（植物学专业论文）长春花萜类吲哚生物碱合成途径中关键酶基因的克隆、表达.pdf

摘要 本文以长春花( c a t h a r a m h u sr o s e l d $ m k i d o r l ) 植物幼苗为材料，利用c r a t e w a y 克隆技 术对其萜类吲哚生物碱( t e r p e n ei n d o l ea l k a l o i d s ，t i a s ) 生物合成途径中编码关键酶的基因 进行大规模克隆，获得相关基因的入门克隆和表达克隆，制备相应的抗体。并对这些基因的 m r n a 表达水平进行检测。所得结果如下： 1 以长春花植物幼苗中提取的总r n a 为模板，反转录生成c d n a ，经两步g a t e w a y - p c r 法获得长春花1 i a s 类化合物生物合成途径中编码关键酶d x s 、d x r 、g 1 0 h 、s l s 、 t d c 、s t r 和d a t 的目的基因( d r s 、a k r 、o h 、d s 、t d c 、s i r 和d a t ) 的全长序列。 2 利用g a t e w a y 克隆技术通过b p 重组反应将目的基因插入到入门载体( p d o n r 2 0 1 ) 中，构建目的基因的入门质粒，筛选出阳性克隆并通过测序验证。 3 通过l r 重组反应将目的基因从入门载体上转移到表达载体( p e t g l 0 a 2 0 a 3 0 a ) ， 导入大肠杆菌表达菌株b l 2 1 ( d e 3 ) 的感受态细胞中。通过异丙基9n 硫代半乳糖苷 ( i p t g ) 诱导表达，经s d s - p a g e 检测，表明重组的分别含有踟、s l s 、s i r 和g l o h 基因的 表达质粒的大肠杆菌菌株均有目的蛋白的表达。 4 利用n i 砸d 树脂分别对表达量较高的d x r 、s l s 和s t r 融合m s 标签的蛋白进行 纯化，纯化后的蛋白经s d s - p a g e 检测没有杂带，用b r a d - f o r d 法对纯化后的蛋白进行定 量，结果表明所得蛋白已达到制备抗体的要求，目前抗体制备正在进行中。 5 对这些基因在长春花幼苗中m r n a 表达水平的n o r t h e r n 杂交实验显示d x r 、幽、s i r 和t d c 基因在根、茎、叶、花和果实中均有表达，并且从总体上看根和幼叶中的表达量相对 高些，老叶中的表达量相对低一些；但是没有检测到目的基因o h 、如和d a t 相应的 m r n a 杂交信号，原因可能是与所选的植物材料的生长阶段和生长环境有关。 关键词长春花；萜类吲哚生物碱：g a t e w a y 克隆技术：5 - 磷酸脱氧木酮糖还原异构酶；次 番木鳖苷合成酶；栊牛儿醇一1 0 羟化酶；异胡豆苷合成酶 a b s t r a c t n l i s 喊sp e r f o r m e dal a r g es c a l eo fc l o n i n gf o rg e n e se n c o d i n gk e ye n z y r f l e si nt e r p e n e i n d o l ea l k a l o i d s ( t i a s ) p a t h w a yf r o mc a t h a r a n t h u sr o s e - l 岱皿) g d o n v i ag a t e w a yt e c h n o l o g y t h e s eg e n e s m r n ae x p r e s s i o nl e v e l si nct l o s e u ss e e d l i n g sw e r ea l s od e t e c t e d 1 1 地r e s u l t sa r c 越 f o l l o w s ： 1 n ef u l ll e n g t hs e q u e n c e so f d r s ，d r r , g l o h ，s l s , t d c ，s o a n dd a tw h i c he n c o d e dk e ye n z y m e s i n v o l v e di nt e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d sf r l a s lb i o s y n t h e s i sp a t h w a y 、】l 眦o b t a i n e dv i at w o - s t e p g a t e w a yp c rm e t h o d w i t l lt h et r a n s c r i p t e de d n af r o mt o t a lr n ao fc a t h a r a n t h u sg o s e l , l s s e e d l i n g sa st e m p l a t e s 2 a f t e rp c ra m p l i f i c a t i o n , t h e s ea t t b f l a n k e dd n a f r a g m e n t sw c l ei n s e r t e di n t oa t t p c o n t a i n i n gd o n o rv e c t o r ( p d o n r 2 0 1 ) b yb pe l o n a s et og e n e r a t ee n u yc l o n e s , r e s p e c t i v e l y p o s i t i v e c l o n e sw e 陀s c r e e n e df i r s tb yc o l o n ye r a c k i n e p c ra n dr e s t r i c t i o ne n z y m ea n a l y s i s a n dt h e nt h e s e i n s e r t e dg e n e sw e r ec o n f i r m e db yg e n es e q u e n c i n g 3 i n0 r d 盯t og e tp r o k a r y o t i ee x p r e s s i o ns y s t e m s , o r f so fa k r , o h ，s sa n ds t h a v eb e e n l r a n s f e l r e dt ot t l e i rd e s t i n a t i o nv e c t o r s ：p e t g i o a , p e t g 2 0 aa n dp e t g 3 0 a , a n db e e nt r a n s f o r m e d i n t oc o m p e t e n tc e l l so fe c l o ih o s ts 嘣nb l 2 1 ( d e 3 ) s d s p a g ea n a l y s i sr e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h o s er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nc l o n e sw h i c he n c o d e de n z y m e so fd x r , s l sa n ds t rw o v e r e x p r e s s e da l t e ri p t gi n d u c t i o n 4 f u s i o np r o t e i n sd x r - h i s ，d x r - h i s h ad x r - i - i s 乇s t s l s h i sa n ds 豫- sw e l e p u r i f i e db yn i - t e dr e s i n a e c o r c l i n gt ot h er e s u l t so fs d s - p a g ea n db r a d f o r d , t h e s ep u r i f i e d p r o t e i n sw e r eq u a 蛳e df o r a n t i s e r ap r e p a r a t i o n 5 n o r t h e r nb l o tr e s u l t sd i s p l a y e dt h a tt r a n s c d p tl e v e l so f & r , s s , s t ra n dt d ci nr o o t , s t e m , l e a v e , f l o w e ra n df r u i tf r o mcr o s c u $ w e r ed e t e c t e d , i ng e n e r a lt h eu a n s c r i p tl e v e l si nr o o ta n dy o u n gl e a v e w o l f eh i g h e rt h a ni n0 1 h e rl i s s u e s b u tt h e r e r en os i g n a l sf o rn o r t h e r nb l o to f g l o h a k sa n dd a t f o r er e a s o n m a y b e t h a t t h e r e r e n o m r n a u a m e r i p t s i n t h es e e d l i n gs t a g e w e c h o s e d f o r t h e s e g e n e s , o rm a y b e t h e y r ei n c l i n e dt ob eu n d e rs t r i c tp o s t - w a n s e r i p t i o n a lr c g u l a l j o n k e y w o r d sc a t h a r a n t h u sr o s e u s ；t e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d s ( t i a s ) ；g a t e w a yc l o n et e c h n o l o g y ；a x r , s s ；g l o h ；s o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 喊果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盔i 垦鲞些盘堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一f 可工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位硷文作者签名：签字日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘韭盎些盘堂 有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权壅韭盐些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 韩礴 签字日期：卅年月腾日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 翩魏勘阅i1 签字日期：绯石月f 阳 电话： 邮编： 1 绪论 1 绪论 1 1 长春花及其萜类吲哚生物碱研究概况 萜类吲哚生物碱( t e r p e n ei n d o l ea l k a l o i d s , t i a s ) 是植物次生代谢产物中含有萜环和吲 哚骨架的一类重要的生物碱类化合物。它包含2 0 0 0 多种结构已确定的化合物峨高等植物长 春花体内的1 1 a s 类化合物是植物天然产物的代表，这些化合物很多是有效的抗癌、抗疟疾 和抗心律失常药1 2 , 4 l 。 长春花( c a t h a r a m h u sr o s e l l $ ( l ) g d o r l ) 隶属于夹竹桃科( a p o c y n a c e a e ) 长春花属 ( c a t h a r a n t h u s ) ，是一种重要的药用植物。长春花体内含有1 3 0 多种生物碱，多数具有生物 活性? 。到目前为止，还没有发现哪一种植物能够像长春花一样在体内合成种类如此繁多的 生物碱嘲。长春碱( v i n b l a s t i n e ) 和长春新碱( v i n c r i s f i n e ) 是长春花中应用最广泛的二聚萜 类吲哚生物碱，它们的硫酸盐已经广泛应用于临床，是目前国际上应用最广泛的天然植物抗 癌药物之一。硫酸长春碱，英文名称x r m b l a s 妇s u l f a t e ，主要适用于治疗霍其金病 ( h o d g l d n sd i s e a s e ) 及绒毛膜上皮癌，亦用于治疗急性白血病、恶性黑色素瘤、卵巢癌、 睾丸癌与乳腺癌等症。硫酸长春新碱，英文名称n c r i s t i r 圮s u l f a t e ，别名硫酸醛基长春碱、 硫酸长春醛碱，主要适用于治疗急性白血病及恶性淋巴瘤等。也用于治疗乳腺癌、支气管肺 癌、软组织肉瘤、睾丸肿瘤、卵巢癌、消化道癌、恶性循环性黑色素癯及神经母细胞瘤等。 除了长春碱和长春新碱外，长春花中还含有阿玛碱( a j m a l i c i n e ) 和蛇根碱( s e r p e n t i n e ) 等 生物碱，前者可治疗高血压、心率不齐等疾病，后者兼有降血压作用及安定作用。近年来， 国外科学家在长春碱的基础上进一步改造，发现一种半合成长春花生物碱长春瑞宾碱或 称去甲长春花磺f ( n a v e l b i n e ，简称n v b ) ，它的抗癌活性较强，作用机理与长春新碱相似，丽 毒性远低于长春碱1 6 】。长春瑞宾碱有广谱的抗癌活性，目前已成为治疗非小细胞肺癌、乳腺 癌、淋巴瘤、卵巢癌等的常用药【”，已在很多国家上市，市场潜力巨大，应用前景良好。 虽然长春花中萜类吲哚生物碱市场需求量大，然而它们在长春花植物体中的含量极其微 小，尤其是长春碱和长春新碱的含量仅为百万分之几至十万分之几，化学合成和半合成也不 太理想阿。由于天然植物生产生物碱成本低，因而成为目前长春碱和长春新碱的主要来源， 但是每年前者只能生产1 2 k g ，后者只有l k g ，远远不能满足市场需求。再加上长春瑞宾碱需 用长春质碱和文朵灵作为原料来半合成或将长春碱进行结构改造来合成，因而导致长春花生 物碱原料供应十分紧张婶。 为了有效地生产长春花生物碱，科学家们尽了很大努力，长春花的组织培养被认为是一 条很有希望的替代途径，2 0 1 盐* t 2 6 0 年代就有人开始用组织培养生产长春花生物碱l “，关于 发状根培养生产根特异性的n 舡的研究也有很多m 1 3 l ，尽管利用体外培养技术生产1 r i a s 取 得了一些进展，如：用野生型农杆菌介导的转基因长春花发状根，能够生产阿吗碱，并且其 产量比野生型长春花根的产量多出很多【3 m 嘲，但是细胞培养单位产出成本高，高密度培养 东北林业大学硕士学位论文 时生物碱含量降低，并且到目前为止仍不能达到工业化生产长春碱和长春新碱的水平1 1 7 1 。 1 。1 。1 长春花基因组学研究 据估计长春花的单倍体基因组大小为6 9 6 m b p 到2 3 7 7 m b p 。其具体的长度取决于用于分析 的参照d n a t 阍。长春花基因组大小与其它夹竹桃科( a p o c y n a c e a e ) 植物( 8 个植物种的平 均大小为1 6 3 3 m b p ) 差别很大( 详见p l a n td n ac - v a l u e sd a t a b a c s eh t t p ：w w w r b g k e w o r g u k c v a l h o m e p a g e h m a l ) 。其大小比拟南芥( 1 2 5 m b p ) 和水稻( 4 9 7 m b p ) 大很多，但比玉 米( 2 6 7 1 m b p ) 或大多数被子植物( 例如：茄科1 7 5 个植物种平均大4 , 2 7 7 9 m b p ，罂粟科3 0 个植物种平均大4 * 2 9 2 9 m b p ) 小很多。最近m u m t a 等人( 2 0 0 6 ) 构建了两个长春花的c d n a 文库，一个来自于长春花幼叶基部，另一个来自于根尖，表达序列标签结果表明有大量的 t i a s 合成途径的候选基因需要进一步的克隆和鉴定b g 。 1 1 2 影响长春花中萜类吲哚生物碱含量的因素 许多植物药的活性成分是其所含的次生代谢物质，而这些次生代谢物质是受发育程度、 组织分化及外界因素刺激而产生的。1 1 a s 作为次生代谢物质，其含量也是受植物的发育阶 段和它生长过程中所处的环境条件的影响。近年来有关各种生物和非生物胁迫条件对长春花 t i a s 影响的研究比较多。 外施i a a 和2 ，4 d 妇1 e 1 血能够增加长春花生物碱含量1 2 0 。控制灌溉频率能够进一步增加 两种高生物碱产量的长春花突变体植株的根和叶中生物碱的产生【2 l 】。三唑酮( t r i a d i m e f o n ) 能够诱导长春花抗氧化物和阿吗碱的生成增加 2 2 1 。生长素能够增加长春花悬浮培养细胞中 它波宁( t a b e r s o n i n e ) 和长春质碱( c a t h a m a t h i n e ) 的积累田】。茉莉酸酮酯能够增加长春花发 状根中阿吗碱和长春质碱的积累，总生物碱的产量增加大约两倍田j 。甲基茉莉酸处理不同 生长阶段的长春花幼苗也使生物碱的含量成倍增加1 2 5 l 。乙烯能够刺激长春花悬浮培养细胞 中吲哚生物碱的积累阢2 7 l 。在长春花悬浮培养细胞中，增加培养基中葡萄糖的浓度，能够 导致次番木鳖苷的增加，同时增加n a s 的生成1 2 s 。 在长春花悬浮培养细胞中，随着镉浓度从2 4 d , 时到4 8 d , 时由o 0 5 m m 增加到0 4 m m ，阿 吗碱的生成也随之增加，并且增加的阿吗碱分泌到培养基中，尤其是处于对数生长期的细胞 表现更明显嗍。s r e e v a l l i 等( 2 0 0 4 ) 的研究表明用n 饲喂不同基因型的长春花幼苗能够显著 增加叶和根中生物碱的含量刚。v l 函u e z - f 1 0 t a 等( 2 0 0 4 ) 的研究认为长春花幼叶的损伤能够 导致阿吗碱的积累，而长春碱的含量不受影响。他们的研究还指出损伤处理、施用茉莉酸以 及乙烯均能促进阿吗碱的积累p 1 ，3 2 1 m i s r a 等人( 2 0 0 6 ) 也指出用硝酸盐或氨盐饲喂长春 花，在叶和根中均发现生物碱积累增多，并且生物碱的增多与过氧化物酶( s o d - s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ；p o d - p e r o x i d a s e ；c a t - c a t a l a s e ；o s t - g l u t a l h i o n e - s - t r a n s f e m s e ) 的活性变化相一致 例。最近z a 7 r a t e 等人( 2 0 0 1 ) 对不同发育阶段c a t h a r a m h u sp u s i l l u s ( 一种快速生长的一年生 植物，其生长周期比多年生植物长春花短很多) 中的t i a s 含量进行研究，表明幼叶是文朵 灵和长春质碱的主要存储库，根和茎是含量最少的器官。生物碱含量的改变与植物的发育阶 段相一致，尤其是开花和结果期阻l 。i l o n g 等人( 2 0 0 3 ) 以及m i n c h e v a 等( 2 0 0 4 ) 人用磷甘 2 一 l 绪论 霉素( f o s m i d o m y c i n ) 处理长春花发状根和悬浮细胞发现 h a s 的积累受到抑制，而细胞生 长不受影响口蚓。上述报道中大多是对长春花总生物碱或阿吗碱的含量进行检测，很少有 盲接对长春碱和长春新碱的含量变化进行测定。 1 1 3 长春花t i a s 生物合成途径及其关键酶 由于长春花萜类吲哚生物碱包含两种生物碱，目p v 4 1 哚生物碱和萜类生物碱生物合成途径 的调控，所以它的生物合成途径已经成为植物次生代谢产物代谢调控研究的热点田】。长春 花己成为t i a s 生物合成调控和代谢工程研究的模式植物。目前长春花t i a s 生物合成途径的 轮廓己基本清楚网。y i a s 生物合成途径中涉及到的代谢中问产物( 包括前体物质) 、关键 酶和终产物如图1 1 所示。 ll q 叩ia 吩“# 、 。嚣生掣。卫、廿岫时胛“a 响憎岫 、 山伽k ；s l s| t d c 轴“a 0 “n = 一n 删” | s t r is o d 曩d a 自姐画 由瑚i 一一c _ m r 时妇 j ： ： i 蛔螺：柚；i 口w 4 曲础i ；d , t 1 1 ： d a t “岬“； 蛐m ：1m 一臻：嚣 图i - l 长春花萜类吲哚生物碱生物合成途径( 红色标记为本实验中所涉及到的关键酶) f i g 1 - l b i o 叫i m _ i 俗b p a 1 w a y s o f 蛔p e i n d o l e a l k a l o i d s i f lc ：刊卸砌疆，a 蛾口( r e d m a 妇m d i c m e d t o t h e s e 如c 1 删i 唠回) 5 磷酸脱氧木酮糖还原异构酶( d x l le c1 1 1 2 6 7 ) 是参与甲基赤藓糖磷酸( m e p , 2 ( 2 - - 3 一 东北林业大学硕士学位论文 m e t h y l d - e r y t t m t o l4 - p h o s p h a t e ) 途径的第二个催化酶，最早在大肠杆菌中被发 见1 3 9 l 。随后在 恶性疟原虫、拟南芥、薄荷、发酵单胞菌、聚球藻、玉米、绿脓杆菌、番茄、集胞藻和长春 花等中的研究证明，d x r 能够催化5 - 磷酸脱氧木酮糖( d x p , 1 - d e o x y d - x y l u l o s e5 p h o s p h a t e ) 分子内部碳骨架的重排和中间体2 - c 赤藓糖禾磷酸c 1 位置发生n a d p h 依赖的还 原反应，生成甲基赤藓糖磷酸( m e p ) m 】。该反应是d x p 途径上最重要的限速反应之一， 也是萜类物质代谢工程最重要的靶点之一【4 1 1 。除草剂f o s m i d o m y e i n 是d x r 的专一抑制剂， 因而d x r 是开发新型除草剂的新靶点蛋白f 4 2 l 。拟南芥踟是单基因编码，它在拟南芥不同器 官中都有表达1 4 3 j 。原位杂交结果表明长春花d r r 存在于幼嫩器官的内生韧皮部的薄壁细胞中 l 辨l 。v e a u 等人( 2 0 0 0 ) 的研究显示在生产1 1 a s 的长春花悬浮细胞中表达c 磁铲和仃 女b 口基因 能够正向调控生物碱的生成 4 5 1 。而c a r r e t e r o p a u l e t 等人( 2 0 0 6 ) 的研究结果显示，增j j i d x s 的活性能够正向调控质体中萜类合成前体异戊二烯的生成，i 自i d x r 却不能：k h e m v o n g 等 人( 2 0 0 5 ) 也指出施肥后的油棕榈中d x s 基因的表达水平有所提高，而岔盯基因的表达水平没 有改变。这些相互矛盾的结论表明d x r 作为参与t i a s 生物合成途径的重要的调控酶，其功 能和作用机理还不十分清楚【4 7 l 。 次番木鳖苷合成酶( s l s ，e c1 3 3 9 ) 早在l o 年前就已经被发现 4 9 l ，然而直到最近 i r m l e r 等人( 2 0 0 0 ) 对长春花悬浮细胞s l s 的功能研究才给出实验证据，证明长春花中s l s 能够催化马钱子苷( 1 0 9 a n i n ) 环戊烷环氧化断裂形成次番木鳖苷，该催化反应依赖于 n a d p h ，s l s 属于细胞色素p 4 5 0 家族俐。免疫组织化学和原位杂交研究表明s l s 存在于 长春花叶的表皮细胞中m 。m e r i l l o n 等人( 1 9 8 9 ) 先前的研究显示次番木鳖苷的供应可能是 t i a s 积累的限制因素i 4 9 1 ，s l s 作为直接催化生成次番木鳖苷的酶，无疑对次番木鳖苷的供 应起着十分重要的作用，因此s i s 也是t i a s 生物合成途径中的一个十分重要的调控酶【卯l ， 它的生物学功能和调控机理有待于深入研究。 据牛儿醇- 1 0 羟化酶( g i o h ，e c1 1 4 1 4 1 ) 催化由犍牛儿醇转化为l o - 羟基栊牛儿醇的 反应，这个反应是生成次番木鳖苷的第一个专属步骤唧1 。g 1 0 h 是依赖于细胞色素p 4 5 0 的 一种膜结合的细胞色素单加氧酶【5 2 】。有研究证明由g 1 0 h 参与催化生成的次番木鳖苷的供 应是t i a s 生产的限制因子嗍，因此g 1 0 h 是长春花中t i a s 生物合成的一个重要的限速酶 【5 3 】。1 9 7 3 年，m e e h a n 和c o s e i a 首次从长春花中提取得到催化酶g i o h ，并将其鉴定为细胞 色素p - 4 5 0 型酶酬。其后c o h u 等( 2 0 0 1 ) 从长春花悬浮培养细胞中分离纯化了g 1 0 1 酊5 5 1 。 最近c a n t o - c a n c h e 等( 2 0 0 5 ) 克隆了长春花中g 1 0 h 基因并对它进行了功能鉴定闻。尽管 g i o h 首先是从长春花中纯化出来的，但是，g 1 0 h 的克隆和功能鉴定最初却是在不生产 t i m 类化合物的拟南芥中进行的，有趣的是，拟南芥的基因能够作为探针来研究玉米中相 对应的基因壮”。植物可能广泛的生产l o 羟基栊牛儿酵，而g 1 0 h 在这些不生产t i a s 类化 合物的植物中的作用还不清楚，需要进一步研究。 色氨酸脱羧酶( t d c , e c4 1 1 2 8 ) 催化l 色氨酸形成色胺，因为它催化的这一过程连 接着初生代谢和次生代谢，所以t d c 被认为是参与t i a s 生物合成过程的关键酶之一。早 期的研究表明，t d c 的活性与生物碱的积累相一致i 期。然而c o n d d i j n 等( 1 9 9 5 ) 的研究显 示t d c 水平的提高并没有导致t i a 的积累，当t d c 活性被去除时反义克隆也没有t i a s 的 存在p 珂。c o n t i n 等人( 1 9 9 8 ) 认为长春花细胞培养中t d c 的过量表达，虽然导致色胺的大 量积累，但并没有使生物碱的产量增加，表明t d c 不是或不是唯一的生物碱合成的限速步 骤嗍，这一推钡4 仍需进一步的实验结果来证明。 异胡豆苷合成酶( s 1 re c4 3 3 2 ) 被认为是萜类吲哚生物碱生物合成途径中的最重要 的关键酶，它耦合来自于细胞质莽草酸途径的色胺( t r y p a m i n e ) 和来自于质体m e p 途径中 的次番木鳖苷( s c c o l o g a n i n ) 生成大约2 0 0 0 多种萜类吲哚生物碱的通用前体化合物异 胡豆苷( s t r i c t o s i d i n e ) 6 0 l ，这步反应是1 r i a s 类化合物( 如长春花碱，长春新碱和喜树碱 等) 的中心反应。将长春花s i r 和t a b 基因编码区克隆到含有c a m v 3 5 s 启动子的植物表达 载体中，用农杆菌转化( 单转化和共转化) 长春花悬浮细胞，共转化娩和肼的长春花细 胞表现出s t r 和1 r i ) c 的高酶活性，且转化细胞中的色胺、异胡豆苷和多种t i a s 的产量都 有所提高：单独转s t r 基因的长春花细胞获得了t i a s 的积累，而单独转t d c 细胞不能获得 1 1 a s 产量的提高 6 q 。证明s t r 在1 1 a s 的合成过程中起着重要作用。g e e r l i n g 等( 1 9 9 9 ) 在金鸡纳树毛状根中超量表达长春花t d c 和册基因大大提高了t i a s 和奎宁类生物碱的含量 1 6 2 。d u t m 等( 2 0 0 5 ) 研究也表明s i r 的表达与长春花组织培养物和突变体中t i a s 的含量成 正相关，用马钱子苷和次番木鳖苷饲喂长春花悬浮培养细胞能够增加t i a 的积累【6 3 j 。由此 可见，s t r 是t i a s 生物合成的重要瓶颈之队6 5 l 。免疫组织化学和原位杂交研究表明s r 存在于叶的表皮细胞酬。最近在多种类型的动植物中发现了很多s i r 家族的新成员，然而在 这些动植物体内它们的咿基因与生物碱的生成并不相关【6 7 鹋】，它们的生物学功能和作用机 理有待于进一步的研究。长春花作为模式物种，对其s t r 的深入研究必将有助于人们对不 同动植物体内共同存在的腑基因的功能和作用机理的深入了解，同时也将为利用生物技术 手段生产t i a s 类化合物提供重要的理论依据。 1 1 4 长春花中t i a s 代谢途径在细胞和组织中的分布 生物碱合成酶在细胞中通常呈现区室化分布，它们不仅存在于细胞质中，还存在于其它 细胞器或亚细胞器中，从而防止生物合成过程中生成的生物碱或它们的中间体对细胞产生毒 性作用。为了完成t i a s 整体生物合成过程，t i a s 生物合成途径上的一些代谢中间体需要在 不同的细胞器或亚细胞器间进行运输。按现有的文献推测文朵灵的生物合成途径至少涉及五 个不同的亚细胞区域l j 】。 如图1 2 所示，细胞中参与 h a s 生物合成途径的酶的分布是错综复杂的。1 f i ) c 存在于 细胞质中，由t d c 催化的色氨酸脱羧生成色胺的过程发生在细胞质中嘲；然后色胺穿过液 泡膜进入液泡中，因为催化色胺和次番木鳖苷( s e c o l o g a n n ) 偶联的s t r 存在于液泡中 1 5 。g 1 0 h 是合成次番木鳖苷过程中的一个关键酶，它结合于前液泡膜上【明；s g d 催化异 胡豆苷去糖基化反应，已证明s g d 至少部分结合于液泡膜外壁上 7 0 1 ，体内定位表明s g d 位于内质网中 t q ；t 1 6 h 催化水苷草碱c 1 6 的羟基化，研究证明t 1 6 h 也定位于内质网 吲；有研究认为催化文朵灵合成的倒数第二步的n m t 与类囊体膜结创列，但是在没有质体 东北林业大学硕士学位论文 分化的白化苗中也有n m t 活性【7 4 l ；文朵灵合成的最后两步分别由d 4 h 和d a t 催化，他们 的催化反应在细胞质中进行m7 5 】；催化文朵灵生成长春碱的特异性过氧化物酶定位在液泡 中【7 6 1 ，因而推测文朵灵可能随后又被转运到液泡中。 图l - 2 长春花细胞内萜类吲哚生物碱合成的区室化图解 f i 吕1 2 s 曲c e l l u j a r c o f n p a 咖l e n t 缸i 蛐o f m n 脚w a yg e l 璐a c 。硎j i l g t o v 锄d e r h e u 出n d ( 2 0 0 4 ) 生物碱及其代谢中问体不仅在细胞内各细胞器问运输，还要通过维管系统从合成部位向 临近的细胞转运，继而转移到其它组织中。t d c 和s t r 主要分布在长春花根中，暴露在空 气中的可进行光合作用的组织中也有分布阿，面t 1 6 h 7 8 、d 4 h f 7 9 】和d a t 6 6 1 只存在于不暴 露于空气的器官里，这些器官又恰恰是文朵灵合成的部位。原位杂交和免疫组织化学定位研 究显示，t d c 和s t r 分布在叶、茎表皮和花芽隅7 9 l 以及根的顶端分生组织附近。d 4 h 和 d a t 在根中没有分布，而是分布于叶的叶肉组织的乳汁细胞和特化细胞中，由此可见文朵 灵合成过程至少涉及三种器官组织。 虽然原位杂交和细胞组织化学技术的应用使我们对t i a s 合成酶的定位和中间体的转运 有一定的了解，但是植物代谢途径大多是由多种酶，多个器官组织的多个不同类型细胞参与 的多步反应，受发育、环境等因素的影响，是一个错综复杂的代谢网络。植物是怎样实现这 种复杂网络空间和时间上的严格的调控还有待于迸步的研究。 1 2g a t e w a y 技术概况 据报道长春花中长春碱和长春新碱的生物合成有3 0 多个步骤，参与的合成和调控酶至少 有2 0 多种s o l 。如何能高效快速得到这个途径上多种重要酶基因的克隆，从而对这些酶的功 能和作用机理进行深入的研究呢? 常规的方法是先将p c r 产物克隆到t a 载体上对其进行测 l 绪论 序验证，限于t a 克隆的方向性问题，往往使下一步亚克隆到其它表达载体的效率大大降 低；此外将已插入的目的基因转移到表达载体时，通常需要再进行酶切、连接，连接酶的连 接效率使得亚克隆效率又一次受到影响，并且每次将目的基因转移到一个新的载体上都需要 重复上述繁杂的酶切、连接操作。由此可见，常规方法既费时又耗力，对于单个基因其工作 量也许还可以承受，但是对于像长春花n a s 生物合成途径上这样编码多个酶的多个基因的 大规模克隆和表达，其工作量是极其浩大的。g a t e w a y 克隆技术的应用正好解决了这一问 题。 g a t e w a y 克隆技术是由i n v i t r o g e n 公司近年来新开发的一个高效的大规模克隆系统，是 d n a 片段克隆( 亚克隆) 、基因功能分析、蛋白活性研究的快速而有效的方法。该技术利用 九噬菌体的位点特异性重组原理( 九噬菌体用此重组系统进行裂解途径和溶原途径之间的互 相转换) l s l l ，实现了不需要传统繁琐的酶切和连接过程的基因快速克隆和载体间平行转 移，同时还保持目的基因正确的读码框和插入方向。 1 2 1g a t e w a y 技术的工作原理 g a t e w a y 克隆技术是基于已研究的非常清楚的九噬菌体位点特异重组系统( a a t bxa t t p - a t t lx a t t r ) ，这是一种准确保存遗传信息的有效的自然的生化途径f s l j ( 图1 - 3 ) 。g a t e w a y 克隆技术主要包括b p 和l r 两个反应。b p 反应利用一个有鳓b 接头的d n a 片段或载体 和一个有a c t p 接头的供体之间的重组反应，生成入门克隆。l r 反应利用有a t t l 接头的入门 载体和一个有a t t r 接头的目的载体之间的重组反应，生成表达克隆。l r 反应用来在平行的 反应中转移目的基因到一个或更多个目的载体中网。 凰一囤 计一l 囤 一 霹盔盔窭唰 _ 扫蕊翟盔瓣 ：舱 图l - 3l a m b d a 噬茁体的位点特异性重组反应( l a r d y , 1 9 8 9 ) f i g , 1 - 3 s i z e s p e c i f i cr e c o m b i n a n t r e a c t i o n o f l a m b d a p h a g e ( l a n d y , 1 9 8 9 ) 申点 专舳 东北林业大学硕士学位论文 l n v i t r o g e n 公司提供的g a t e w a y 化的载体( 供载体、入门载体和目的载体) 中，通常有一 段c c d b 基因，它编码干扰大肠杆菌d n a 促旋酶的一种蛋白，从而抑制宿主大肠杆菌的生 长。当目的基因和入门载体、供载体或目的载体发生b p 或l r 重组时，c c d b 基因被目的基因 取代，电转化后的大肠杆菌能够在培养基上正常生长；而携带有c c d b 基因的未反应载体或 保留有c c d b 基因副产品的大肠杆菌将不会生长。所以，利用c c d b 选择方法可以很容易的从 培养基上高效回收目标克隆。 1 2 2g a t e w a y 技术的优缺点 g a t e w a y 技术具有以下几方面的优势：( 1 ) 操作简单而快速。可不考虑目的d n a 是否 有合适的酶切位点，也不必进行繁琐而费时费力的酶切和连接反应。是一种高效地直接克隆 p c r 产物的便利方法。( 2 ) 特异性强。只在特定的d n a 链进行切割和重接，并且反应过程 中不涉及d n a 的合成。( 3 ) 效率高，典型的克隆效率高达9 5 以上，并且在重组时d n a 片 段的阅读框和方向保持不变。( 4 ) 表达系统多。i n v i t r o g e n 公司提供极为丰富多样的表达系 统，包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物，为g a t e w a y 用户提供更强有力的后盾。( 5 ) 后续 操作简单。一旦构建好g a t e w a y 入门克隆，就可以很容易的将目的基因转移到任意的目标 载体( g a t e w a y 化的载体) 中，与目标载体上的启动子、融合位点( n 端或c 端) 和骨架相 连接( 参见g a t e w a y ot e c h n o l o g y ) 。 该技术的缺点是封闭的系统仅适用于i n v i t r o g e n 公司提供的载体( g a t e w a y 化的载体) ： 除此之外，含有a t t b 接头的目的基因的p c r 引物长度一般比较长，因而导致引物合成成本 高。 1 2 3g a t e w a y 技术的应用 据i n v i t m g e n 公司网站( w w w i n v i t r o g e n e o m ) 上公布的信息，至今有近百篇文章报道 应用了g a t e w a y 技术。目前c r a t e w a y 克隆技术已广泛的应用于e d n a 文库构建、酶活性和 晶体结构、基因组学、蛋白质组学、r n a i 、信号转导、细胞凋亡、癌症等方面的研究。国 内自2 0 0 4 年开始有应用g a t e w a y 技术进行研究的报道如：梅文倩等( 2 0 0 4 ) 利用g a t e w a y 大规模克隆技术将1 6 个拟南芥转录因子的o r f 克隆入植物表达载p p t v 和酵母表达载体 p y t v 中，并用酵母融合表达实验和w e s t e r n - b l o t 进行了检测，证明该克隆技术具有很好的 可行性【8 3 1 ；龙松华等( 2 0 0 5 ) 首次利用g a t e w a y 技术构建了真菌( 交链孢菌) c d n a 文库 【科l ；陈其军等( 2 0 0 4 ) 将传统的t a 克隆技术与g a t e w a y 克隆技术进行了整合，构建了与 g a t e w a y 技术兼容的两种t a 克隆载体，使得简单高效地将p c r 产物或其他来源的目的基因 d n a 片段插入到入门载体上获得入门克隆成为可能瞄j 。 1 3 研究目的和意义 长春花作为重要的药用植物，因其所含有的著名抗肿瘤药物长春碱和长春新碱而备 受关注。近年来，科学家们对长春花进行了大量的研究并取得了一些进展陋鹄】，使得人们 对1 r i a s 生物合成途径的轮廓有所了解，然而t i a s 生物合成途径上还有很多细节并不清楚， 其中起重要作用的关键酶的功能和调控机理的研究还处于起步和探索阶段。 近年来，随着各种先进的工程技术( 基因工程、代谢工程和遗传工程等) 的发展以及对 生产条件的优化，应用生物技术手段来大量获得长春碱和长春新碱等抗肿瘤药物展现了诱人 的前景。然而，由于缺少对长春花t i a s 生物合成的整体功能途径的了解，导致迄今为止体 外培养和遗传转化仍不能替代天然植物来生产长春碱和长春新碱。由此可见，长春花t i a s 的工业化生产还要靠1 1 a s 生物合成机理的理论指导。因而，广泛的分离、克隆和鉴定参与 t i a s 生物合成途径的相关酶的基因，深入研究这些催化酶的功能和作用机理，必将有利于 生产实践和理论的发展。 根据已查阅的相关文献和n c b l 中现有基因的信息，本论文选择长春花1 1 a s 生物合成途 径中编码关键酶d x s 、d x r 、s l s 、g i o h 、t d c 、s t r 和d a t 的基因为目的基因，利用 g a t e w a y 克隆技术对这些目的基因进行了大规模的克隆，并对它们的表达情况进行了研究。 这些重要基因入门克隆和蛋白纯化产物的获得，将为长春花代谢工程提供更多有用的靶点， 为转基因手段改造长春花提供物质基础，为利用生物技术手段提高长春碱和长春新碱等 t i a s 类化合物的产量或它们的前体物质的产量提供理论依据，此外还将为其它植物( 如喜 树、红豆杉等) 的1 1 a s 类化合物的生物合成和调控的研究提供借鉴。 2 1 材料和方法 2 目的基因入门克隆的建立 2 1 1 实验材料 2 1 1 1 植物材料 长春花植物种子保存于东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室。长春花幼苗种 植于德国海德堡大学植物学研究所( h i p ) 温室中。 2 1 1 2 分子生物学用酶及试剂盒 实验中所用的聊d n a 聚合酶、高保真p h u s i o nd n a 聚合酶购自于n e b ( n e w e n g l a n db i o l a b s ) 公司；反转录第一链c d n a 合成试剂盒( o m n i s c r i p t 固r e v e r s e t r a n s e r i f i o n ) 购自于q i a g e n 公司，p c r