层析技术.ppt

层析技术介绍,一、层析技术的基本概念和特点,1、定义层析(又名色谱)一种利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异，使各组分在层析两相中以不同程度分配，借此将各组分分离。,任何层析都有两相：固定相与流动相，两相互不相溶,固定相由层析介质组成，它可以是固体物质也可以是固定在固体物质上的液体物质。这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解与交换作用，对分离混合物起着关键作用。,流动相指在层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一定方向移动的液体或气体。柱层析中的流动相一般称为洗脱剂。它也是层析中的重要影响因素之一。,流动相在推动固定相中的混合物朝一个方向移动是，由于混合物中各组分的理化性质（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等）的差异，各组分受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用各不相同，在层析柱中移动速度也不同，从而使混合物中结构上只有微小差异的组分分离开来。,2、析法的特点,(1)分辨力高(2)分析效率高(3)灵敏度高(4)应用广泛局限性：在定量分析中需要纯制得标准物质；不能精确地解决物质的化学结构问题,气相层析,液相层析,气-固气-液,液-固液-液,二.层析技术的分类,1.按流动相的形式不同,以气体作为流动相,以液体作为流动相,2.按层析的原理可分为,吸附层析分配层析凝胶层析亲和层析离子交换层析,3.按操作形式不同,柱层析平面层析:包括纸层析、薄层层析、薄膜层析等,三、常用的层析方法,1、凝胶层析2、离子交换层析3、亲和层析4、吸附层析5、分配层析,（一）凝胶层析,1、凝胶层析的原理凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗粒，颗粒内部不是实心的，而是三维多孔网状结构。在洗脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因其直径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速度。慢，比大分子物质后流出层析柱，分子大小不同的混合物因此得到分离。,固定相（凝胶）,三维空间网状结构,Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water,凝胶层析法：,分子筛效应：分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。,2.凝胶层析的介质,凝胶是一种多孔网状结构物质。层析用的凝胶一般都呈球形，颗粒的大小通常以目数来表示。层析的分辨率和流速与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般常用的是100200目。目前常用的有交联葡聚糖凝胶，交联琼脂糖凝胶，丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶以及Superdex,交联葡聚糖凝胶：是最传统的凝胶介质，由葡聚糖于3-氯-1,2环氧丙烷相互交联而成。交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。,葡聚糖凝胶1959年Porath和Flodin合成（商品名为Sephadex）结构：基本骨架：葡聚糖（dextran）交联剂：3-氯代-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构。,交联琼脂糖凝胶：商品名为SepharoseCL.琼脂糖为D-半乳糖和3,6（脱水）-L-半乳糖结合的链状多糖，经加热冷却后分子之间以氢键烦恼格式相互连接成线性的双链单环的琼脂糖凝胶。交联琼脂糖凝胶是由琼脂糖于1,3-二溴异丙醇交联而成的多孔网状结构。此类产品通常有Sepharose2B、Sepharose4B、Sepharose6B三种，分别代表含琼脂糖凝胶2%、4%、6%的凝胶。该凝胶具有良好的机械性能，分辨率高，分离范围广，广泛用于蛋白质的分离纯化和亲和层析的载体。,丙烯酰胺凝胶：商品名为Bio-gel.丙烯酰胺凝胶有丙烯酰胺与交联剂甲叉丙烯酰胺聚合而成，化学性质稳定，能耐受强去垢剂与变性剂的影响，流速快，分辨率高。丙烯酰胺凝胶商品型号有Bio-gelP-2到Bio-gelP-300，其阿拉伯数字表示排阻极限。Sephacryl凝胶：由丙烯酰基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺共聚生成的刚性凝胶，化学性质稳定，有良好的机械性能，可高温消毒，分辨率高，广泛用于蛋白质的分离与提纯。Superdex:一种由Phamarica公司生产的新型凝胶过滤介质，有高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成，是目前分辨率和选择性最高的凝胶过滤介质。其物理化学性质稳定，能耐受强去垢剂与变性剂的影响，可高温消毒，流速快，分辨率高。现有Superdex30Superdex75Superdex200三种型号。,3、洗脱凝胶层析所用的洗脱剂以能溶解被洗脱和不使其变性或失活为原则，除个别特殊情况外，一般都以单一缓冲液或盐溶液作为洗脱液。4、凝胶层析柱的再生与储存凝胶层析柱可反复使用，每次洗脱过程即是凝胶的再生过程。若使用过多次，由于凝胶床体积变小，流速降低或为污染杂质过多，可将凝胶倒处，用低浓度的酸或碱溶液处理后，重新装柱再行使用。使用过的凝胶层析柱，若要短时间储存，需洗涤出去蛋白质等杂质，并加入适当的防腐剂；若要长时间储存，则需用低浓度的酸或碱溶液短时间浸泡后，再用水反复洗涤除去杂质，浸泡在50%乙醇溶液中。,凝胶层析的优点1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。2.操作条件较温和。3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化。,凝胶层析的缺点1.要求样品和洗脱液的粘度很低。2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用。,凝胶层析的特点,（二）离子交换层析,1原理,离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离子型混合物的层析方法。,离子交换剂由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。离子交换剂的基质是一类具有特殊网状立体结构的聚合物颗粒，其物理化学性质稳定，不溶于水和许多有机溶剂。基质上交联有较多的酸性或碱性基团，这些酸性或碱性基团通过静电作用可结合带相反电荷的离子（反离子）。当流动相中存在带电荷的离子是，就可与先结合在离子交换剂上的反粒子进行可逆的交换。,根据可交换离子的性质，离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。,阳离子交换剂：交联酸性基团，能和流动相中的阳离子交换。例如：R-SO3-H+Na+R-SO3-Na+H+,胶体,胶体,阴离子交换剂：交联碱性基团，能和流动相中的阴离子交换R-N+(CH3)3OH-+Cl-R-N+(CH3)3Cl-+OH-,流动相中，不同离子化合物带电荷数量不同，与离子交换剂相互作用的强弱也不同。看可以通过提高流动相中的离子强度或改变pH值得方法，将结合在离子交换剂上的反离子从离子交换柱上一次洗脱下来，达到分离纯化的目的。,2.离子交换剂,通过化学方法将酸性或碱性基团交联在惰性基质上可获得离子交换剂。常用的基质有纤维素，葡聚糖凝胶，交联琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。根据交换基团酸碱性的强弱，阳离子交换剂又分为强酸型和弱酸型，阴离子交换剂又分为强碱型和弱碱型。在实际工作中，可根据被分离的物质的性质，选用适当类型的离子交换剂。分离碱性蛋白质常用阳离子交换剂，分离酸性蛋白质常用阴离子交换剂。分离蛋白质样品时一般常用弱型交换剂。,3.洗脱洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。,4离子交换剂的再生与储藏,使用过的离子交换剂必须再生后才能再次使用。通常用12mol/LNaCl溶液洗涤后才可再用，如有脂类污染则需0.1mol/LNaOH洗涤。阴离子交换剂储存在0.002%的洗必泰缓冲溶液中；阳离子交换剂储存0.005%的硫柳汞缓冲液中。,5离子交换层析的特点,样品处理量大，分离过程具有浓缩作用；分辨效率较高，所需柱长较短，可在较高流速下操作；吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收收率高。离子交换层析既可用于生物大分子物质的分离纯化，又可用于小分子物质的分离纯化，还可以用于硬水软化以及污水处理等方面。,（三）亲和层析,1、原理,亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。,吸附,2.亲和吸附剂,理想的载体应具有下列基本条件：不溶于水，但高度亲水；惰性物质，非特异性吸附少；具有相当量的化学基团可供活化；理化性质稳定；机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；能抵抗微生物和醇的作用。配体：为结合在载体上具有特异亲和力的一对分子中的任意一方。一般根据目标贩子与一些物质作用的亲和力和专一性的情况进行选择。,3.洗脱（1）非特异性洗脱：改变pH值、离子强度或缓冲溶液的组成来达到洗脱纯化的目的（2）特异性洗脱：用较高浓度的配体溶液可以将吸附着的生物大分子洗脱下来。对于那些吸附较牢的大分子，必须用较强的酸或碱作为洗脱液，或在洗脱液中添加尿素或盐酸胍等变性剂。,使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液彻底洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。但如果配体是蛋白质等一些易于变性的物质，则应注意处理时不能改变配体的活性。亲和吸附剂的储存一般是加入0.01%叠氮化钠或0.05%苯甲酸，在4下保存。注意不要使亲和吸附剂冷冻，因为冰晶会破坏吸附剂的结构。,4、亲和柱的再生及储存,5、亲和层析的特点,1、只需一步纯化步骤2、产物非常纯3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质4、还可去除已变性或部分降解物质,定义指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质的吸附力而使混合物分离的方法。,原理在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用物理作用的范德华吸附：无选择性，吸附速度快，吸附的过程是可逆的化学吸附：由原子价力的作用引起。有选择性，吸附速度较慢，不易解吸,（四)吸附层析,在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。,(五）分配层析,利用混合物在两种或两种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法。固定在载体上的液体称为固定相，用做洗脱得液体称为流动相。载体是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质，在分配层析中起支持固定相的作用。流动相采用比固定相极性小伙非极性的有机溶剂。,四.柱层析的基本装置和基本操作,1.柱层析的基本装置柱层析系统包括高位贮液瓶、层析柱、检测器、记录仪和部分收集器等。高位贮液瓶：储存洗脱液，提供液体流动的动力。层析柱：层析分离的核心，根据分离原理与需要可选择不同规格的层析柱。检测器：对洗脱流出的样品进行实时监控。实验室常用的检测器是紫外检测器。记录仪：实时记录检测器的检测结果。部分收集器：自动分部收集各组分。,2.柱层析的基本操作过程,柱层析的基本操作过程包括介质预处理、装柱、平衡、加样、洗脱、收集、鉴定、保存与再生等主要步骤。,（1）介质预处理,将层析用的介质（如凝胶、离子交换剂等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸、碱和盐溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质，然后用蒸馏水洗涤干净，真空抽气除去其内部的气泡。有些商品用层析介质不需要预处理。各种基质的预处理方法可参阅具体层析实验及有关文献。,（2）装柱,根据层析的基质和分离目的选择适当直径与长度的层析柱。离子交换柱与亲和层析柱的直径与长度比为1:101:20，凝胶层析柱的直径与长度比为1:501:100.层析柱装填的质量高低是柱层析能否成功分离纯化物质的关键因素之一。层析柱装填的基本要求是层析介质在柱中表面平整，分布均匀，不能有分层，更不能有气泡等。开始装柱前，层析柱必须保持垂直。柱内保留1/5柱高的缓冲液，柱管内和尼龙网底部不能有气泡。将预处理后的悬浮介质连续地倾入柱中，使之自然沉降35cm高。打开出水口，控制适当流速，使介质等均匀沉降，并不断加入悬浮介质。层析柱床高度根据层析的原理与目的而定，整个装柱过程中，溶液必须高于柱床表面，不能流干，否则必须重新装柱。,（3）平衡,层析柱装好后，用所需的平衡缓冲液洗柱。用高位贮存瓶在恒定压力下让平衡液从层析柱中流过。凝胶层析一般用35倍柱床体积的缓冲液平衡，离子交换层析需20倍以上柱体积的缓冲液平衡，以确保床体积稳定及介质缓冲液充分平衡。,（4）加样,让样品进入层析介质中。应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击介质，以保持介质表面平坦。加样量的多少直接影响到分离的效果。一般来讲，凝胶层析加样的体积少，分离效果比较好。若样品体积过大则会产生分离不完全的现象。通常凝胶层析加样的体积应为2%的床体积。对于分析型柱层析，加样量一般不超过床体积的1%。离子交换层析与亲和层析的上样量对样品没有特别要求，但一般不能超过其吸附量的4