（神经病学专业论文）血管内皮细胞大自噬功能在淀粉样血管病变中的作用.pdf

上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得 的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 马蠊 嗍1 年p 月哆日 2 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 一 。本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交 通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 一 保密口，在_ 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 一。( 请在以上方框内打“4 ) 学位论文作者签名： 日期：l ，月 3 指导教师签名： 血管内皮细胞大自噬功能在淀粉样血管病变中的作用 摘要 阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 是一种老年人常见的神经系统变性 疾病，临床表现为进行性记忆力下降，认知功能障碍和视空间障碍的。1 3 淀粉样 蛋白( a 1 3 ) 蛋白被认为是a d 的主要致病因素。a d 蛋白聚集在血管周围形成的 淀粉样血管病变( c a a ) 和大自噬体结构是a d 的重要病理改变。但是，c a a 形成的具体机制，及其与大自噬途径的关系尚不清楚。本研究中，我们首先在不 同病变程度的a d 患者的脑组织中，选用大自噬途径的特异性标记蛋白a t g l 2 、 a t 9 5 和l c 3 ，用免疫组织化学和激光共聚焦显微镜的方法观察了a d 脑组织中 的大自噬的改变，及其与a d 的病理改变，老年斑( s p ) ，神经原纤维缠结( n f t ) 一 。和c a a 的关系。结果显示a d 患者的神经元内和血管内皮细胞上都有大自噬体 标记蛋白的明显表达，神经元内的大自噬体的表达主要位于营养不良性神经突 中，部分与磷酸化t a u 共定位，提示大自噬体在神经元内t a u 蛋白磷酸化过程中 和n f t 的形成中可能参与了重要作用。此外，部分大自噬体表达增强的血管位 于s p 之内或周围，提示血管大自噬途径可能参与了血管外的a p 蛋白沉积和c a a 的形成。 为了进一步明确血管内皮细胞大自噬功能在c a a 形成中的具体机制，我们 采用原代培养的脐静脉血管内皮细胞( h u v e c ) 作为细胞模型，用饥饿刺激后 观察h u v e c 细胞外的a b 蛋白的分泌情况。我们的研究证实了该细胞内有产生 a b 蛋白的必要的a p p 剪切的a 分泌酶、b 分泌酶和丫分泌酶。同时，我们也发 现饥饿能诱导h u v e c 细胞产生并分泌a p 4 2 蛋白，该过程是通过上调p 分泌酶 b a c e l ，丫分泌酶p e n 2 和a p h l 所介导的。此外，饥饿能激活h u v e c 中的大 自噬途径，通过下调b 分泌酶b a c e l ，丫分泌酶p e n 2 和a p h l ，抑制饥饿诱导 h u v e c 细胞产生和分泌a p 4 2 蛋白，从而起到一定的保护作用。 以上的研究结果显示大自噬途径参与了a d 的发病机制。血管内皮细胞能产 生和分泌a 9 4 2 蛋白，促进了c a a 的形成。大自噬途径能抑制饥饿条件下诱导的 4 、 a 蛋白的表达，起到一定的保护作用。 关键词阿尔茨海默病，淀粉样血管病变，大自噬，血管内皮细胞，b a c e l ， p e n 2 ，a p h 、 t h er o l eo fm a c r o a u t o p a h g yo fe n d o t h e l i u mo nt h e f o r m a t l o no fc e r e b r a la m y l o i da n g l o p a t h y a b s t r a c t a l z h e i m e r sd i s e a s ei san e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s em o s t l ya f f e c t i n go l dp e o p l e c h a r a c t e r i z e dw i t h p r o g r e s s i v em e m o r yd e c l i n e ，c o g n i t i v ei m p a i r m e n t a n d s p a t i o v i s u a ld y s f u n c t i o n a m y l o i db e t aw a sr e g a r d e da st h em a i ni n s u l tp r o t e i n si nt h e p a t h o g e n e s i so fa l z h e i m e r sd i s e a s e a m y l o i db e t aw a sa c c u m u l a t e do nt h ep e r i p h e r a l a r e ao fv e s s e l st of o r mt h ec e r e b r a la r n y l o i da n g i o p a t h yw h i c hw a sa l s oam a i n p a t h o l o g i c a l f e a t u r eo fa l z h e i m e r sd i s e a s e h o w e v e r , t h em e c h a n i s mo ft h e f o r m a t i o no fc e r e b r a l a m y l o i da n g i o p a t h y a n d i t s r e l a t i o n s h i p w i t ht h e m a c r o a u t o p h a g yr e m a i n e du n k n o w nt i l ln o w i nt h ，i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h e m a c r o a u t o p h a g i cf e a t u r e si nb r a i nt i s s u eo fa l z h e i m e r sp a t i e n t sw i t hd i f f e r e n td e g r e e o fs e v e r i t yb yt h em a r k e ro f a t g l 2 ，a t 9 5a n dl c 3 u s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n d c o n f o c a lt e c h n i q u e s ，w ef o u n dt h a ti n c r e a s e dm a c r o a u t o p h a g yw a se v i d e n ti nt h e 、b r a i no fa l z h e i m e r sd i s e a s ep h t i e n t sb o t hi nn e u r o n sa n de n d o t h e l i a lc e l lo fv e s s e l s f u r t h e ri n v e s t i g a t i o nr e v e a l e dt h a tm a c r o a u t o p h a g yw a sp a r t l yc o l o c a l i z e dw i t ha t 8 i n d y s t r o p h i c n e u r o n sw h i c hi n d i c a t e dt h a ti tw a s p e r h a p si n v o l v e d i n t h e p h o s p h o l i z a t i o n o ft a ui na l z h e i m e r sd i s e a s e p a t i e n t s w e a l s of o u n dt h a t m a c r o a u t o p h a g yi m p r e g n a t e dv e s s e l sw e r ea c t u a l l ys u r r o u n d i n go rp e n e t r a t i n gt h e s e n i l ep l a q u ew h i c ha g a i ns u g g e s t e dt h er o l eo fm a c r o a u t o p a h g yi nt h ea c c u m u l a t i o n o fa r n y l o i db e t ao u t s i d eo fv e s s e l sa n df o r m a t i o no fc e r e b r a la m y l o i da n g i o p a t h y i no r d e rt o i n v e s t i g a t et h e r o l eo fm a c r o a u t o p h a g yo fe n d o t h e l i u mi n t h e f o r m a t i o no fc e r e b r a la m y l o i da n g i o p a t h y , w ea d o p t e dt h ep r i m a r yu m b i f i a e e n d o t h e l i a lc e l l ( h u v e c ) a st h ec e l lm o d e la n du s e ds t a r v a t i o na ss t r a t e g yt oo b s e r v e t h ee x t r a c e l l u l a rl e v e lo fa m y l o i db e t a4 2 o u rs t u d yd e m o n s t r a t e dt h a th u v e c h a r b o r e dt h er e q u i r e ds e c r e t e s e sf o rt h ea p pc l e v e a g ep r o c e s s i n g w ef o u n dt h a t s t a r v a t i o nc o u l dt r i g g e rt h ea m y l o i db e t a4 2s e c r e t i o nf r o mh u v e c b yi n c r e a s i n gt h e 6 e x p r e s s i o no f1 3 - s e c r e t a s eb a c e 1a sw e l l 嬲7 - s e c r e t a s ep e n 2a n da p h b e s i d e s s t a r v a t i o ni n d u c e dm a c r o a u t o p h a g yt op m v e mt h e a m y l o i db e t a4 2s e c r e t i o nf r o m h u v e cb ys u p p r e s s i n gt h ee x p r e s s i o no f1 3 - s e c r e t a s eb a c e 1a sw e l la s 丫s e c r e t a s e p e n 2a n d a p h o u rs t u d ys h o w e dt h a tm a c r o a u t o p h a g yw a si n v o l v e di n t h ep a t h o g e n e s i so f a l z h e i m e r sd i s e a s e e n d o t h e l i a lc e l lc o u l dp r o d u c ea n ds e c r e t ea m y l o i db e t a4 2a n d c o n t r i b u t et ot h ef o r m a t i o no fc e r e b r a l a m y l o i da n g i o p a t h y m a c r o a u t o p h a g yc o u l d p r e v e n ta m y l o i db e t a4 2p r o d u c t i o nt r i g g e r e db ys t a r v a t i o ni nh u v e c k e yw o r d sa l z h e i m e r sd i s e a s e ，c e r e b r a la m y l o i da n g i o p a t h y , e n d o t h e l i u l c e l l ，b a c e1 ，p e n 2 ，a p h 、 7 目录 第一部分：1 0 引言1 0 实验方法1 4 实验结果1 7 讨论2 7 第二部分：3 0 引言3 0 实验方法3 4 实验结果3 7 讨 念4 6 参考文献5 2 一 附录6 5 综述6 7 发表论文7 8 、 8 符号说明 a d阿尔茨海默病 s p老年斑 n f t神经纤维缠结 t a u微管相关蛋白 a pp 淀粉样蛋白 c a a淀粉样血管病变 a p p淀粉样前体蛋白 c a t h e p s i n d溶酶体蛋白酶d e a t h e p s i nb溶酶体蛋白酶b p s l早老素l b a c e l p 淀粉样前体蛋白裂解酶1 m t o r雷帕霉素靶蛋白 p i k 3 i i i 磷酸肌醇酯3 激酶i 型 l e u p e p t i n亮抑酶肽 9 第一部分 阿尔茨海默病脑组织中大自噬的变化 1 引言 阿尔茨海默病( a z l e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 是一种常见于老年期的神经系统变 性疾病，临床上表现为进行性记忆力下降，认知功能障碍、视空间障碍及精神行 为异常。该病的患病率在6 5 岁人群中为5 ，而在8 5 岁人群中则高达3 0 - - 4 0 。 目前中国约有5 0 0 多万a d 患者，随着中国人口老龄化进程的加速，a d 患者人 数将更加增多，这不但会给家庭带来精神和经济上的负担，而且会不可避免地影 响社会的发展和稳定。据统计，美国每年因a d 造成的直接( 包括医疗费用及有 关的花费) 和间接( 指收入下降) 经济损失约为1 0 0 0 亿美元【1 】。因此，探讨 a d 发病机制，从而寻找预防与治疗a d 的方法具有重要的社会意义和经济价值。 a d 的病理上主要表现为细胞外的老年斑( s e n i l ep l a q u e ，s p ) ，细胞内的神经 原纤维缠结( n e u r o f i l a m e n tt a n g l e ，n f t ) 和海马神经元丢失。s p 主要是一种命 、 名为b 淀粉样蛋白( a p ) 的蛋白异常折叠后聚集所形成，而n f t 主要是由微管 相关t a u 蛋白的异常磷酸化后形成的聚集体。除此之外，a p 也聚集在血管周围， 主要沉积在软脑膜血管，毛细血管和小动脉周围，形成病理上被称为淀粉样血管 病变( c e r e b r a la m y l o i da n g i o p a t h y ，c a a ) 的病理改变 2 】。 自1 9 0 7 年a l o i sa l z e i m e r s 首次报道a d 至今已有1 0 0 多年，但对该病的发 病机制仍不十分清楚。目前有关a d 的发病机制有多种假说：如a 1 3 假说，低灌 注假说，炎性假说等。其中最为肯定的是a 1 3 假说：a b 是一个由3 9 4 2 个氨基酸 组成的蛋白，来自于淀粉样前体蛋白( a p p ) ，同时也是s p 的主要成分。a p p 被a 分泌酶切割成分泌到细胞外的可溶性a p 片段，而被d 和丫分泌酶切割后产 生有神经毒性的a 3 4 0 4 2 。a 3 的沉积是a d 发病的启动因素，a p 的代谢和清除 障碍最终导致n f t 形成和神经元的死亡【3 】。 1 0 此外，内吞溶酶体途径和a d 的关系也得到一定的关注。溶酶体特异性水解 酶q a t h e p s i nd 第二外显子上的2 2 4 位的丙氨酸至缬氨酸的基因多态性在a d 患 者中明显升高( 达1 1 8 ) 【4 】。用家族性a d 的一个基因突变a p p 的突变体构 建的转基因动物模型中，有明显的溶酶体功能上调，表现为囊泡样结构增多，水 解酶如c a t h e p s i nd 等的转录和表达增高 5 】。用c a t h e p s i nb 基因敲除小鼠研究也 发现，a p 的产生和s p 增多 6 】。而这种溶酶体功能改变往往早于a p ，s p 和临床 表现，提示该表现可能是a d 发病的启动因素。据此，。很多学者提出了溶酶体功 能异常在a d 发病机制中的可能作用：神经元的内吞溶酶体( e n d o c y t o s i s l y s o s o m e ) 功能障碍，使得溶酶体内的水解酶外溢，造成细胞的损伤【7 】。 然而，在早老素l ( p s l ) 的突变体构建的转基因动物模型中，神经元中出 现大量的囊泡结构，溶酶体功能激活，而内吞系统( e n d o s o m a ls y s t e m ) 却没有 明显改变，该内吞一溶酶体的发病机制假说受到挑战。随着自噬途径在酵母菌中 的研究不断被阐明，使得a d 中的溶酶体改变的意义得到新的阐述。s u z u k i 等早 在1 9 6 7 年就发现在a d 患者的病理组织中，营养不良性或肿胀性神经突中 ( d y s t r o p h i cn e u r t i e s ，d n ) ，不仅有大量的t a u 蛋白形成的纤维结构，还有囊泡体 存在【8 】。近来，通过电镜和相关抗体对细胞超微结构的进一步分析，越来越多 、 的学者认为a d 病理组织中的这种囊泡结构其实是一种自噬体结构。用特异性的 自噬体标记( 如l c 3 等) ，特殊的自噬体形态结构及电镜和免疫电镜技术，研究 者们发现在a d 病理组织和p s l 和a p p ( 家族性a d 的突变基因) 构建的a p p p s l 的a d 转基因小鼠的脑组织中，也出现类似a d 囊泡的病理改变，自噬相关的一 些蛋白表达上调，自噬体形成增多【9 】。异常自噬体聚集主要存在于神经元的营 养不良性神经突中，而溶酶体主要位于神经元的胞体的细胞核周围。结合神经元 自噬体途径的特点，即自噬体形成在轴突周围，通过轴突的微管系统逆向运输至 胞体，与溶酶体结合后降解，部分学者提出，a d 中可能存在自噬功能的运输和 成熟障碍，而溶酶体堆积可能是一种自噬过程障碍的继发表现 1 0 】。进一步的研 究在体外和体内实验中又证实了大自噬途径参与了a p p 在细胞内的代谢。这些 研究显示大自噬体内有a p p 剪切所需的丫分泌酶p s l 等，经p 分泌酶剪切的a p p 的c 末端( 1 3 c t f ) ，提示大自噬途径能产生致病性的a b 4 2 片段【1 l 】。虽然这些 病理改变的出现和体内外的实验都提示大自噬的形成过程可能在a d 发病机制 中起到一定的作用：但是，大自噬途径是如何参与a d 的发病，其确切的具体机 制到目前还未明确。 众所周知，细胞内对蛋白质的降解主要通过两条途径：自噬溶酶体和泛素蛋 白酶体，它们分别调控长寿命和短寿命蛋白，细胞器的降解，从而保证蛋白质的 正常工作，维持细胞的正常功能。自噬溶酶体途径又被称为自噬途径，近年来自 噬途径的异常在神经变性疾病、尤其是在a d 发病中的作用得到了广泛的关注 9 ，1 1 1 3 1 。自噬途径中重要蛋白a t 9 5 a t 9 7 基因敲除的大鼠模型表现出神经变 性疾病的一些表型【1 4 】。这说明仅仅通过抑制细胞内的基础自噬功能，而没有任 何特殊致病性蛋白的参与，就可出现神经变性疾病的表现，也提示自噬途径在神 经变性疾病中、特别是a d 有着重要的作用。 自噬途径是细胞内固有的降解长寿命蛋白和细胞器的过程。主要包括三种 类型：大自噬途径( 本文主要探讨，下文简称为自噬) ，小自噬和分子伴侣介导 型自噬途径【1 5 ，1 6 】。细胞胞浆中出现大量游离的膜性结构，称为前自噬泡 ( p r e a u t o p h a g o s o m e ) 。前自噬泡逐渐发展，成为由双层膜结构形成的空泡，其 中包裹着变性坏死的细胞器和部分细胞浆，这种双层膜被称为自噬泡 ( a u t o p h a g o s o m e ) 。自噬过程的早期是自噬泡的合成，主要是两种泛素样连接系 统参与，即a t g l 2 - a t 9 5 和l c 3 连接系统( 见图1 ) 。a t 9 1 2 一结合过程与前自噬泡 ( p r e a u t o p h a g o s o m e ) 的形成相关，而l c 3 修饰过程对自噬泡( a u t o p h a g o s o m e ) 的形成必不可少 17 】。 a t g l 2 和a t 9 5 是自噬途径中两个重要的功能蛋白，分别由1 8 6 个和2 7 5 个 氨基酸组成。a t g l 2 和a t 9 5 在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位 在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段，该结合蛋白对于自噬体的形成过程具有重 要的作用【1 8 2 1 】( 图1 ) 。微管相关蛋白l 的轻链3 ( l c 3 ) ，是酵母菌自噬基因 ( a t 9 7 a t g s ) 在哺乳动物中的同源物，和前者相比，l c 3 除了定位在自噬体分隔膜 上，也一直以和磷脂酰乙醇胺即脑磷脂( p e ) 结合的形式( l c 3 - p e ) 存在于自噬体形 1 2 成各阶段的内外膜上。a t 9 1 2 ，a t 9 5 和l c 3 是公认的大自噬途径的标记性蛋白。 一秋 厂感溉 辨si s a t a t l a am a m b m a - , aa 洲柏o s o m 8 图表l 自噬的分子机制，实验所选择的其中的三个自噬标记蛋白：a t g l 2 ，a t 9 5 ，l c 3 自噬途径主要通过三种系统调节：m t o r , a t g l 相关蛋白和 p i l i 2 2 - 2 8 。m t o r 是指一种丝氨酸苏氨酸激酶，在细胞内参与多个系统 的调节作用，使得细胞更好地适应细胞外营养状况的变化。营养物质如氨基酸的 变化及r a p a m y c i n ( 雷帕霉素) 能特异性地抑制m t o r , 从而起到增强大自噬途 径的作用。3 甲基腺嘌呤( 3 - m e t h y l a d e n i n e ，3 - m a ) 是磷脂酰肌醇3 激酶的抑制 剂，能作用于p i k 3 i l l ，起到抑制大自噬途径。3 m a 和r a p a m y c i n 是目前常用的 大自噬途径的特异性抑制剂和增强剂。 本研究用a t g l 2 ，a t 9 5 和l c 3 这三个抗体作为大自噬体形成的两个标志性 蛋白，观察了1 1 名用b r a a k 和c e r a d 方法进行不同严重程度分类的a d 患者 的脑组织内的大自噬途径的情况，其与细胞内的t a u 蛋白形成的n f t 和细胞外 的a p 形成s p 的联系，并进行相关性分析，从而进一步探讨大自噬途径在a d 及其相关的c a a 发病机制中的作用。 2 实验与方法 2 1 a d 脑组织 本实验中所使用的a d 脑组织均来自于澳大利亚新南威尔士大学附属威尔 士王子研究所的神经变性疾病脑库。所选用的a d 脑组织的患者均签署了知情同 意书。本研究也通过了新南威尔士大学和悉尼大学的伦理委员会的同意。本研究 共选取了1 1 个脑组织标本，其中2 名患者同时也符合路易体痴呆( d e m e n t i a w i t h l e w yb o d y , d l b ) 的诊断，6 名患者同时有脑梗塞，2 名存在小血管疾病，但是， 以上患者在所选取的颞叶组织区域没有脑梗塞病变。所选取的患者的年龄为7 3 岁至9 4 岁，平均年龄为8 2 岁。平均病程为1 1 年( 表1 ) 。 2 2 仪器和试剂 本实验中所选用的抗体：a t g l 2 ( 货号a p l1 5 1 a , a b g e n t 公司，s a nd i e g o ，美 国，稀释浓度为1 ：5 0 ) ；a t 9 5 ( 货号a p l 8 1 2 b ，a b g e n t 公司，s a nd i e g o ，美国，稀 释浓度为1 ：5 0 ) ；l c 3 ( 货号a p l 8 0 1 a , a b g e n t 公司，s a nd i e g o ，美国，稀释浓度 为1 ：2 0 ) ；a p ( 名称m a b l e 8 ，墨尔本大学c o l i n ym a s t e r 教授赠予，能识别 a p 4 0 a 1 3 4 2 ，稀释浓度为1 ：5 0 ) ；生物素标记二抗( 货号b a 2 0 0 0 ，小鼠；货号b a 6 0 0 0 ， 兔，v e c t o r 公司，b u r l i n g a m e ，c a ，美国；稀释浓度为1 ：2 0 0 ) ；a l e x a 5 6 8 二撤货 号a 11 0 11 ，m o l e c u l a rp r o b e 公司，e u g e n eo r 美国，稀释浓度为1 ：2 0 0 ) , a l e x a 4 6 8 二抗( 货号a 11 0 0 1 ，m o l e c u l a rp r o b e 公司，e u g e n eo r 美国，稀释浓度为1 ：2 0 0 ) 。 a b 辣根过氧化物酶( 货号p k 6 1 0 0 ，v e c t a s t a i n 公司，c a ，美国) 。 本实验中所使用的仪器：o l y m p u sb h 2 仪器，z e i s s 镜头进行照相，用 a x i o v i s i o nr e l 4 2 图像处理软件进行图像分析；o l y m p u sb x - 5 1 仪器进行照相， 用i m a g ep r op l u s 图像处理软件进行图像分析。n i k o nc 1 显微镜( e z - c 1 ) 进行 荧光共聚焦显像。 2 3 免疫组化 取a d 患者的石蜡包埋的颞叶脑组织，以1 0 m m 的常规厚度进行切割。用苏 木精伊红染色( h e 染色) ，g a u y a s 银染，对所取a d 脑组织标本，根据病理改 1 4 变进行a d 的病理诊断，并进行b r a a k 和c e r a d 分期。然后，用a p ，a t g l 2 ，a t 9 5 ， l c 3 ，t a u 特异性抗体，进行免疫组化染色。在常规切片后，将脑片置于已进行 明胶浸泡的玻片上，常温将切片烘干备用。 切片在二甲苯中脱蜡，梯度酒精水化。微波照射进行抗原修复后，5 0 乙醇 ( 含3 h 2 0 2 ) 抑制非特异性过氧化物酶，9 9 蚁酸处理5 分钟，2 0 马血清常 温封闭4 0 分钟，一抗4 c 孵育过夜，a b c 法( 二抗3 7 孵育1 小时，三抗常温 。 孵育1 小时) ，1 h 2 0 2 和d a b 孵育5 分钟。然后，将染色后的脑组织切片进 行梯度脱水，封片。所有的免疫组化染色都设置阴性对照( 即无一抗孵育) 。图 像均在2 0 0 x 的放大倍数下采集。 对a d 脑组织内a t g l 2 ，a t 9 5 ，a t 8 和a p 染色阳性的血管和神经元进行半 定量，。标准如下：( - ) ：无阳性染色；( + ) ：零星可见阳性染色；( 抖) ：中等强度染 色；( 抖+ ) ：较强染色。由两名研究者进行评估，并统计计算1 c 值，提示评估结 果相当匹配。 2 4 免疫荧光 免疫荧光双标的方法与免疫组化方法类似，切片在二甲苯中脱蜡，梯度酒精 水化。微波照射进行抗原修复后，5 0 乙醇( 含3 h 2 0 2 ) 抑制非特异性过氧化 物酶，9 9 蚁酸处理5 分钟，2 0 马血清常温封闭4 0 分钟，一抗( a t g l 2 ，a t 9 5 ，l c 3 抗体和a t 8 ，t a u 2 ，a p ) 4 。c 孵育过夜，荧光二抗3 7 c 孵育l 小时，甘油封片。 免疫荧光的图像均在4 0 0 的放大倍数下采集。共聚焦图像在6 0 0 的放大倍数向 采集。 2 5 统计分析 用s p s s ( 澳大利亚新南威尔士大学附属威尔士王子研究所) 软件进行数据 分析，p 0 0 5 被认为有显著意义。所采用的统计方法有因素分析，s p e a r m a n 相 关因子分析，以分析a t g l 2 染色阳性程度与a d 脑组织中不同细胞类型之间的关 系，此外分析a t 9 1 2 染色阳性和l c 3 染色阳性细胞与a d 的病情( 如年龄，病 1 5 、 程和进行病理切片之间的时间延误) 、病理改变的严重程度( b r a a k 评定的n f t 的严重程度，c e r a d 评定的s p 严重程度，a t 8 染色评估的n f t 严重程度，a p 染色评估的淀粉样蛋白沉积的严重程度) 等变量之间的相关因素。 1 6 3 结果 3 1 所选a d 脑组织标本的人口学统计结果 所选取的a d 脑组织标本的患者的平均死亡年龄为8 2 士7 岁，a d 的平均病 程为1 1 4 - 4 年，脑组织送至病理处理的平均时间为1 8 士1 5 小时。对照组的平均死 亡年龄为7 8 + 1 0 岁，脑组织送至病理处理的平均时间为1 7 = 1 = 1 0 小时。两组进行 m a n n - w h i t n e yu 检验方法进行统计，无明显差异( 妒o 0 5 ) ，结果见表1 。所选 取的a d 脑组织样本和对照组均进行相关染色，通过b r a a k 和c e r a d 进行a d 病理分期，结果见表2 。 表1a d 脑组织的人口学特征 a d 脑组织性别死亡年龄( 年)a d 的病程( 年)脑组织的获取时间( 小时) c 1m6 81 1 c 2f7 22 9 c 3m7 52 4 c 4 f 8 01 7 c 5f9 45 a d lf8 96 3 4 a d 2m7 97 1 3 a d 3f7 395 a d 4m8 71 03 ， a d 5m9 41 04 4 a d 6m7 9 1 1 3 1 a d 7m8 21 11 9 a d 8m7 01 36 a d 9m8 81 35 a d l of8 31 57 a d l lf7 91 93 5 m = 男性，f = 女性 1 7 表2 神经元和血管内皮细胞中的a t g l 2 和l c 3 染色的严重程度，与b r a a k 分期，a d 患者的病程的情况 病例病程s p ( 每2 0 0c an f t 分 a t 9 1 2 + l ca t g l 2 + l c 3a t g l 2 ( 年)个视野)a期( o 6 )3 + 汀8 的+ a t 8 + 的神+ 血管 神经元经元内皮细 胞 正常。士0 0 50 6 士1 3 a d l61 7 是 4 + + + a d 271 3 是 6 + + + + a d 3 9 2 05+ + + a d 4 1 09 4+ a d 51 02 16 + + a d 61 11 95 + + a d 71 193 + a d 81 32 l5 + + + a d 91 31 14 + a d l 01 54 36 + + + a d l l1 93 l5 + s p = 老年斑c a a = 淀粉样血管病变n f t = 神经原纤维缠结 正常对照组的所有数据都表示为均值士标准差( 其中a t 9 1 2 和l c 3 的染色均为阴性) 。 1 8 3 2 a d 脑组织内大自噬相关蛋白a t g l 2 ，a t 9 5 ，l c 3 的表达情况 用a t g l 2 ，a t 9 5 ，l c 3 在a d 颞叶脑组织进行免疫组化，我们发现神经元内 a t 9 1 2 ，a t 9 5 ，l c 3 染色阳性，而a d 血管上仅有a t g l 2 ，a t 9 5 染色阳性。在正 常对照组的脑组织中没有发现这些蛋白的阳性染色。 在a d 患者脑组织的神经元中，a t g l 2 a t 9 5 和l c 3 的阳性染色主要位于细 胞的胞体和树突内，呈弥散型分布；或位于n f t 结构，或斑块样结构中( 见图 1 ) 。我们进一步对这些a t 9 1 2 a t 9 5 和l c 3 的阳性染色的斑块样结构( 图1 c ) 进一 步行a p 免疫荧光染色，证实其为s p 的一种( 图i f ) 。营养不良性神经突结构 中，t a u 蛋白抗体a t 8 染色阳性，其中大部分同时也有a t g l 2 染色阳性( 达7 0 左右，图1 e ) 和l c 3 染色阳性( 4 0 左右) 。在a d 患者的脑组织的神经元的胞 体内，a t g l 2 和l c 3 的染色阳性主要与n f t 共定位( 5 5 左右) ，少部分与a t 8 染色阳性的n f t 前体( p r e t a n g l e s ) 共定位( 5 ) ( 图1 d ，j l ) 。进一步的研究发 现，4 0 的a t 9 1 2 或l c 3 染色阳性的神经元的t a u 蛋白相关抗体a t 8 呈阴性染 色( 图1 d ，1 m o ) 。 1 9 ，夕三 ， 憋 ：t ；，矿? ： ，i h 劓 t 图1 大自噬标记a 馏1 2 和l c 3 在a d 脑组织神经元中( a 表示e n t o r h i n a l 皮质) ，神经 原纤维缠结样结构中( b 表示海马c a i 神经元) 和斑块样结构中的表达( c 表示颞叶皮层) 。 共定位实验显示大自噬标记蛋白在神经元内与a t 8 部分共定位( d 显示l c 3 标记的c a l 神 经元，m 旬显示a 蟾1 2 标记的海马c a l 神经元) 。共定位也显示大自噬标记的蛋白与a t 8 在营养不良性神经突中部分共定位( e 显示a t 9 1 2 表达在颞叶皮层) 。在斑块内，a 3 与大自 噬标记的蛋白没有共定位( f 表示a 谵1 2 表达在颞叶皮层) 。典型的a t 8 阳性的神经原纤维 缠结也显示大自噬标记蛋白( g l 显示a t 9 1 2 表达在海马c a l 的神经原纤维缠结中，插入 的图片显示l c 3 表达在海马的c a l 的神经原纤维缠结中，插入的标尺为5 0 p r o ) 。 在光镜下，a t g l 2 染色阳性的神经元表现为胞体型或是n f t 型( 见图2 a 和 b ) 。a t 8 或t a u 2 的免疫荧光将以上的神经元进步分为四种类型，但均与a 1 3 无共定位。第一种类型表现为胞体型，其中a t g l 2 与t a u 有共定位( a t 8 ，或及 t a u 2 ) ，约占所有a t g l 2 阳性染色神经元的5 左右。i 型神经元又分为a 型， 定义为神经元内a t g l 2 仅仅与a t 8 共定位( 见图2 ，m o ) ，提示这些神经元内自噬 异常与早期磷酸化t a u 蛋白相关。而ib 则表现为a t g l 2 与a t 8 及t a u - 2 均有共 定位( 图2 ，j l ) ，提示这些神经元内自噬异常与早期和晚期磷酸化t a u 蛋白均相 关。i i 型也表现为胞体型，与i 型的差异是仅仅有a t g l 2 染色，但与t a u 无共定 位( a t 8 ，或及t a u 2 ) ( 见图2 , p r ) 。这些神经元位于c a l - 4 区，数量较多，约 占5 5 左右。i i i 型为n f t 型，有a t g l 2 染色，但与a t 8 及t a u - 2 均无共定位， 主要位于内嗅皮层，约占4 0 左右( 见图2 ，s u ) 。型也为n f t 型，表现为有 a t g l 2 染色的n f t ，与t a u - 2 有部分共定位( 图2 ，g i ) ： 2 l 图2 a d 脑组织中a t g l 2 染色阳性的神经元：a 表示内嗅层的神经元，b 表示海马c a l 神经元的神经原纤维缠结结构和c 表示颢叶皮层的老年斑样结构。部分神经元内没有a b 和 a t g l 2 的共定位( d - f 显示颞叶皮层，p = 斑块) 。部分神经元的n f t 与a t g l 2 共定位( g - i ) 。 一些神经原纤维缠结前期神经元内也有a t g l 2 的染色。很多神经元内a t g l 2 染色阳性，但没 有a t 8 的染色( p r ) 。 a d 脑组织的血管组织上有a t g l 2 a t 9 5 的阳性染色( 见图3 ) 。进一步的免 疫荧光染色显示一部分内皮细胞a t g l 2 染色阳性的毛细血管和小动脉位于a p 染 色阳性的s p 的周围或s p 内( 图3 d j ) ，即部分a 蟾1 2 阳性毛细血管位于s p 周 围，或穿过s p ，但是两者没有共定位。免疫荧光双标研究发现a t g l 2 阳性染色 主要位于毛细血管，小动脉和软脑膜的血管内皮细胞上，而a b 阳性染色位于s p 内或血管平滑肌细胞上( 见图3 j k ) 。同时，免疫荧光双标没有显示以上的这些 大自噬途径相关蛋白( a t g l 2 ，a t 9 5 和l c 3 ) 在血管内皮细胞上与t a u 蛋白标记 a t 8 有共定位。 。 a i 。t强曳 。 。i 曩 j ? 嗲承 _ ” 飞嚏 j 、呻二 一- 图3 大自噬标记的蚩白a 蟾1 2 和a t 9 5 在a d 脑组织的血管内皮细胞中的表达情况。 免疫组化染色显示在正常对照的海马c a l 区域没有a t g l 2 的染色( a 表示正常对照脑 组织的海马c a l 区域的a t g l 2 的染色为阴性) 。在a d 脑组织中，一些毛细血管( c 表示颞 叶中的a 馆1 2 的染色) 和一些大血管( b 表示颞叶中的a 蟾1 2 的染色) 。这些大自噬标记蛋 白染色阳性的血管在空间上与a b 染色阳性的斑块( p ) 有密切的联系( d - i 表示颞叶中的a 蟾1 2 的染色) 。很多小动脉和动脉上都有a 1 3 沉积在平滑肌细胞上( 刚果红染色阳性的血管病变) ， 在这些血管的血管内皮细胞上有a t g l 2 a t 9 5 染色阳性( j 和k 表示颞叶中的a t g l 2 的染色， l 表示颞叶中的a t 9 5 的染色) 。 ，ft f了 3 3 临床和病理表现的相关性研究结果 我们对a 噜1 2 阳性染色的毛细血管、血管和神经元进行半定量，然后用 s p e a r m a n 方法统计分析一些临床资料与病理改变之间的相关性。结果发现a t g l 2 或l c 3 染色阳性的神经元与血管内皮细胞之间没有明显的相关性。然而，a t g l 2 或l c 3 染色阳性的神经元与a d 疾病的病程有负相关性( 见表3 ，相关系数： 0 8 2 5 ，p = 0 0 0 6 ) ，这提示a d 神经元内的大自噬体的形成可能出现在疾病的早 期，而神经元的变性可能在a d 早期就已经开始，随着疾病的逐渐进展而变性程 度加重。而这些a t g l 2 或l c 3 染色阳性的神经元与a d 的病情严重程度，即用 b r a a k 分期定义的以n f t 为标准的a d 疾病严重程度，c e r a d 定义的以a d 沉 积形成的s p 为标准的a d 疾病严重程度，或淀粉样变性血管病变之间没有明显 的相关。然而，a t g l 2 或l c 3 染色阳性的毛细血管与用b r a a k 分期定义的以n f t 为标准的a d 疾病严重程度之间有明显的相关性( 相关系数= 0 8 0 1 ，p = 0 0 0 3 ) 。 但是，a t g l 2 或l c 3 染色阳性的毛细血管与c e r a d 定义的以a 1 3 沉积形成的s