（分析化学专业论文）芯片毛细管电泳分析生物样品的应用研究.pdf

浙江大学博士掌位论文 摘要 生命科学是本世纪前沿科学领域之，生命科学的发展离不开研究手段，特 别是是分离、分析、测试方法的创新。因此，生命分析化学已发展为当前分析化 学学科的前沿研究领域。 生物样品如d n a 和单细胞等的电泳分析是生命科学研究领域中的重要组成 部分。在靶向药物的研究、疾病的早期诊断和治疗中有广阔的应用前景。由于芯 片毛细管电泳在分析速度和分离效率上比传统毛细管电泳都有了数量级的提高， 样品和试剂消耗量仅仅只有p l 级，为生物样品的分析中提供了新的方法。 表面改性是提高芯片毛细管电泳分离生物大分子性能的关键技术。本文的目 的是建立玻璃芯片上长寿命、耐侵蚀的永久涂层的制作方法、用芯片毛细管电泳 分离和鉴定d n a 片段、并以谷胱甘肤( g s h ) 和活性氧( r o s ) 作为模型化合物，研 究在芯片毛细管电泳同时测定单细胞内二种不同标记物质的方法。 本文第一章综述了毛细管电泳微流控芯片的表面预处理和涂层技术、芯片 毛细管电泳分析d n a 片段和单细胞内容物的现状和发展。 第二章研究了在玻璃微流控芯片上制作长寿、耐蚀的永久性涂层方法。为了 提高涂层的成品率，首次提出了用罗丹明1 2 3 和荧光素钠的混合样的电泳迁移 时间来控制芯片徽通道预处理的效果，使不同来源、不同表面状态的芯片的在预 处理后硅羟基密度基本一致。进一步用甲醇和h c i 的混合液在高温下处理芯片， 提高了玻璃表面硅羟基的产率。通过使用聚合线性聚烯酰胺、单体、引发剂的混 合液充入硅烷化的微流控芯片中，制得了耐蚀、高寿命的涂层。在弱碱性条件下 浸泡一周也未发现涂层性能降低；对未除盐的p c r 产物也显示了抗侵蚀能力，在 此涂层进行了3 0 9 次d n a 分析，分析性能也未见下降。 第三章研究了微流控芯片上分析d n a 片段的各参数，重点对筛分介质浓度、 电场强度、分离距离等做了优化，在优化的条件下对p c r 扩增的单链抗体( s c f v ) 片段做了分析鉴定。大大提高了分析速度，提高了鉴定d n a 片段的准确度。 第四章首次将衍生剂n d a 加入电泳缓冲液，动态标记了单细胞中的谷胱甘 肽。通过液压结合低电场进样，提高单细胞的进样速度和长期稳定性。细胞溶 膜后g s h 在分离通道中移动0 5 c m 就能与电泳缓冲液中n d a 反应完全。分离效 率高达2 。4 x l o v 米，与脱线衍生无显著差异。细胞动态和脱线衍生时g s h 的迁 浙江大掌博士掌位论文 移时间分别为1 0 6 s 和l o o s 。本法节约了衍生试剂，简化了细胞的处理方法，提 高了分析速度。每小时可分析2 0 个单细胞。通过对放置不同时期的同一血样进 行分析和数据处理，得到红细胞中的g s h 的半衰期约为5 天。 第五章在微流控芯片上同时测定单个红细胞中的谷胱甘肽( g s h ) 和活性氧 ( r o s ) 。用双氢罗丹明1 2 3 ( d h r 一1 2 3 ) 标记r o s ，用n d a 在线标e g s h ，实现了微流控 芯片上单细胞进样、贴壁、溶膜、衍生、分离和测定的集成化。首次提出了可以 防止单细胞电泳时细胞从细胞样品槽漏入分离通道微流控芯片的网络结构：优化 了细胞样品槽的结构，防止了由于细胞沉积而引起细胞进样速度降低。r o s 和g s h 的检测限分别为0 5 和6 9a i i l o l ，单细胞分析的通量为2 5c e l i s h 。由于本文的 检测限比毛细管电泳分析细胞提取液低2 个数量级，首次同时测定了单细胞中的 g s h 和r o s 的含量，监测y g s h r o s 量在外部刺激下的变化情况。对于研究细胞内外 的通讯和过量自由基导致的氧化应激过程具有重要意义。此# 、g s h 和r o s 的含量测 定有助于检测和鉴定大量细胞中的少数不正常的细胞，在疾病的早期诊断中有应 用前景。 关键词：微流控芯片；涂层：d n a ：单细胞分析；g s h ；r o s 浙江大掌搏士学位论文 a b s t r a c t l l f es c i e n c ei st h eo n eo fs c i e n t i f i cf r o n t i e ri nt h i s c e n t u r y t h e d e v e l o p m e n to fi tc a l l sf o rt h ea d v a n c e da n a l y t i c a lm e t h o d sf o rs e p a r a t i o na n d d e t e c t i o no f b i o l o g i cs a m p l e s a c c o r d i n g l y ，l i f ea n a l y t i c a lc h e m i s t r yh a s b e c o m eo n eo ft h ei m p o r t a n tr e s e a r c ha r e ai na n a l y t i c a lc h e m i s t r y t h ee l e c t r o p h o r e t i ca n a l y s i so fb i o l o g i cs a m p l e s ，s u c ha sd n aa n ds i n g l e c e l l s ，i sa ni m p o r t a n tc o n s t i t u e n tp a r to fl i f es c i e n c e e f e c t r o p h o r e s i sh a s b e c o m eap r o m i s i n ga n dp o t e n t i a lt e c h n o l o g ya p p l i e dt om e d i c i n er e s e a r c h a n de a r l yd i a g n o s i so fr e l a t e dd i s e a s e s m i c r o c h i pc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( m c e ) h a se m e r g e da sa ni m p o r t a n tt o o lf o ra n a l y z i n gb i o m o l e c u l e sd u et o i t sh i g h e f f i c i e n c y 、h i g h t h r o u g h p u ta n dl e s ss a m p l ec o n s u m p t i o n s u r f a c em o d i f i c a t i o ni sak e yt e c h n o l o g yf o ri m p r o v i n gt h ep e r f o r m a n c eo f c es e p a r a t i o no fb i o l o g i cm a c r o m o l e c u l e s t h ea i m so ft h i sp a p e ra r e ：( 1 ) d e v e l o p m e n tf o ran e wp e r m a n e n tc o a t i n gm e t h o dw i t hl o n g e v i t ya n dg o o d r e s i s t a n c ef o rc es e p a r a t i o no fd n a p c rp r o d u c t sw i t hg l a s sm i c r o c h i p ( 2 ) i d e n t i f i c a t i o no fd n af r a g m e n t sa n dp c rp r o d u c t sw i t h c h i p b a s e d e l e c t r o p h o r e s i s ( 3 ) s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a n dr e d u c e dg l u t a t h i o n e ( g s h ) i nt h ei n d i v i d u a le n t h r o c y t ec e l l i nt h ef i r s tc h a p t e r , d i f f e r e n ta p p r o a c h e sa n dt e c h n i q u e sf o rs u r f a c e m o d i f i c a t i o no fc e m c e ，a n a l y s i so fd n af r a g m e n t sa n ds i n g l ec e l lw i t h c h i p b a s e dc ew e r es u m m a r i z e d i nt h es e c o n dc h a p t e r , an o v e la p p r o a c hf o rs u r f a c em o d i f i c a t i o no ng l a s s m c ew i t hl o n g e v i t ya n dg o o dr e s i s t a n c ew a sd e v e l o p e d i no r d e rt oi m p r o v e t h ec o a t i n gr e p r o d u c i b i l i t ya m o n gt h em i c r o c h i p s ，m i g r a t et i m e so fr h o d a m i n e 12 3 ( r h12 3 ) a n df l u o r e s c e i ns o d i u m ( f l u ) i ne l e c t r o p h e r o g r a m sw e r eu s e d f i r s tt i m ea ss t a n d a r dt oe v a l u a t et h ee f f e c t i v e n e s so fp r e t r e a t m e n t b yu s i n g t h i ss t a n d a r dt e s tp r o c e d u r e ，s i m i l a rd e n s i t yo fs i l a n o l so nt h ei n n e rs u r f a c eo f d i f f e r e n tm i c r o c h i p sw e r eo b t a i n e d d e n s i t yo fs i l a n o l sw a sf u r t h e ri n c r e a s e d b yt r e a t m e n tw i t hh c i ：m e t h a n o l ( 1 ：1 ) u n d e rh i g ht e m p e r a t u r e r o b u s t p o l y a c r y l a m i d ec o a t i n gw a sc o v a l e n t l yb o n d e dt ot h es i l y l a n i z e ds u r f a c eb y f i l l i n gt h em i x t u r eo fm o n o m e r , i n i t i a t o r sa n df o r m e dl i n e a rp o l y a c r y l a m i d ei n t o m i c r o c h a n n e l t h i sp r o c e d u r e p r o v i d e s ar e p r o d u c i b l e r e s i s t a n ts u r f a c e 浙江大掌博士掌位论文 c o a t i n g ，w h i c hs h o w e dg o o dr e s i s t a n c et op c rp r o d u c t sa n db u f f e rs o l u t i o n e v e na f t e r3 0 9a n a l y s i st h ea n a l y t i c a lp e d o r m a n c ed i dn o td e c r e a s e d i nt h et h i r dc h a p t e r , t h ec h i p b a s e de i e c l r o p h o r e s i sw a su s e df o rt h e s e p a r a t i o no f 中x 一1 7 4 h a e i i id n ar e s t r i c t i o nf r a g m e n t sa n df o ri d e n t i f i c a t i o n o ft h ed n af r a g m e n tf r o ml c 一1s c f vo nc o a t e dg l a s sm i c r o f l u i d i cc h i pw i t ht h e l o w - v i s c o s i t ys i e v i n g m a t r i xh p m c - 5 0 t h ee l e c t r o p h o r e t i cc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d c o m p a r e dw i t hg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t h ec h i p b a s e de l e c t r o p h o r e s i s p r o v i d e dar a p i d s e n s i t i v i t ym e t h o df o rd n aa n a l y s i sw i t hh i g h e rr e s o l u t i o n a n di e s ss a m p l ea n dr e g e n t sc o n s u m p t i o n i nt h ef o u r t hc h a p t e r , as i m p l em e t h o df o rt h ed e t e c t i o no fg l u t a t h i o n e ( g s h ) i ns i n g l eh u m a ne r y t h r o c y t ew a sd e v e l o p e du s i n go n - c h i pm o d e d y n a m i cl a b e l i n gb ya d d i n gt h e2 , 3 一n a p h t h a l e n e - d i c a r b o x a l d e h y d e ( n d a ) s i m p l y i n m i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i sb u f f e r b yu s i n g ac o m b i n a t i o no f h y d r o s t a t i cp r e s s u r ea n dl o we l e c t r i cf i e l d ，s i n g l ec e l ls a m p l i n gs p e e da n d l o n g t e r ms t a b i l i t y w e r ei m p r o v e d a f t e rl y s i n g t h er e a c t i o nb e t w e e nt h e r e l e a s e dg s ha n dn d ai n c l u d e di ne l e c t r o p h o r e s i sb u f f e rc a nb ec o m p l e t e d w i t h i nam i g r a t i n gd i s t a n c eo f05c mi nt h em i c r o c h i ps e p a r a t i o nc h a n n e l d u r i n ge l e c t r o p h o r e s i s t h ea v e r a g es e p a r a t i o ne f f i c i e n c yf o rg s hw a s2 4 10 5 p l a t e s m w h i c hw a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ef r o mo f f - c h i pd e r i v a t i z a t i o n t h eg s hm i g r a t i o nt i m e so nt h eo n c h i pm o d ea n do f f - c h i pm e t h o dw e r e116s a n d110s r e s p e c t i v e l y t h ep r e s e n tm e t h o dc a nm i n i m i z et h ed i l u t i o no ft h e c o n t e n t so fs i n g l ec e l ld u r i n gd e r i v a t i z a t i o nt om a i n t a i nf a v o r a b l ek i n e t i c sf o r t h el a b e l i n gr e a c t i o n ，s i m p l i f yt h ec e l lt r e a t m e n ta n ds a v et h es a m p l ea n d r e a g e n t ah a l fl i f eo f 5d a y so fg s hi nh u m a ne r y t h r o c y t ew a sf o u n du s i n gt h i s m e t h o d i nt h ef i f t hc h a p t e r ，am i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i sm e t h o dw a sd e v e l o p e df o r s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a n dr e d u c e d g l u t a t h i o n e ( g s h ) i nt h e i n d i v i d u a l e r y t h r o c y t e c e l l i nt h i sm e t h o d ，c e l l s a m p l i n g ，s i n g l e c e l l l o a d i n g ，d o c k i n g ，l y s i n g a n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o nw i t hl a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e ( l i f ) d e t e c t i o nw e r ei n t e g r a t e do n am i c r o f l u i d i c c h i p w i t hc r o s s e dc h a n n e l s r o sw a si a b e l e dw i t h d i h y d r o r h o d a m i n e1 2 3 ( d h r 一1 2 3 ) i nt h ei n t a c tc e l l ，w h i l eg s hw a so n c h i p 浙江大掌博士掌位论文 l a b e l e dw i t h2 ，3 一n a p h t h a l e n e d c a r b o a i d e h y d e ( n d a ) ，w h i c hw a si n c l u d e di n t h es e p a r a t i o nm e d i u m o n c h i pe l e c t r i c a l - l y s i s ，c h a r a c t e r i z e db ye x t r e m e l y f a s td i s r u p t i o no ft h ec e l l u l a rm e m b r a n e ( 4 0m s ) w a se x p l o i t e dt om i n i m i z e e n z y m a t i ce f f e c t so na n a l y t ec o n c e n t r a t i o n sd u r i n gt h ed e t e r m i n a t i o n t h e m i c r o f l u i d i cn e t w o r kw a so p t i m i z e dt op r e v e n tc e l l l e a k i n gf r o mt h es a m p l e r e s e r v o i ri n t os e p a r a t i o nd u r i n gt h es e p a r a t i o np h a s e t h es t r u c t u r eo ft h e s a m p l er e s e r v o i rw a sm o d i f i e dt oa v o i db l o c k a g eo fi t so u t l e tb yd e p o s i t e dc e l l s d e t e c t i o nl i m i t so f0 5a n d6 9a m o lf o rr o sa n dg s h 。r e s p e c t i v e l y ，w e r e a c h i e v e d t h ea v e r a g ec e l lt h r o u g h p u tw a s2 5c e l l sh t h ee f f e c t i v e n e s so f t h em e t h o dw a sd e m o n s t r a t e di nt h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fg s ha n d r o si ni n d i v i d u a ic e l l sa n dt h ev a r i a t i o n so fc e l l u l a rg s ha n dr o sc o n t e n t si n r e s p o n s et oe x t e r n a ls t i m u l i k e yw o r d s ：c h i p b a s e de l e c t r o p h o r e s i s ：c o a t i n g s ：d n a ：a n a l y s i so fs i n g l e c e l l s ：r o s ：g s h 浙江大学博士掌位论文 第一章文献综述 1 1 引言 生命科学是本世纪前沿科学领域之，生命科学的发展离不开研究手段，特 别是是分离、分析、测试方法的创新。而分析方法的发展也促进了生命科学向更 高、更深入的层次发展。随着生命科学的蓬勃发展，生命分析化学，即用现代分 离、分析手段获得生命体中有关化学信息和生命体各种作用问的联系这样一个学 科领域也得到迅速发展“。 生物样品如d n a 、细胞和蛋白等的电泳分析是生命科学研究领域中的重要组 成部分。电泳分析技术的发展对疾病诊断、药物筛选、基因突变分析、核苷多态 性分析、人类基因组、蛋白组分析有重要意义。目前此项技术正朝着超微量、高 速度、高效率、微型化等方向发展，这对作为检测手段的分析科学的发展提出更 高的要求。 二十世纪9 0 年代初，瑞士的m a n z 和 | | i d m e r 提出了以微机电加工技术为基础的 “微型全分析系统”( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s iss y s t e m s ，简称ut a s ) 。1 。 其目的是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度她把分析实验室的功能 转移到便携的分析设备中，甚至集成到方寸大小的芯片上。由于这种特征，本 领域的一个更为通俗的名称“芯片实验室”( l a b o n a c h i p ) 已经被日益广泛地 接受，而微流控芯片分析已成1 2 t a s 当前的发展前沿。m a n z 与h a r r i s o n 于1 9 9 2 年发表了其首篇在微加工芯片上完成的毛细管电泳分离的论文，展示了它的发展 潜力。“。1 9 9 5 年美国加州大学b e r k l e y 分校的m a t h i e s 等人在微流控芯片上实 现了高速d n a 钡, i 序“1 ，微流控芯片的商业开发价值丌始显现。1 9 9 9 年惠普公司与 c a l i p e r 联合研制出首台微流控芯片商品化仪器，现已可提供用于核酸及蛋白 质分析和细胞分析的7 8 种芯片。在短短的十余年中，出于芯片毛细管电泳与传统 毛细管电泳相比较，在分析速度和分离效率上都有了数量级的提高，且样品消耗 量仅仅只有p l 级，所以一出现就大量应用到生物样品分析中。已发展为当前世界 上最前沿的科技领域之一，成为新的具有巨大潜力的化学生物学研究手段。 本章主要综述芯片上涂层的制作、芯片上毛细管电泳单细胞分析和芯片毛细 折江大学博士掌位论文 管电泳d n a 分析的有关文献。 1 2 芯片上涂层的制作 电泳微流控芯片经常被看成毛细管电泳微型化的版本，一些经典的方法和应 用很容易的由毛细管电泳向微流控芯片上移植，芯片通道表面改性也不例外。众 所周知，合适的芯片涂层后可以有效的改善电泳分离的重现性和分离性能，改性 的目的主要有如下两种：( j ) 减少和消除电渗流( e o f ) ”“；( 2 ) 减少分析物质 和毛细管内壁的吸附作用，改善分析的重现性“1 。其中亲水性的非离子型的聚 合物涂层例如聚丙烯酰肢( p a a ) 和聚丙烯醇( p v a ) 得到广泛的使用。 微流控芯片和毛细管的表面涂层主要分二大类；( i ) 动态涂层( 物理吸附型) ， 涂层物质动态与管道内壁产生强烈的吸附作用，抑制了e o f 的产生并与分析物竞 争吸附从而减少分析物的现象。( 2 ) 永久涂层( 共价型) ，主要是涂层物质与管 道内壁共价键合，从根本上屏蔽活跃的硅羟基，从而抑制电渗流和吸附现象。 共价键合的永久性涂层能消除毛细管的电渗流和吸附，得到良好的分离效果和电 泳峰形，动态涂层由于稳定性差，在电泳过程中需要再生，所以在电泳缓冲液中 必须添加涂层再生液。在质谱应用越来越广的今天，毛细管电泳与质谱联用的技 术也得到很大的发展。在质谱和毛细管电泳微流控芯片联用时，动念涂层毛细 管微流控芯片的运行缓冲液中添加的聚合物分子或它小分子会使质谱的结果复 杂化，从而减少了动态涂层在生物分析中的应用范围。从分析效果来看动态涂 层一般也不如永久涂层。 1 2 1 表面预处理 毛细管的表面羟基化对于表面改性来说是非常重要。玻璃材料表面的有效 的预处理是产生一个好的动态涂层或永久涂层的日i 提条件。尽管毛细管( 石英材 料) 和微流控芯片( 玻璃材料) 在表面化学上有一定的差异，但是大部分的毛细 管的处理办法还是移植到微流控芯片当中。 h j e r t n 和k u b o “”发现商品化的石英毛细管的来源对毛细管中的涂层的质 量产生很大影响，不同厂家和同一厂家不同批次生产的石英毛细管的表面结构都 存在一定的差异。这些差异可以通过测量毛细管的电渗流( e o f ) “、表面扫描 浙大掌博士掌位论o - k 电镜。“。来确证。一些其他的研究者还发现毛细管的储存时间长也会改变毛细管的 表面性质“。 为了清洗毛细管微流控芯片的通道表面并使表面羟基化，不同的研究者采 用不同的策略。其中最常用的方法是用1 m k o h 蚀刻l 小时3 ，0 t m n a o h 蚀刻3 0 分钟”“，1 m n a o h 蚀刻3 0 分钟。7 “、1 小时。其他表面预处理的方法还有很多， 如1 5 0 下使用3 ：7 的水和硫酸处理表面l 0 分钟i 、3 0 分钟5 f on a o h 清洗之后 用铬酸处理( 温度为5 0 。c ) “、1 2 小时。“或者1 6 0 小时浸泡在水中”“、沸腾的 氨水、双氧水、水( 1 ： ：5 ，r g a ) 混合物的2 0 分钟处理都已报道。有人认为 n a o h 是一种很强烈的蚀刻剂，使用后会增加表面的粗糙度，然后另一些研究者 则发现1 2 mn a o h 不会增加玻璃的粗糙度，而会增加石英的粗糙度。3 7 的h c l 被发现无论处理玻璃还是石英效果都很差，认为这种处理法增加了表面的粗糙度 ”1 。而1 0 分钟的r c a 溶液处理则不会增加表面粗糙度“。c if u e n t e s 等系统研 究了石英毛细管在不同的预处理下对丙烯酰胺涂层性能的影响。使用稀酸淋洗提 高毛细管表面的重现性，可能的机理是稀酸能除去毛细管材料中的金属杂质，在 7 0 。c 下使用0 1 mh c i 处理毛细管l 小时后提高了不同毛细管电渗流的重现性。“。 1 。2 2 物理吸附涂层 聚合物物理吸附在微通道壁上形成抑制电渗流和抑制分析物吸附的涂层，这 样的涂层被称为吸附涂层或者动态涂层。动态涂层的好处是：( 1 ) 涂层形成过程 简单；( 2 ) 涂层可以进行再生：( 3 ) 不依赖表面硅羟基化学修饰过程。这些吸附 的聚合物涂层可能是中性的或者是带电荷的。动态涂层包括聚合物存在运行缓冲 液中的动态吸附涂层、运行缓冲液中不含聚合物的吸附涂层和再生涂层( 酸洗、 碱洗之后通过聚合物溶液重新吸附表面丽形成的涂层) 。理想的吸附涂层不需要 聚合物存在运行缓冲液中，能够简单地“再生”。即能够容易地从表面除去，重 新形成一层新鲜的聚合物吸附层。以下p a , , f i 同的聚合物分类综述之。 1 2 2 1 聚二甲基丙烯酰胺( p d m a ) h e l i e r 。”1 等比较了几种聚合物后发现p d m a 拥有最低的粘度和强的分辨能力， 吸附涂层再生也很十分便捷。他们研究了p d m a 的浓度、分子量和施加的电场强度 浙江大掌博士学位论文 l ； 二 ； 誊； 二 ； i o - i - 。 ：i 臣垂囹 ll iill至 浙江大掌博士学位 争文 率达到1 0 i 塔板数米。”1 。5 的p d m a 也在3 8 4 个通道的阵列芯片中作为物理吸附涂 层的聚合物，进行高通量的基因分析“。 1 2 2 2 聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) g a o “”等发现p v p 具有低的粘度，4 5 的水溶液的粘度仅仅为2 7 c p ，而且育 很好的抑制电渗流形成动态涂层的能力，涂层再生简单有效，在基因诊断中，可 以基线分离d n a 片段。高分子量的p y p 用于了0 n a 测序，直到5 0 0 b p 还具有良好 的分辨率。s o n g “等使用p v p 进行m 1 3 m p l 8 和p g e m ud n a 测序，3 3 3 b p 长度的 片段和3 15 b p 长度的片段测序的正确率分别达到9 9 3 和9 9 。r o n a i “”等将 p v p 应用到玻璃微流控芯片电泳中，使用p v p 既作为筛分介质，又动态修饰通道， 抑制电渗流，在3 c m 的有效分离距离下，基线分离了l o o b p 尺标的标准d n a 片 段。研究者还优化了p v p 的浓度和一些电泳参数。由l p k 和p v p 的共聚物“、p d 触& 和p v p 形成的共聚物“”也应用到双链d n a 分析中，这些共聚物很好的抑制电渗流 的效果，在未做化学修饰的毛细管成功得分离了d n a 样品。 1 2 2 3 聚乙烯基氧化物( p e o ) p e o 与毛细管壁有强烈的吸附作用而具有动态涂层能力”，p e o 在使用前需要 使用h c i 对通道进行淋洗增强它的动态涂层能力，在p h 7 的情况下，可以抑制降低 未处理的毛细管的电渗流一个数量级。但2 4 , 时后需要再度用h c i 淋洗“”，酸性条 件可以增强p e o 的吸附能力。 1 2 2 4 纤维素衍生物 羟乙基纤维素( h e c ) 是纤维素衍生物的一种，分子结构上仍有大量的残留羟 基，t i a n ”等在未化学修饰的毛细管微流控芯片上使用h e c 作为动态吸附涂层， 与p d m a 、p e o 形成的动念涂层和使用p v p 化学改性后的涂层做了比较，电泳图见 f i g 1 2 。 浙江大学博士掌位论文 f i g 卜2h e c 、p d m a 、p e o 、l p a 分别作为筛分介质的d n a 电泳图 其中a 是c h l o r o d i m e t h y l o c t y l s i l a n e ( o c t ) 一p v p 的永久涂层上使用h e c 作为 筛分介质，b 是未涂层的毛细管使用h e c 既做筛分介质又做动态涂层，c 是p e o 作为 筛分介质和动态涂层，d 是p d m a 作为筛分介质和动态涂层，e 是l p a 作为筛分介质， 使用p v p 的永久涂层。其中h e c 作为动态涂层的效果比得上p d m a ，而作为筛分介质 对d n a 片段的筛分能力更好。毛细管上h e c 物理吸附涂层的寿命大于4 0 次，在微流 控芯片上大于9 0 次。但是h e c 的动态涂层能力与毛细管微流控芯片的预处理有很 大关系，s a n d e r s 。”认为h e c 应用做动态涂层时，微流控芯片表面应由o i i h c 淋 洗i 个小时，才能获得类j g t i a n 的分析结果( 见f i g ，l3 a ) 。为了减少芯片预处 理的工作量，s a n d e r s 等使用羟丙基纤维素( h y d r o x y p r o p y lc e ll u l e s e ，h p c ) 替代 h e c ，使用m e s t r i s 缓冲体系代替常用的t b e 缓冲体系，应用：至f j d n a 的分析当中。 h p c 也体现了强烈形成动念涂层抑制电渗流的能力，与t i a n 的工作不同的是，使 用m e s t r i s 作为缓冲体系，在电泳前的h c l 的淋洗是不需要的( 见f i g 卜3 b ) 。 酱江大掌博士掌位论文 r h e f s e = l f i g 1 3 ( a ) 25 h e c 作为筛分介质，使用h c i 淋洗前后的d n a 泳图( b ) 使用 m e s t r i s 缓冲体系，2 5 h e c d 3 5 h p c 分别作为筛分介质的d n a 电泳图 1 2 3 永久涂层( 化学改性) 最普遍使用的也是最有效的抑制电渗流和防止被分析的生物大分子吸附的 方法是在微流控芯片毛细管上共价键合上一层聚合物涂层。化学改性过程主要 分两步：一表面硅烷化( 形成硅烷分子层) ；二表面聚合反应。 表面硅烷化是将表面的s i o h 结合上不带电的硅烷试剂，使表面带电萄的基 团大大减少，从而降低了表面的e 电势，抑制了电渗流的产生。表面聚合反应是 通过将聚合物健合在硅烷层上，表面附近因为聚合物的存在，粘度增加，分析物 很难接触被“遮蔽”的表面，因此分析物的吸附也得到很大的抑制。 1 2 3 1 表面脱水 硅烷化反应中需要水的量目前还有一些争议。形成单分子硅烷层需要微量的 水，但是过量的水的存在，无论水存在在硅烷化试剂的溶剂中还是毛细管表面， 浙江大掌博女掌m 坨。x 将使硅烷试剂接触不到毛细管表面而与水层形成硅烷衍生物，这是十分有害的。 一些研究者发现如果不控制预处理后毛细管表面的物理吸附水的量，在稍后 的聚合过程中将形成薄的、不重现和不规则的表面聚合物层”。因此，微通道表 面预处理后进行一定程度的脱水是必要的步骤。但是通过加热对表面进行热处理 又将会导致硅氧桥键的形成，减少表面活性的硅羟基数量”“”3 。 为了控制硅烷化反应中需要水量，研究者们将微量的水加在干燥的有机溶剂 中。一些文献报道如下，1 5 m g 水添加到1 0 0m l 甲苯中”，6 x 1 0 。3m 的水混在c c i 。”“， 或者2 滴水添加到c c l i s o p a rg 中“5 1 “3 ：另一种控制水量的办法是将干燥的表面 暴露在可控的湿度环境中，完成表面的水合化。f a i r b a n k 和w i r t h ”7 1 等发现5 0 的湿度下存放几个小时可以使表面达到1 3h 。o 分子n m ，为三氯硅烷的反应提供 了充分的预先水合。如果使用的湿度为3 0 ，能在表面产生4 2 h 。0 分子n m ，适用 于用一氯硅烷进行硅烷化。t u n r o 。1 等将毛细管微流控芯片暴露在5 0 的湿度下 进行水合，以获得最优化的硅烷化效果。c i f u e n t e s ”“提出在加热温度在1 2 0 1 6 0 之间，既能除去一些物理吸附水，又不会形成过多的硅氧桥键。 1 2 3 2 表面硅烷化 硅烷化反应与表面性质和硅烷化试剂本身有关，表面性质的影响在前章节有 所论述，这节我们主要总结硅烷化试剂本身以及溶剂的选择和优化。 早期硅烷化试剂的溶剂都是以水溶液为主，醋酸是一种常用的溶剂它对硅 烷化反应有催化作用。但是硅烷化试剂溶解于水的过程实质是硅烷化试剂水解的 过程，我们在前一章节也讲过，过量的水对硅烷化反应是有害。因此离子化的溶 剂不适合作为硅烷化试剂的溶剂”。 有机溶剂可以从表面抽提过量的物理吸附水”，有助于硅烷试剂产生单分子 层”“。c g o v e r n ”等发现苯和甲苯是比较适合硅烷化反应的溶剂，它们都具有很 强抽取物理吸附水的能力，s i b e r z a n # e 道四氯化碳”是非极性物质，不会形成 氢键吸附表面等优点，可以提高硅烷化试剂的覆盖度。c i f u e n t e s ”“发现不用溶 剂直接使用硅烷试剂硅烷化表面，能够把电渗流抑制得更低。 不同的研究者使用的硅烷化反应时间和温度在变化很大。反应时间有1 5 分 浙大掌博士学位论文 钟1 、3 0 分钟| “_ 、i 0 0 分钟脚3 、l 小时：。3 、和1 8 4 , 时阿3 等等。大部分 硅烷化反应时间都小于2 , 5 时。c i f u e n t e s 研究了温度对7 一o c t 一卜e n y l t r i m e t h o x y s i l a n e 反应的影响，测试了2 5 、4 0 、6 0 、8 0 。c 下硅烷化反应的结果，发现温 度对硅烷化后的毛细管表面无显著差异。 硅烷试剂本身对硅烷化反应也有很大影响，h j e r t 6 n ”最先引入y m e t h a c r y l o x yp r o p y lt r i m e t h t h o x ys il a n e ( y m a p s ) 双功能团的硅烷化试剂，这 种硅烷化试剂的硅基团与表面硅羟基反应，其另一端的双键用来与单体原位共 聚，从而在表面形成聚合物层。y 姒p s 是一种最常使用的硅烷试剂“。“”。但 由于y m a p s 分子中存在脂键，脂键容易水解的特性限制了涂层的稳定性，h u a n g “”等利用分子结构中不存在易水解的脂键的7 一o c t 一卜e n y l t r i m e t h o x y s i l a n e 替代y m a p s 用来与丙烯酰胺单体共聚，聚合发生在二氯甲烷中。三氯硅烷试剂 在加热到1 5 0 下可以促进硅烷试剂间的交联1 ，而单氯硅烷则不会产生这个现 象，单氯硅烷与硅羟基反应的产率比多氯硅烷高，对电渗流的抑制能力更强。 h u a n g 。”等测定了不同链长度的脂肪烃硅烷抑制电渗流的能力，发现烃基链 越长，对电渗流的抑制能力越强，c 3 的烷基硅烷能抑帝r j 2 4 的电渗流，而c 8 的硅 烷能抑制6 5 的电渗流，此外，c1 和c 8 的硅烷混合使用的效果b e , c 3 , n c 8 的混合效 果要好，这可能是因为c 8 硅烷反应后留下的空隙空间比较小，只能用较小的c 1 硅烷去填补，而c 3 硅烷因为空间位阻的问题而不起作用。 j o r g e n s o n 和l u k a c s ”借用液相色谱的方法使用3 一g l y c i d o x y p r o p y l t r m e t h o x y s i l a n