（分析化学专业论文）c4、igm和igg的免疫共振散射光谱分析.pdf

桂林工学院硕士学位论文 c 4 、ig m 和ig g 的免疫共振散射光谱分析 中文摘要 共振散射技术作为一种新的分子光谱技术，方法简便、灵敏度高，可用普通 的荧光分光光度计测量，因此该方法发展十分迅速，应用领域已经扩展到蛋白质、 核酸、药物以及痕量金属离子等诸多方面的分析。本文在前人研究的基础上，继 续开拓共振散射技术在免疫分析中的应用。本论文共分四章。 第一章为绪论，介绍了共振散射技术的原理及在生化分析中的应用；综述了 金纳米微粒的制备、表征、以及胶体金标记技术在生化分析中的应用；介绍了补 体4 ( c 4 ) 、免疫球蛋白m 和免疫球蛋白g 的分析进展。 第二章在p h 7 3n a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 缓冲溶液中及聚乙二醇6 0 0 0 ( p e g - 6 0 0 0 ) 存 在下，补体4 ( c 4 ) 与羊抗人补体4 ( g o a t 觚t i 1 n 腑锄c 4 ) 的免疫复合物可聚集形 成疏水的免疫复合物微粒，在3 5 0 i l i i l 、4 4 0 r 啦有两个共振散射峰，在3 9 0 n m 有一 个同步散射峰。激光散射法测得免疫复合物微粒的平均粒径为3 4 4 0 衄。补体4 ( c 4 ) 浓度在0 1 8 2 6 0 “g m l d 范围内与3 5 0 衄、3 9 0 啪处的散射强度都呈线性，检出 限分别为o 0 8 4 鹏m l 、0 1 1 鹏m l 一。该法用于分析正常人血清中补体4 ( c 4 ) ， 结果满意。 第三章用粒径为1 0 衄的金纳米微粒标记羊抗人免疫球蛋白m ( i g m ) ，制备 了i g m 的免疫纳米金共振散射光谱探针。在p h 4 5 的k h 2 p 0 4 - n a 2 h p 0 4 缓冲溶液 及p e g 存在下，金标羊抗人i g m 与i g m 发生特异性结合生成胶体金免疫复合物， 离心分离，获得未反应的金标抗上层清液。以此纳米金标抗作为催化剂，在p h l 9 的盐酸一柠檬酸钠缓冲溶液，催化n h 2 0 h h c l 还原吸附在免疫纳米金表面的金络 离子物种( a u c l j l 。) 生成粒径更大的金纳米微粒，导致5 8 0 啪处金纳米微粒的共 振散射强度急剧增大。结果表明，随着i g m 浓度增大，离心上层液中金标抗降低， 毛8 0 啪线性降低，其厶8 0 姗与i g m 浓度在o 0 5 4 8 0n g 1 1 1 l d 范围内呈良好的线性 关系，检出限为0 0 3n g m l 一。 第四章纳米金、纳米银、纳米铂对葡萄糖还原铜( i i ) 生成c u 2 0 微粒这一慢 桂林工学院硕士学位论文 反应具有较强的催化作用，c u 2 0 微粒在3 9 0 岫、4 5 0 1 1 l i l 、5 0 5 姗处产生3 个 较强的共振散射峰。采用共振散射光谱检测反应产物c u 2 0 微粒，研究了纳米 金标羊抗人i g g 对葡萄糖一铜( i i ) 反应的催化作用。将i g g - 纳米金标羊抗人i g g 免疫反应与离心分离技术结合，建立了超痕量i g g 的免疫纳米金催化铜增强共 振散射光谱新方法。随着i g g 浓度增大，离心上层液中纳米金标抗浓度降低， 5 0 5 珊处的共振散射光强度如0 5 啷线性降低，其降低值厶舢与1 9 g 浓度n 窖g 在o 1 3 5 3 3i l 粤：i i l i j 范围内呈良好的线性关系，检出限为o 0 9n g m l 。本法所 用试剂价廉易得、反应易控制、稳定性好、灵敏、快速和高的特异性，用于定 量分析人血清中的i g g ，结果满意。 关键词：补体4 ，免疫球蛋白m ，免疫球蛋白g ，共振散射，金标记，免疫纳米 金催化一金增强，免疫纳米金催化一c u 2 0 增强 桂林工学院硕 士学位论文 i m m u n o r e s o n a n c es c a t t e “n gs p e c t r a ia n a l y s i so fc o m p l e m e n t4 ， i m m u n o g i o b u l mm a n di m m u n o g l o b u l i ng a b s t r a c t 鼬n 锄c es c 甜商n g 皿s ) s p e 曲a lt e c h n i q 鹏，w n hh i 曲s e n s i t i v i 吼唧i d 时觚ds j m p l i c i 吼w a s 印p l j e dt 0 蛐a 1 ) ，s j so f 乜徼ei n o 曜卸i ci 咖s 强do 唱舳j cc o m p 删喇ss u c h 嚣n u c l e i c i da n d 舯咄抽s o nt l l eb 船i so ff b r e f _ a t h c r s r c s e a r c h ，t l l i sw o 血i sg o i i l gt oe x p l o i tt h ea p p l i c 撕o no f 他如啪c es 他疵n gt c d 1 0 l o g yhi m m u n ea 瑚l y s i s t 1 1 i sd i s n a t i o ni sc o r n p o s e do f f 0 c h p t e r s h c h 即i t e r1 ，m ep 血c i p l eo f 陀彻眦es c a 他r i n g 惦c h n 0 1 0 9 y 柚di t s 印p l i c a t i o ni i l m 脚州c a lc h 锄i 曲叮甜l dn 舡l o p a n i c l e s w e 托抽仃0 d u c e d t h ep r e p 删沁na n d i d e m i f i 咖i o no fc o l l o i dg o l da n d l ea p p l i c a t i o no fg o l d l a b e i e d 把c h n o l o 科i n b i o c h e m i c a la 堇l a l y s i si nt e 咖ty e a r sw e r e 剁吸删z e d 。t h ea i l a l 蛳c a lp r o 星球踞o fc 4 ， i g m 柚di g gw 黔淞l or e v i e 、坩d i nc 瞬懈2 ，i nt 1 1 ep h 7 3n a 2 册0 4 一k h 2 p 0 4b 曲s o l u t i o n 龃di n 恤p r c s e e o fp e o 一6 0 0 0 ，g o a t 锄t i _ h 眦l 舭“i sc o m b 岫d 、 ，i t l lc o n l p l e l i l 咖f h c 妨4 ( c 4 ) s p e c i f i c a l l y ，m l da g 酽e g a t e st of o 衄访咖n ec o r n p i e xp 矾i c l t h a te 姐l i b i tt w o 瑚o r 幽c es c a 札e m gp e a k sa t3 5 0 删a n d4 4 0n m ，锄das ”1 c l l l n o l l ss c a l n 耐n gp e a l 【a t 3 9 0n m t h el 雒c rs c a n e r i n g 砌i c a t e st l l a tt l l ea v e r a g ed i 锄e t c ro ft l l ei i i m l m 抢c 唧l e x p a r t i c l 龋i s3 “o n m “证t h ec o n c e 心a t i o nr a n g eo fo 18t o2 6 0 呜m l 1 咄 p r o p o r t i 伽a lt 0t h em s o 珊i r 鹏s c a t t c 】妇gi n t c n s i t ya t3 5 0 眦甜l d3 9 0 砌t h ed d e c t i l i n l i t 、v 酗o 0 8 4 峙m l - 1 ，0 1 1h g m l 。1r e s p e 嘶v e l y 1 km e ”mh a sb 嘲印p l - e df o rt l 璩 d e t 锄i 1 1 “o no fc 4i nt h eh l m 柏mb l o o d 九珊，w i ms a t i s 自咖r y s i l l t s h lc k l p t e r3 ，g o l dn 珊1 0 p 昌i n i c l e si ns i z eo f10 啪w e 代p r e p a r e db y 也ei m p r o 证 m e m o do f 打i s o d i 啪c i t r a ：e ，a n dw e r eu s e dt ol a b e l9 0 a t 枷h u i m mi m m u n o g l o b u l i l l 】 ( a n t i i g m ) t oo b t 出ar e n 柚c es c a t t 甜n gs p 。e c 司p r o b e f o ri g m i i l p h 4 5 k h 2 p 0 4 n a 2 h p 0 4b u 舵fs o l u t i o n 柚di n 吐犯p r e s e 眦eo fp o l y e m y l e n cg l y c o l ( p e g ) ， g o l d - 1 a b e l e da 而一i g m 瑚c o m l 湎e d 州mi g ms p e c i 缸a l l yt of o m li m 删m o g o l d c o m p l e xp 枷c l e s a n e rc 日耐如g 甜呱恤a u c ki o 璐，a d s o 舭do m es 1 曲c eo f i m m u i l o g o l dm n o p a r t i c l e si i lm eu p p e rs o l l n i o 玛、v e r er e d u c e db yn h 2 0 h h c l 血p h i i i 桂林工学院硕士学位论文 1 9c i t m t eb u 珏hs d u t i o n t h e1 a 增e rs i z eg o l dp a r t i c l e sw e r ef o m l e d ，r e s u l t i n g 砸t l l e s h a r pe m i a n 譬m e n to fm er c s o r 删c es c 毗e r i r 唔i m e n s i 哆a t5 8 0 砌1 1 l eg o l d - l a b e l e d 血i i g mi nt h cu p p e rs o l u t i o nd e c r e 勰e d 谢也t l l e 圳t ；0 no f1 9 m u n d c r 血co p 血姗 c o n d i t i o n ，廿l ed e c 化船c di m e 船i t ) r 弛舯硼w 鹋p m p o n i o f l a lt om ec o n c e n t r a t i o no fl g m i nt l 狞啪g eo f0 0 5 4 8 0n g 。m l 一，、析t i lad 烈e 曲l i r n i to fo 0 3n g m l qi g m 晰l gt o i t ss e n s i t i v i 母锄db 咖k c 吐v i 母，t h 毛i m m 1 0 彻n o g o l dr = e 9 0 n a l l c e a 瓶r i n gs p e c t r a l m e t h o dh a sb na p p l i e dt 0t 量地d e t e m l i 删o no fi 星r mi i l r 啪o fh c a l t 王l yh l m 龇，w i 廿l 姘i 幽c t 0 巧r e s u l t s i nc h a p 时4 ，山e 衄n o g o l d ，n a n o s i l v e r 卸dn 柚o p l 硝n 啪h a v e 啦o n gc a 土a l 蛳c e 髓c t0 nm ep a _ r t i c l e 咒a n i o no f9 1 u c o s e c u o i ) a t7 0 1 kp m d u c to fc u p l r o 峭o x i i 把 ( c u 2 0 ) p a r t i c l e se x l l i b i t s 廿u 俄r e s o n a n c es c a 仕e r i n g 皿s ) p e a k sa t3 9 0n 驰4 5 0 锄觚d 5 0 5m nr e s p e d i v e l y t h ec a _ t a l 蛳ce 任e c to fn 柚o g o l d - l a b e l e dg o a ta m i - h 啪眦i g g ( a u i g g ) 酉u c o s e c u ( i i ) p a n i c l er e a “o nh 髂b e e ni i l ：v e s t i g a t e d 、i 血ar sd e t e c t i o no f c op a m c l e s c 0 m b i n c dn a n o g o l d l a b e j e di m m u n e a c i o n 砌lo 锄埔f h g 甜t 酏l l n i q u e ， an i 聊i m m 咖o n 趾0 9 0 l d c 砒a 1 州co u 2 0 - e n h 釉c e m 舶tm e m o dl m sb e e nd e v e l o p e df 1 0 r l l l t 瑚e 1 1 s i t i v ed 咖“蚰o fi 咖眦1 0 9 l o b u hg ( i g g ) u n d e r 圯9 p t i 肌肌c o n d i t i 毗n 幛 g o l d - l a ：b e l e da 商一1 9 0i nm eu p p e rs o l 嘶衄d e c r e a s e dw i mt 1 1 ec o n c e 曲嘶0 no fi g g i 1 1 c r e a s m 岛t l l ed e c r e a s e di r i ：t e 酗i t ) r j 1 5 0 5 砷w 勰p r o p 嘶o n a lt ot l l ec o l l c e i 血a t i 蚰o fi g g i i lt l l er a n g eo f 0 1 3 5 3 3r l g m l 1 ，嘶t i lad 曲e c t i o nl i m 妇o f o 0 9n g m l _ i g go 、谪唱 t oh i 曲s e 琳i t i 们t ) r ，g o o d 1 c c t i v i t y ，r e p r o d u c i b i i 时，。c 0 咖l l a b i ef e a c t i o n 矾dl o 、c o s t r 哗哟，t h em 幽dh 筋b e a p p l i e dt ot h ed e t e 加血嘶o fk g i i ls e 咖lo f h e 酊n l y i i l 曲缸，w n hs a 土i s f a c t o 毋r c s l l l t s k e y w o r d s ：c o 唧l 锄c n t4 ( c 4 ) ，蛐g l o b u l i i lm ( i g m ) ，i 咖瑚。西o b u l i ng ( i g g ) ， r c s o 瑚n c es c a t 吼 n g ，g o l dla ：b c l ，i 哪瑚o - r e s o 脚1 c es c a n 鲥n gs p e c 乜面a n a l y s j s ， h n n 啪o n a n o g o l d - c a 协l y s i sg o l d e n h a n c e m e 虬i m m u n o n 姐o g o l d c a t a l y s i s c u 2 0 e n h a n 础m i v 桂林工学院硕士学位论文 独创性声明 本人声明：所呈交的论文是我个人在蒋治良教授指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得桂林工学院或其它教育机 构的学位或证书而使用过的材料。对论文的完成提供过帮助的有关人员已在论文 中作了明确的说明并致以了谢意。 学位论文作者( 签字) ： 签字日期： 版权使用授权说明 本人完全了解桂林工学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存学位论文的印刷本和 电子版，并提供目录检索与阅览服务：学校可以采用影印、缩印、数字化或其它 复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部 内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者( 签字) ： 指导教师签字： 签字日期： 桂林工学院硕士学位论；文 第1 章绪论 1 1 共振散射光谱技术 1 1 1 共振散射光谱技术的理论基础 光散射是一种常见的自然现象，是指当光通过介质时在入射光方向以外的各 个方向上所观察到的光现象。它源于光电磁波的电场振动而导致的分子中电子产 生的受迫振动所形成的偶极振子，振动的偶极振子相当于次级光源向空间发射的 电磁波，这就是散射光源【啦】。介质中微粒大小不同，产生的散射也不同。根据与 光子相互作用的微粒的尺寸大小( d ) 和入射光波长( ) 之间的关系，光散射可 分为米氏( m i e ) 散射( d 二峻) 、丁铎尔( t y n d a l l ) 散射( o 0 5 a d a ) 和瑞利( i 己a y l e i g l l ) 散射( d 0 0 5 a ) 。瑞利散射是一类散射波长等于入射波长且散射粒子( 如分子) 又远小于入射波长时产生的弹性散射，其散射强度与波长的四次方成反比。当瑞 利散射位于或接近于它的吸收带，由于电子吸收电磁波的频率与其散射频率相同， 电子因共振而强烈吸收散射光的能量发生再次散射，其散射强度通常较单一的瑞 利散射提高几个数量级，并且不再遵守散射强度与波长的四次方成反比的瑞利散 射定律。这种吸收一再散射的过程称为共振瑞利散射，又叫共振散射( r c s 0 彻n c e s c 舭r i n g ，r s ) 【3 】。共振散射的研究不需要专门的仪器，在普通的荧光分光光度计 上选择合适的激发和发射通带宽度，采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和 发射单色器所得的同步光谱( 五_ o ) ，即为光散射粒子的散射光谱【4 】。由于散射光 谱属于同步光谱，可看作散射粒子是能发射出与激发光相等波长的发光体，故而 散射信号属于同步发光。根据同步发光方程i 3 j ： i s l = k c be 一九曲e 啪( + 的( 1 ) ( 1 ) 式中e 能是在给定激发光波长处队x = k 九) 的激发函数，e 锄是在对应的发射 波长处( k x 司伽+ ”的发射函数，k 是与仪器条件有关的常数，b 是液池厚度。当 护o 时，即得共振散射强度为： i r l s - k c be c x ( 九既) e 锄k x ( 2 ) 由公式( 2 ) 可知在仪器条件一定时，散射强度与散射粒子的浓度成正比，据此可 以用于散射粒子的分析测定。 1 1 2 共振散射光谱技术在分析化学中的应用 1 1 2 1 共振散射光谱技术在蛋白质分析中的应用 近年来，共振散射( r e s o m n c es c 舭r i n g ，r s ) 已广泛应用于蛋白质的测定， 它们主要基于染料结合在蛋白质分子表面，形成较大的聚集体，导致共振散射信号 急剧增强【5 2 9 1 。此外，蛋白质还可与某些表面活性剂【3 0 0 4 1 、无机物【3 5 4 3 1 通过静电引 力和疏水作用力等形成较大的缔合微粒，由于缔合微粒和固液界面的形成，使得 桂林i 学院硕士学位论文 体系显示出共振散射效应，其共振散射强度随着蛋白质浓度的增加而呈线性增强， 从而建立定量测定蛋白质的共振散射光谱分析新方法( 表1 1 ) 。这类方法的灵敏 度较高，但一些方法的选择性欠佳，尢其是其它蛋白质干扰测定。 表1 1 共振散射法在蛋白质分析中的应用 t a b l e 1 1t h ea p p l i c a t i o no fr sm e t h o df o rp r o t e i na n 锄l y s i s 2 桂林工学院硕士学位论文 a f p磷锑铝蓝5 2 7 8 o 2 5 0 0 人血清1 8 7 - g h s a b s a ：q n h s a h s a h s a 考马斯亮蓝 o 0 6 1 2 考马斯亮蓝 o 0 3 o 5 考马嘶亮蓝 o 0 4 o 8 考马斯亮蓝 萘铬绿 三滨偶氮肿 o 0 4 1 0 o o 9 0 2 5 4 0 o 4 偶氮变色酸苄o 2 4 0 荧光酮 9 2 4 7 6 3 7 9 4 1 2 4 3 8 0 7 5 0 h s a 二溴氯代偶氮胂2 5 6 0 0 8 9 6 一铝( ) b s a 铝( ) 铬天青0 o 2 8 9 8 c l 冲 h s a h s a h s a 皤p b s a h s a 丫- i g g o v b p a p a i n h s a 。 b s a h s a s c r p 抗体 n - 淀粉酶 铀试剂1 0 0 3 1 s o 0 2 2 0 0 1 5 0 铬天黑t ( e b t )o o 1 5 o 磷锑钼蓝 四磺基锰酞菁 四磺基锰酞菁 四磺基锰酞菁 四磺基锰酞菁 5 2 7 8 0 0 1 3 o o 0 l _ 6 o 0 5 2 0 0 0 1 0 o 2 0 4 o 1 1 3 9 0 2 5 0 0 5 7 8 3 1 3 1 3 十二烷基苯磺酸o 0 4 8 4 80 0 2 0 u s p r n l 1 钠一酪蛋白 u s p - m l 1 十二烷基硫酸钠0 0 l o o 十二烷基硫酸钠 o 0 1 0 o 十六烷基三甲基0 0 2 5 5 o 溴化铵一桑色素 2 1 0 1 7 0 2 3 o 合成样：1 9 合成样1 9 合成样1 9 合成样 1 9 尿样 2 0 人血清 2 1 人血清 2 2 人血清 2 3 1 合成样 2 4 人血清 2 5 人血清 】7 人血清 2 6 人血清 2 7 人血清 2 8 人血清 2 9 人血清2 9 人血清2 9 人血清 2 9 嫩肉粉3 0 人血清3 1 人血清3 1 台成样3 2 b s a 芦丁一十六烷基o 0 0 5 2 53 o 合成样 3 3 3 桂林工学院硕士学位论文 溴化吡啶 h s a十四烷基二甲基0 1 6 8 0 l o 0 人血清 3 4 苄基氯化铵 h s a钼酸根 0 0 2 6 05 2 合成样 3 5 t g 磷钼杂多酸 0 1 1 0 03 0 o 人血清 3 6 b s a 杂多化合物 0 0 4 5 o1 1 6 人血清 3 7 h s a k 3 【f e ( c n ) 6 】 0 0 12 03 0 0 人血清 3 8 c 鹄e i n 三氯乙酸 0 o l 1 2 0 o1 0 人血清 3 9 h s a 三氯乙酸 0 0 0 3 4 0 o1 0 人血清 3 9 b s a 三氯乙酸 0 0 0 5 4 0 oo 5 人血清 3 9 7 g 三氯乙酸 0 0 0 l 1 5 o0 2 人血清 3 9 h s a 铬( ) 0 2 5 0 o5 4 o 合成样 4 0 h s a 卤铂酸0 8 5 2 人血清 4 l 丫i g gh g s 0 o l 0 1 4 2 7 1 人血清 4 2 丫- l g g p b s 微粒o 0 1 o 5 2 7 5 人血清 4 3 注：b s a ：牛血清白蛋白；丫g ：丫球蛋白；h s a ：人血清白蛋白；c 硒e i n ：酪蛋白；a f p ： 甲胎蛋白；o v a ：卵清蛋白；a - c h y ：a - 糜蛋白：l y s ：溶菌酶；p 印a i n ：木瓜蛋白酶；丫- i g g ： t - 免疫球蛋白g ；o v b ：卵蛋白；c r p ：c 版- 应蛋白； 1 1 2 2 共振散射光谱技术在核酸分析中的应用 大多数核酸的检测借助静电引力作用使有机染料在核酸表面堆积，形成大的 复合物微粒，其共振散射信号明显增强，可用于核酸的测定。亚胺类的染料如藏 红t m j 、亚甲基蓝【4 5 1 、中性红m 可以在核酸分子表面进行长距离组装，产生特征的 共振散射光谱，用于核酸测定；某些碱性三苯甲烷类染料如乙基紫【4 7 1 、结晶紫【4 引、 甲基紫【4 9 1 、吖啶橙5 0 1 、玟苯胺【5 1 1 和碱性品红【5 2 】能与核酸结合用于核酸的共振散射 光谱分析测定，具有较高的灵敏度；罗丹明b 【5 3 1 、丁基罗丹明b f 5 4 】、耐尔蓝硫酸盐 【5 5 】、灿烂甲酚蓝【5 6 1 、氯化硝基四氮唑蓝吲也用于共振散射法测定d n a 的研究；其 次，表面活性剂用于d n a 与染料产生的共振散射光谱增强的研究也时有报道【5 8 巧9 】； 另外，由于某些无色、无荧光的小分子借静电引力、疏水作用、氢键等弱结合力 组装于核酸模板上时，将引起核酸体积增大和核酸构象发生改变，共振散射技术 为研究药物小分子与核酸之间的相互作用提供了新的途径。其中以d n a 为作用靶 点的分子与d n a 之间相互作用的研究一直是一个比较活跃的领域，临床上使用的 4 桂林工学院硕士学位论文 坏其结构，进而影响基因调控与表达的功能，表现出抗癌活性进行抗癌药物与 d n a 相互作用的研究无论对阐述抗癌药物的作用机理、药物的体外筛选，还是对 新型的抗癌药物的分子设计都是非常有意义的【6 删。 1 1 2 3 共振散射光谱技术在药物分析中的应用 在一定的条件下，某些试剂能够与药物反应形成离子缔合微粒，使得体系的 共振信号急剧增大，由此可建立测定药物的共振散射光谱分析法。苯海拉明( d p ) 与赤藓红( e t ) 相互作用形成1 ：1 的离子缔合物，可用于乙醇胺类抗组胺药物苯海拉 明的测定，检测限为0 0 0 2 0 p 咖l ，线性范围是o 0 0 6 7 一2 o 嵋m l l 6 引。喹诺酮类抗 菌素与p d ( i i ) 反应形成螯合物，进而与酸性染料曙红y 形成三元离子缔合物，可用 于痕量喹诺酮类抗菌素的测定，用于针剂、鸡血清中诺氟沙星的测定时，结果满 意【硎。刚果红( c r ) 与阿米卡星( a m k ) 相互作用形成离子缔合物后，可用于合成氨 基苷类抗生素阿米卡星的测定，检测限为4 o n m l ，线性范围是o 0 4 6 0 “咖l l 的j 。 肝素钠( h e p ) 与甲基红染料形成离子缔合物后，可用于人体血清中的肝素钠含量的 测定，结果满意吲。金纳米微粒与表柔比星( e p i ) 、柔红霉素( d n r ) 和米托葸醌( m x d 等葸环类抗癌药物形成粒径更大的聚集体，可用于人尿和血清中上述药物的测 定，检出限达2 7 9 0n 咖l 【6 7 1 。王齐等用硫化镉纳米微粒作为光谱探针，建立了 测定尿样中表柔比星( e p i ) 、柔红霉素( d n r ) 和米托葸醌( m x t ) 的新方法1 6 引。硫酸 耐尔蓝与肝素结合生成离子缔合物，用于肝素注射液的测定，检测限为o 4 2 n 咖l ， 线性范围是o 0 1 o 5 雌r m l 【6 9 】。用钨酸钠和乙基紫，可检测不同的四环素类抗生 素( 强力霉素、土霉素、四环素和金霉素) 【7 0 1 。铜纳米微粒可用于复合维生素中 维生素b 1 含量的测定，检出限为6 4 “g 刖7 l 】。氯金酸、曙红y 、四碘荧光素、四苯 硼钠、同多钼酸、十二烷基苯磺酸钠等可用于小檗碱的测定【_ 7 2 7 6 】，其中四苯硼钠 用于检测小檗碱较为灵敏，检测限为2 6 n g m “乃j 。 1 1 2 4 共振散射光谱技术在痕量金属离子、酸根离子、表面活性剂测 定中的应用 金属离子，非金属酸根离子，阴离子和阳离子表面活性剂由于本身带有一定 的电荷，在适宜的条件下，它们能与带相反电荷的某些物质通过静电引力、疏水 作用力和电荷转移形成缔合物微粒而产生强烈的共振散射效应。据此，可建立痕 量金属离子、酸根离子、表面活性剂共振散射光谱分析测定法。如c “) 、c r ( i i i ) 【7 7 】、l a ( ) 【7 8 l 、h g ( i i ) 【7 9 l 、c d ( i i ) 【8 0 - 8 1 1 、舢( ) 【8 2 1 、a g ( i ) 【8 3 】、p b ( i i ) 【8 4 1 、 m o ( v ) 【8 5 】、r h ( i i i ) 【鲫、p d ( i i ) 【8 7 】、a u ( ) 【跚、c u ( i i ) 【8 卅的共振散射光谱法。 文献凹1 基于金属离子z n 2 + 、p b 2 + 、c 0 2 + 、n i 2 + 、c d 2 + 、c u 2 + 、h 9 2 + 可与双硫腙反应 5 桂林工学院硕士学位论文 ( a s f ) 如十二烷基苯磺酸钠( s d b s ) 、十二烷基硫酸钠( s d s ) 和十二烷基磺酸钠 ( s l s ) 与乙基紫( e v ) 反应形成离子缔合物，可用于痕量a s f 的共振散射光谱测定 【9 1 1 。阳离子表面活性剂( c s ) 如氯化十六烷基二甲基苄铵( c d b a c ) 、氯化十四 烷基二甲基苄铵( z e p h ) 、溴化十六烷基吡啶( c p b ) 、溴化十四烷基吡啶( t p b ) 和十 六烷基三甲基溴化铵( c t m a b ) 与四苯硼钠( n a t p b ) 、a g l 2 。缔合微粒相互作用形 成离子缔合物，可用于c s 的共振散射光谱测定，结果满意f 9 2 羽j 。 1 1 2 5 共振散射光谱技术在液相纳米微粒研究中的应用 蒋治良研究组采用柠檬酸钠还原法，微波高压液相合成法以及光化学合成法 等方法制备了a u 、a 卧a 酏g c l 、a a - u 等液相纳米微粒并对其共振散射光谱进 行了研究。提出了液相纳米微粒的分频、和频、差频原理，解释了液相纳米微粒 的分频、倍频共振散射现象【9 4 例。在研究金纳米微粒的过程中，解释了金纳米粒 子的各种散射光谱，并对金纳米粒子的共振散射、2 3 分频共振散射和2 倍频共振 散射进行了分析，较好地解释了液相金纳米粒子产生的一些非线性散射现象【l o o l ， 建立了金原子团簇的共振散射光强度函数1 1 0 1 】。用超分子界面能带理论解释了金纳 米粒子的颜色与粒径关系，得出用柠檬酸钠还原法制备不同大小的胶体金，纳米 金的共振散射峰均在5 8 0 i u n 处，共振散射强度i r s s l 仔与粒径d 成正比【1 0 2 - 1 0 3 1 。给出 了共振散射光强度与九之间的高斯分布函数，建立了金纳米粒子的共振散射光强 度函数【1 0 4 】。同时，刘绍璞【1 0 5 】等也通过实验得出，当金纳米的浓度为一常数时，其 共振瑞利散射强度( i r s s ) ，二级散射强度( i s o s ) ，二倍频散射强度( i f d s ) 与金纳 米粒子的粒径成线性关系，当金纳米粒子的粒径一定时，( i r s s ) 、( i s o s ) 和( i f d s ) 与金纳米的浓度有直接的比例关系。 1 1 2 6 免疫共振散射光谱分析 抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体超变区中抗原结合点之间的结合， 由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，。所以抗原与抗体的结合具有高度 的特异性。抗体是球蛋白，大多数抗原亦为蛋白质，它们溶解在水中皆为亲水胶 体溶液，抗原抗体的结合使电荷减少或消失，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体 转化为疏水胶体i l 叫。由于免疫复合微粒和固液界面的形成，使得体系出现共振散 射效应，其共振散射强度随着抗原浓度的增加而呈线性增强，据此可建立定量测 定抗原的高选择性的免疫共振散射光谱分析新方法。为了进一步提高方法的灵敏 度，将纳米金和纳米银标记免疫反应、免疫金催化一增强反应与共振散射检测技 术有机地结合起来，建立了测定抗原的金标、银标免疫共振散射光谱分析新方法 6 桂林工学院硕士学位论文 表1 2 共振散射法在免疫分析中的应用 t a b l e 1 21 k 印p i i c a t i o no fr s 腓曲o df o rj m m u n o 卸龃l y s i s 7 桂林工学院硕士学位论文 1 2 金纳米微粒的制备、表征及其在生化分析中的应用 1 2 1 金纳米微粒的制备 1 2 1 1 化学还原法 氧化还原法制备金纳米粒子通常是在含a u ( ) 的溶液中加入还原剂( 如柠檬 酸、柠檬酸一鞣酸、胺、硼氢化钠、抗坏血酸、白磷、肼等) ，金离子被还原而聚 集成直径为几纳米到几十纳米不等的金颗粒1 1 1 8 1 ( 图1 ) 。1 8 5 7 年法拉第以磷为还原 剂，在溶液中加热还原【a u c 。制得金溶胶。1 9 51 年t u r k e v i t i 凼【1 1 9 l 最早引入柠檬酸 钠还原h a u c l 4 水溶液，获得粒径为2 0 o i l m 的胶体金。l9 7 3 年f r e l l s 【1 2 0 j 通过控制 柠檬酸钠与h a u c l 4 的比例获得1 6 1 4 7 i 珊不同粒径的金纳米微粒。可是这些方法 制备的纳米金颗粒分散性受到了一定的限制。由于纳米级颗粒存在有别于常规粒 子( 或颗粒) 的作用能，所以在制备过程中很容易团聚。解决的办法主要是增加颗 粒间的排斥力，添加一定的表面活性剂或加入巯基烷烃化合物、有机聚合物等保 护剂，控制粒子的尺寸、稳定金溶胶。张聪惠l l2 1 】等以p v p 为保护剂，抗坏血酸作 还原剂，较高浓度的氯金酸溶液为原料，制得球状、最大粒径为2 0 姗的金溶胶。 p r a t i 和r o s s i l l 2 2 ，1 2 3 】等利用了聚乙烯醇( p v a ) 、聚乙烯基吡咯烷酮( p v p ) 等聚合物作 保护剂，以n a b h 4 或水合肼等还原a u ( i i i ) 获取金胶体。w 锄g 等【1 2 4 1 在5 一苯硫基咔 唑存在的条件下，用n a b h 4 水溶液还原【a u c 。制得了金纳米微粒。k u n i t a l 【e 掣1 2 副 以水溶性的巯基配体( 3 一巯基丙酸钠) 为稳定剂，用柠檬酸钠还原h a u c l 4 制备金纳 米粒子，这种方法对洁净度要求不高，还原剂被分解为c 0 2 ，水溶液中的金纳米 微粒放置几个月也不会沉淀。s e l v a l ( 籼a l l 等【1 2 6 】以十六烷基苯胺为还原剂，一步合 成了疏水性金纳米粒子。d y k m a n 【1 2 7 】等用聚乙二醇等大分子为还原剂还原氯金酸制 备金溶胶。w 觚一1 2 8 1 在水溶液和n 甲基- 2 吡咯烷二酮( n m p ) 中用聚苯胺还原 h a u c l 4 制备纳米级的金颗粒，反应在n m p 溶液中发生时生成2 0 咖的金微粒； 反应在水溶液中发生时，吸附在聚苯胺颗粒表面上的金生成粉末状，当聚苯胺溶 解到n m p 中时生成5 0 2 0 0 嘲的金纳米粒子。e s u m i l l 2 9 】把水相中的氯金酸转移 到甲苯或氯仿中，用二甲胺硼烷还原a u ( i ) ，在甲苯或氯仿中制备出了2 4 咖的 金纳米粒子。 8 图1 1 纳米金微观结构示意图 f i g u 1 11 1 l cm i c r o s t n i c t u 他i m a g eo f 9 0 l d 咖o p a n i c l e s 1 2 1 2 晶种生长法 以事先合成的金纳米粒子为晶种，再用还原剂在晶种表面继续还原氯金酸使 粒子生长，通过调节晶种和氯金酸的比例控制产物的粒径。如付云芝f l3 0 】等在十六 烷基三甲基溴化胺( c t a b ) 存在的条件下，抗坏血酸作还原剂，制得边长为3 3 士2 衄 立方体金纳米颗粒。潘碧峰等以氯金酸( h a u c l 4 ) 为原料，以硼氢化钠( n 扭h 4 ) 为 还原剂，首先还原金离子( a u 3 + ) 得到直径为3 - 4 衄的金种子。以银离子( a 矿) 为辅 助离子，以十六烷基溴化铵( c t a b ) 为表面活性剂，以抗坏血酸为弱还原剂，加入金 种子溶液之后可以获得长径比为2 5 金纳米棒【1 3 1 1 。n a t a i l 【1 3 2 1 以1 2 咖的胶体金为晶 种，加入适量的氯金酸及羟胺，利用金纳米粒子表面的自催化反应使晶种逐渐长 大，控制条件可制得3 0 1 0 0 姗的金纳米粒子。朱梓华1 1 3 3 j 等以柠檬酸三钠还原氯 金酸，制得5 0 5 舳的纳米金颗粒，再以此为晶种，n h 2 0 h 还原氯金酸，制得 了近似球形、长短轴比范围为1 1 0 1 2 5 、粒径为6 0 1 6 0 n m 的单分散金纳米粒子 水溶胶。蒋治良f 】、纪小会等【1 3 5 】以金纳米粒子作晶种，通过化学还原的方法沉 积生长a g 包裹层，制备a l 矿a u 复合粒子。 1 2 1 3 微波合成法 微波是一种波长相当短的高频电磁波，频率很高，可引起离子及偶极分子极 化、旋转摩擦，而使能量发生转换形成热能。微波制备胶体金的原理正是由于分子 的高速度运动加快了还原的时间在单位体积的水溶液中，能量的吸收与作用的时 9 桂林工学院硕士学位论文 粒大小均匀一致，大大缩短了制备胶体金的时间，并使胶体金的制备过程达到了程 序化控翻，操作更简单、更方型1 3 们。以氯金酸为金属前体，以低级醇为溶剂及还 原剂，采用微波合成法，制备得到了p v p 稳定的纳米金胶体，制得的金胶体颗粒为 圆球形【1 3 7 1 。蒋治良等【1 3 8 】用微波法制备金纳米微粒：量取1 0 m l2 2 8 m g la u 3 + 溶液 置于8 0 m l 微波反应罐中，加入一定量1 o 柠檬酸钠，补充蒸馏水至1 0 m l ，扭紧罐 盖，混匀，再置于微波炉( 采用4 8 0 w ) 中辐照4 m i n ，取出冷却，可获得不同粒径的 金纳米粒子。覃爱苗【1 3 9 】等以聚丙烯酰胺作还原剂、分散剂和稳定剂，采用微波高 压液相合成法，制备了深红色、紫红色和蓝紫色的金纳米粒子，其粒径分别为8 3 、 3 0 、6 0 n m 。 1 2 1 4 光化学合成法 该方法具有简便、快速、反应易控制的特点。选择二甲基甲酰胺( d mf ) 为电 子捕获剂，以磷钼杂多酸作为光催化还原剂制备了粒径均匀、分散性好的纳米金 溶胶【1 删。t r o u p i s 和m 肌d a 【1 4 l - 1 蚓以硅钨或磷钨杂多酸为光催化还原剂在紫外光照 下制得纳米金或核壳纳米金溶胶。刘庆业等根据p e g 分子的空间位阻效应和表面活 性原理，分别加入6 2 ，6 0 0 ，10 0 0 ，40 0 0 ，60 0 0 ，1 00 0 0 分子量的乙二醇和p e g ， 采用光化学法成功合成了粒径分别为6 0 ，4 0 ，3 0 ，2 0 ，1 0 ，6 啪的单分散的金纳米 粒子水溶胶f h 3 1 。m a l l i c k i l 删利用紫外光照射技术制备金纳米粒子：首先以制得的 粒径较小的金纳米微粒作为晶种，再利用光活化技术制得2 0 8 0 衄的纳米金颗粒。 s a u 【1 4 5 】等先通过紫外光照射，改变稳定剂还原剂、金粒子和t x 1 0 0 的浓度比例， 制得5 2 0 衄的球状金纳米微粒，再以其为晶种，以抗坏血酸为还原剂，利用前 述光学技术，把新制备的金离子溶液还原到晶种的表面，得到了2 0 1 1 0 啪的纳 米金。p “】以光辐射含有十二烷基磺酸钠( s d s ) 、巴胺盐酸和氯金酸的混合溶液， 制备出了金纳米粒子，通过改变巴胺盐酸化合物的浓度可以制得不同粒径的金纳 米微粒。 1 2 1 5 反胶团法或微乳液法 反胶团是指表面活性剂溶解在有机溶剂中，当其浓度超过c m c ( 临界胶束浓度) 后形成亲水极性头朝内、疏水链朝外的液体结构。曾伟【1 47 】等将含有氯化金的强酸 性水溶液作为水相与确t o nx 1 0 0 、正己醇、正己烷组成反相微乳液体系，并以该微 乳液构成电极反相微乳液电极系统，利用电沉积方法成功地制备出纳米a u 镀层。 李中春【1 4 8 】在s d s c h 2 0 微乳液中可用v c 还原h a u c l 4 制备出粒径为5 2 0i u n 的 金纳米粒子。c h e n 等1 1 4 9 j 以c t a b 作为保护剂，在c t a b 一戊醇一正已烷一水微乳液中 制备了直径约7 啪单分散的球形金纳米晶溶胶。e s 啪i 【1 5 0 】在2 一乙烯基吡啶调聚物的 1 0 桂林工学院硕士学位论文 活性剂气