药理活 、 性研究的不断深入，必将极大扩展其应用范围。一旦这些研究取得突破性进展， 洛伐他汀定会再创辉煌。 1 4 洛伐他汀生产现状 1 4 1 洛伐他汀的发酵生产 1 4 1 ：1 生产菌种 用于生产洛伐他汀的菌种主要有三类：土曲霉( a s p e r g i l l u st e r r e u s ) 、红曲霉 ( m o n o s c u s ) 和青霉( p e n i c i l l i u m ) ，其中工业生产上最常用的菌种是土曲霉。洛 伐他汀的原始生产菌株产量都很低，远远不能满足工业生产所需。菌种改良对提 高工业产量、降低生产成本尤为重要。经过不断的努力，现用于工业生产的菌株 都已具备较高的产量，菌株改良的工作也还在持续进行之中。常用的育种方法有 诱变育种、原生质体育种、体外重组d n a 技术等。 1 4 1 2 培养基 一 碳源和氮源是发酵过程中物质和能量来源，其选择是培养基优化的基础。洛 伐他汀发酵生产中，碳源和氮源的选择对发酵过程至关重要，它们不仅决定茵丝 的生长和洛伐他汀的产量，还严重影响发酵工艺的调控。一般来说，在氮源限制 的条件下，用缓慢利用的碳源发酵，能取得比较高的洛伐他汀产率和最终产量， 同时氮源的类型也影响洛伐他汀的产率。现在有采用乳糖、甘油、葡萄糖混合式 碳源和蛋白胨、豆饼粉、玉米浆混合式氮源的组合配方，取得了不错的效果。y k e m a 掣3 9 1 对c n 比例进行优化，发现c n 质量比在1 5 ：1 到6 0 ：1 之间时，比较适合洛 伐他汀发酵。而c a s a sl o p e z 等【删研究进一步表明，4 0 ：1 的c n 最为合适。其他很 多添加物在洛伐他汀的发酵过程中也有着重要作用，如在发酵过程中适时加入蛋 氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐等可以提高洛伐他汀的产量。 1 4 1 3 其他发酵条件 土曲霉的主要发酵参数条件如下【4 1 4 2 】：温度2 8 c ，p h 值5 8 6 3 ，溶氧饱和度 7 0 左右，发酵时间约为1 6 1 h 。 西南大学硕十学位论文第1 章文献综述 1 4 2 洛伐他汀的提取纯化工艺 洛伐他汀提取纯化工艺主要有三种，分别如下： 1 4 2 1 洛伐他汀的提取纯化工艺一 e n d o 掣删在发现洛伐他汀之后，很快摸索出一套简单易行的提取工艺，其流 程图如图1 4 所示。 发酵液上清液圣竺圣塑苎竺，乙酸乙酯萃取液兰竺油状物翌兰发酵液上清液乙酸乙酯萃取液油状物_ _ 至兰望茎查- 苯溶液 油状物骂要! 墨竺墨洛伐他汀油状物洛伐他汀 乙酸 溶液 图1 4 洛伐他汀的提取工艺一 f i g 1 4t h ep r o c e s sio fe x t r a c t i n gl o v a s t a t i n 该提取方法的优点在于步骤较少，操作较简便，但是由于多次采用有机溶剂， 特别是采用了毒性很强的苯，无论对操作工人还是环境都极为不利，而且不利于 药物质量控制。 1 4 2 2 洛伐他汀的提取纯化工艺二 m e r k l 4 4 1 作为第一个把洛伐他汀推向市场的公司，也报道了洛伐他汀的提取方 法和中试提取精制工艺流程图( 如图1 5 ) 。 发酵液壁苎圭兰鲨滤液一垄苎墼旦骂乙酸乙酯相苎鹭骂油状物 一一 压滤乙酸乙酯提取 三墨! 竺：圣竺圣塑! ：! ! ! 塑鲨，壁些堡垒活性组分茎仝三茎! 竺滤液 硅胶拌样分步洗脱 过滤 s e p h a d e xl h2 0 活性组分壁鉴壁鱼堂，活性组分骂二璺骂洛伐他汀 凝胶柱色谱 图1 5 洛伐他汀的提取工艺二 f i g 1 5t h ep r o c e s s 2o fe x t r a c t i n gl o v a s t a t i n 9 西南大学硕十学位论文第1 章文献综述 该工艺优点在于获得的产品纯度高，杂质含量低，但是由于多次使用硅胶、 凝胶柱色谱，操作步骤繁琐，技术要求高，生产效率低，造成生产成本过高，而 且使用了有毒的二氯甲烷等有机溶剂，不利于环境保护和生产者健康。 1 4 2 3 洛伐他汀的提取纯化工艺三【4 ，5 】 该工艺采用溶媒萃取法，由于采用乙酸丁酯、乙醇等低毒性溶剂，克服了工 艺一的主要缺点，相比工艺二，其步骤简单，成本大大降低。国内洛伐他汀生产 厂家提取工艺都与该法类似。但是该工艺仍存在不足之处，即回收率较低，约 6 0 7 0 ，造成了部分浪费。 为了寻求更好的提取纯化方法，研究人员还在不断的努力，新的方法也在不 断的提出，但是更好的能用于工业生产的工艺尚未见报道。 发酵液塑旦竺：! ，滤渣 竺三 一丁酯提取液n a 2 c 0 3 丁酯萃取液骂 压滤丁酯提取3 次 液洗两次 堕兰竺生洛伐他汀结晶粗粉圣壁重堕曼洛伐他汀 离心过滤 图1 6 洛伐他汀的提取工艺三 f i g 1 61 1 1 ep r o c e s s3o fe x t r a c t i n gl o v a s t a t i n 1 5 洛伐他汀结构类似物研究进展 1 5 1 洛伐他汀的生物合成 洛伐他汀发现后不久，人们便通过使用标记性前体测定了其分子中各c 、h 、 0 原子的来源，结果显示洛伐他汀是由一条1 8 c 聚酮链和一条4 c 聚酮链首尾连接 而成。除c 6 和c 2 ”上的两个甲基来源于s 腺苷l 甲硫氨酸外，其余碳原子都来源 于乙酸盐。同位素示踪表明，除与c 1 相连的氧原子来源于0 2 外，其他氧原子都 来源于乙酸盐。 洛伐他汀的主要生物合成步骤如图1 7 所示【4 6 , 4 7 】。 1 0 西南大学硕，j ：学位论文第1 章文献综述 o k r ，d h e r ，m e t c o a 婴e 秒佣 。v h 3 c ” h e x a k e t i d e 3 k r d h e r - - - - - - - - - h 3 c 、 d j e c y c h l s z a a l d t l 坚o n h e rf g n 3 c f o c t a k e t i d e h e p t a k e t i d e s e n z p k sr e l e a s e - _ - - - _ - 。 兰垒h 3 c 0 2 h 3 a h y d r o x y - 3 ，5 - d i h y d r o m o n a c o l i nl i o v a s l a t i n f 从l 吣一股l 吣一从l 。k s 一从l 吣八儿l d k s 一人八l d k s a 八l d k s 一八人l d k s 图1 7 洛伐他汀的主要生物合成步骤 f i g 1 一t h eb i o s y n t h e t i cp r o c e s so f l o v a s t a t i n 1 5 2 洛伐他汀结构类似物 洛伐他汀生物合成步骤繁多，在该过程中产生许多中间体和结构类似物，这 些化合物即是洛伐他汀提取纯化中杂质成分的主要来源。洛伐他汀的结构决定了 其化学性质对水、氧、高温、光照等较不稳定，在其提取纯化过程中常产生新的 杂质成分，影响洛伐他汀产品的质量。研究人员在研究洛伐他汀及其他降c h 药理 作用的过程中，阐明了部分洛伐他汀类似物结构，主要的化合物结构如图1 8 【4 8 - 5 6 1 。 s o = 一一n寸n【u一，1i)nnn gi)nt一一暑|1)oo一一ei)西n一一ui工i)i一 【zo卜业勺，n-凸o【z工o卜屿，z)口o ezn191 ( z z o卜也_nno n 1 o卜趣弓一一卜o一 一nn卜也弓zn卜o nn卜也口nno一一暑1一一乜一一暑1一vo，一一量ii)，一量|一一n一一 一u1z1)卜n一一ujz一一n1 一gzi)on寸gz一一口nn暑z1)口一“ 宵z o也，嚼znno宵|o卜也，弓znn昏oe，|：n冀ng|i)on“ u|王一一n寸 宵=nno口oo业勺口勺王一一小卜心nz”nooo小心pp口i|一一no卜 ni乜n屿口|i)一nn莆nn，n6弋勺口|一一nt”n|1”口业弓z一-o岔竹 sjo一一n吨n ll一1)n c n g|i)一t一一暑zi)o口1一ezi)套岭一一uiz一一ici 【zonn岔屿它屯|一一寸岔n ( z z o一no一也_它一一n一i(z|ono一一心，暑1)n= 量，i)寸nn”n，on，oo一屿pp弓，|一v”n士n岔也弓工一一nnn 宵=o2业芑口=一一一寸一暑i一一nn一一ui|1)一n一e，工