（林木遗传育种专业论文）杨树4CL基因调控木质素生物合成的研究.pdf

摘要 摘要 木质素是地球上数量仅次于纤维素的有机物，林木中木质素占木材干重的 1 5 3 6 ，木质素生物合成及调节在植物生长和发育中发挥重要作用，另一方面， 木质素是制浆造纸业的不利因素，脱除纤维素中的木质素，需要消耗大量能源和 使用有毒化学物质，提高了造纸成本并污染环境。近十几年来，人们对木质素生 物合成也有了更多更深入的认识，随着木质素生物合成途径许多酶的编码基因被 不断分离克隆出来，通过调控木质素生物合成途径中重要酶的编码基因的表达， 抑制酶的活性，从而阻断木质索生物合成途径，降低木质素的合成量或单体组成， 已经在一些转基因植株上取得了成功。因此，利用生物技术手段降低木质素古量 或改变其制浆性能，创造出符合制浆造纸原料特性要求的林木品种，对于降低制 浆造纸的经济成本和环境保护等方面都具有重要意义。 4 c l ( 4 - c o u m a r a t e ：c o al i g a s e ) 是木质素生物合成途径的核心酶之一，在木 质素生物合成途径中处于终端位置。加拿大u b c 大学d o u g l a s 小组以毛果杨美 洲黑杨杂种h ll ( p o p u l u st r i c k o c a r p a pd e # o i d e s ) 为植物材料，利用p c r 扩增 结合c d n a 文库筛选的方法，获得了杨树4 c l 酶编码基因p t d 4 c l 3 的全长c d n a 片段1 6k b ，与p t 4 c l l 的氨基酸序列同源性达7 6 ，其重组蛋白具有4 c l 酶活 性，原核表达分析表明，其重组蛋自具有4 c l 酶活性，n o r t h e m 杂交证实，其在 木质部中表达最高，表明该基因与木质素生物合成有关。为了探讨p t d 4 c l 3 在木 质素生物合成的作用及其在基n 2 _ 程育种中的应用前景，本文以我国杨树工业用 材林优良品种为试材，利用p t d 4 c l 3 基因c d n a 开展了基因工程下游研究工作， 取得了一些研究结果。 1 利用双元载体p b i n l 9 r t l 0 1 ，将p t d 4 c l 3 的全长c d n a 片段1 6k b ，分别 反向和正向插入双元载体p b i n l 9 r t l 0 1 的c a m v3 5 s 启动子之后，构建了该基因 的反义和正义表达载体“p b i n l 9 r t l o t a s 4 c l ”和“p b i n l 9 r t l 0 1 一s 4 c l ”，并 成功地转入了根癌农杆菌g v 3 1 0 i 中。 2 以白杨派杂种无性系“i n r a 7 1 7 ”( pt r e m u l a pa l b ac 1 i n r a7 1 7 1 一b 4 ) 为参照，选择我国杨树工业用材林主栽优良品种1 0 7 杨( p c a n a d e n s i sc 1 n e v a ) 、 1 0 8 杨( 户c a n a d e n s 曲c i o u a r i e n t o ) 、1 0 9 杨( p d e r o i d e s 尸a l b ac f m i n c i o ) 、 1 1 0 杨( p d e l t o i d e s p m a x i m o w i c z i ic 1 e r i d a n o ) 和l 杨( p c a n a d e n s i sc 1 b e l l o t t o ) 等5 个品种( 黑杨派或派间杂种无性系) 为试材，对其叶片再生体系 进行了优化，建立了高效的叶盘法农杆菌遗传转化程序，并获得了经抗k a n 生根 筛选的证义和反义4 c l 基因结构的转基因植株进行参试，以白杨派杂种。 摘要 ( 1 ) 以m s 为基本培养基附加不同浓度的6 - b a 、t d z 和n a a ，建立了5 个 参试品种的组织培养扩繁体系，茎段外植体培养基( m s + 6 - b a0 ，1m g l + n a a o 0 2r n g l ) 诱导腋芽增殖，生根培养基为 m s ( 1 2 基本盐) + n a a0 0 2 m 。g u + i b a o 。0 2m l 。 ( 2 ) 对5 个参试品种的叶片再生体系进行了优化，愈伤组织诱导培养基( m s + 6 一b ao 5m g l + n a ao 。0 5m g l + t d zo 0 5m g l ) 的诱导效果最好，并建立了高 效的叶盘法农杆菌遗传转化程序，利用农杆菌进行遗传转化，获得了经抗k a r l ( 5 0 r a g l ) 生根筛选的的正义和反义4 c l 基因结构的转基因植株。 3 利用p c r 检测初步筛选出了批量转基因植株，在6 个品种上均获得了正义 和反义基因结构的转基因植株。对在温室培养1 0 个月的7 1 7 杨和1 1 0 杨的转基因 植株进行4 c l 酶活性和k 1 a s o n 木质素分析，与对照植株相比，转基因植株木质部 中4 c l 酶活性降低了1 0 5 0 ，木质素含量降低1 0 4 0 ，且转基因植株的 形态和生长发育未见异常。结果表明，利用反义r n a 技术抑制4 c l 基因表达，能 有效降低转基因植株4 c l 酶活性和木质素含量，并且正义和反义4 c l 基因机构的 转化均引起了转基因植株的4 c l 酶活性和木质素含量减低，已经筛选出了木质素 含量下降1 0 以上的7 1 7 杨和1 l o 杨的转基因株系。 4 利用7 1 7 杨转基因植株和对照植株进行r t p c r 反转录分析，正义和反义 4 c l 基因结构的导入，均能导致转基因内源4 c l 基因的转录产物减少，4 c l 基因 的表达在转录水平上受到了抑制，并且反义基因结构比正义基因结构对基因表达 的抑制作用明显。 该研究不仅获得了6 个杨树品种的转基因植株，而且为进一步认识木质素生 物合成途径提供更丰富的研究信息，也为1 0 7 杨、1 0 8 杨和1 1 0 杨等品种的木质索 基因工程改良奠定了理论和实践基础。 关键词：p t d 4 c l 3 ：杨属( p o p u l u s ) ；农杆菌介导遗传转化；转基因植株 4 c l 酶活性；木质素含量 a b s t r a c t m a n i p u l a t i o no fl i g n i nb i o s y n t h e s i so ft r a n s g e n i cp o p l a rb y4 c lg e n e a u t h o r ：l ij i n - h u a ( f o r e s tg e n e t i c sa n db r e e d i n g ) d i r e c t e db yp r o f z h a n gq i w e na n dp r o t ：c a r ljd o u g l a s a b s t r a c tl i g n i ni s ，s e c o n dt oc e l l u l o s e ，t h em o s ta b u n d a n to r g a n i cc o m p o u n di nt h e t e r r e s t r i a lb i o s p h e r e i nd i f f e r e n tt r e es p e c i e s 1 i g n i nc o n t e n tv a r i e sb e t w e e n1 5a n d3 6 o ft h ed r yw e i g h to fw o o d l i g n i ni sam a j o rc o n s t i t u e n to fc e l lw a l l so ff i b e r sa n d t r a c h e a r ye l e m e n t s a n d p r o v i d e st h e s e c e l l s r i g i d i t y f o rs t r u c t u r a l s u p p o r ta n d i m p e r m e a b i l i t yf o rw a t e rt r a n s p o r t f o rt h ep r o d u c t i o no fh i g h q u a l i t yp a p e r , l i g n i ni s c o n s i d e r e da san e g a t i v ef a c t o rb e c a u s ei tm u s tb ee x t r a c t e df r o mt h ec e l l u l o s ef r a c t i o n b ye n e r g y - r e q u i r i n g a n dp o l l u t i n gm e t h o d sf o rt h i s r e a s o n ，t h e r ei s c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i nm o d i f y i n gl i g n i nb yg e n e t i ce n g i n e e r i n gt oi m p r o v ei t se x t r a c t a b i l i t yf r o m w o o d 4 - c o u m a r t e ：c o e n z y m eal i g a s e ( 4 c l ) i sak e y e n z y m e ，w h i c hd e c i d e dt h el a s ts t e po f l i g n i nb i o s y n t h e s i s d o u g l a s sl a bi nu b c ，c a n a d ai s o l a t e dw h o l ec d n af r a g m e n to f 4 c lg e n e s ，p t d 4 c l 3 ，f r o mp o p u l u s t r i c h o c a r p axp d e l t o i d e s w h o s ep r o t e i n sc a t a l y z e t h ec o a l i g a t i o no fh y d r o x y c i n n a m i ca c i d s ，g e n e r a t i n ga c t i v a t e dp h e n o l i cp r e c u r s o r sf o r l i g n i nb i o s y n t h e s i s ，w h i l ep t d 4 c l 3i se x p r e s s e di ns t e ma n di st h o u g h tt ob ed e v o t e dt o l i g n i nb i o s y n t h e s i si nd e v e l o p i n gx y l e mt i s s u e t h eu l t i m a t eg o a lo fo u rr e s e a r c hi st o o b t a i nt r a n s g e n i cp o p l a r sw i t hl o w - l i g n i nc o n t e n t sf o rc o m m e r c i a lp a p e ri n d u s t r ya n d e n v i r o n m e n t a l p u r p o s e s u s i n g t h i sw h o l ec d n ao fp t d 4 c l 3 ，w eu n d e r t o o k d o w n s t r e a mw o r kg e n e t i ce n g i n e e r i n g w eo b s t a i n e dt h e s er e s e a r c hr e s u l t sa sf o l l o w e d a st h o s e ： ( 1 ) a p p r o x i m a t e l y1 ，6 k bf r a g e m e n to fp t d 4 c l 3c d n aw e r ei n s e r t e db e h i n dc a m v3 5 s p r o m o t eo fb i n a r yv e c t o rp b i n 19 r t l01i na na n t i s e n s eo rs e n s eo r i e n t a t i o nt og e n e r a t e t h eb i n a r yv e c t o rp b i n l 9 r t l 0 1 - a s 4 c la n dp b t n l 9 r t l 0 1 一s 4 c l t h eb i n a r yv e c t o r w a s s u c c e s s f u l l ym o b i l i z e di n t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i n g v 310 1 ( c 5 8 p m p 9 0 ) f 2 ) nv i t r om i c r o p r o p a g a t i o na n dae f f i c i e n tl e a f d i s cr e g e n e r a t i o nr e g e n e r a t i o ns y s t e m h a v eb e e no p t i m i z e da n de s t a b l i s h e df o rf i v ep o p l a rc u k i v a r sw i t hg r e a te c o n o m i c i n t e r e s ti nc h i n a ，pc a n a d e n s i sc l n e v a ，pc a n a d e n s i sc l g u a r i e n t o ，pe a n a d e n s i s e l ，b e l l o t t o pd e l t o i d e sxpa l b ac 1 m i n c i o a n dpd e l t o i d e sxpm a x i m o w i c z i ic l e r i d a n o ，w h i c ha r eh y b r i do fs e c t i o na i g e i r o so d a n dt a c a m a h a c a h y b r i df r o m s e c t i o np o p u l u s ，“i n r a7 17 ”俾t r e m u l ax 尸a l b ac 1 i n r a7 1 7 一i - b 4 ) ，w a su s e da s c o n t r o lc l o n ew i t ht h eo p t i m i z e dp r o c e d u r eo f a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n a b s t r a c t a n dl e a fd i s cr e g e n e r a t i o nf o rt r a n s g e n i cp l a n t s ，s i xp o p l a re u l t i v a r sw e r et r a n s f o r m e d a n dg e n e r a t e dt r a n s g e n i cp l a n t sw e r es c r e e n e du s i n gk a ni nr o o ti n d u c e d m e d i a ( 3 ) t r a n s g e n i cp l a n t so f6p o p l a rc u l t i v a r sc o n f i r m e db yp c rw e r et r a n s f e r r e di n t os o i l a n dg r o w ni nt h eg r e e n h o u s ef o rf a r t h e rc h a r a c t e r i z a t i o n d e v e l o p i n gx y i e m sw e r e c o l l e c t e df o r4 c l e n z y m ea s s a yf r o mt e n m o n t h - o l dt r a n s g e n i cp l a n t so f pd e l t o i d e sxp m a x i m o w i c z i ic 】e r i d a n o a n d 户t r e m u l a pa l b ac 1 i n r a7 1 7 1 一b 4 4 c le n z ) ，m e a c t i v i t yi nd e v e l o p i n gx y l e mw a sr e d u c e df r o m1 0t o5 0 i nt h em a j o r i t yo ft h e t r a n s g e n i cl i n e s ，w h i c hi si na g r e e m e n tw i t ht h er e s u l tt h a tt h ee x p r e s s i o no f4 c lw a s s u p p r e s s e di nt h ex y l e mo ft r a n s g e n i cp l a n t s t h el i g n i nc o n t e n to ft r a n s f o r m e dp l a n t s r e d u c e db y10 - 4 0 w i t h o u ta b n o r m a lm o r p h o g e n e s i sa n dg r o w t hc o m p a r e dt ot h a t i nt h ec o n t r o l s ( 4 ) r t - p c ra n a l y s i so f t r a n s g e n i cp l a n t so f “i n r a 7 1 7 ”s u g g e s t e dt h a ti n t r o d u c e ds e n s e a n da n t i s e n s e4 c ls t r u c t u r es u p p r e s s e dt r a n s g e n i ca n de n d o g e n o u s4 c le x p r e s s i o nw i t h s t r o n g e rr o l eo fa n t i s e n s et h a ns e n s eg e n e t r a n s g e n i cp l a n t so fa n t i s e n s ea n ds e n s e4 c lf o r6p o p l a rc u l t i v a r sw i l ln o to n l yg i v e n o v e li n s i g h ti n t or e g u l a t o r ya s p e c t so ft h ep a t h w a ya n do nt h es t r u c t u r ea n db i o l o g i c a l r o l e so fl i g n i n ，b u ta l s op r o v i d eap i c t u r eo fg e n e t i ce n g i n e c r i n gf o rm o d i f i e dl i g n i n c o m p o s i t i o na n dc o n t e n t k e y w o r d s ：p t d 4 c l 3g e n e ，p o p u l u s ，a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n ， t r a n s g e n i cp l a n t s ，4 c le n z y m ea c t i v i t y , a n dl i g n i nc o n t e n t 一 塑堕翌 a b br e vja tio n s 4 c l 5 0 h g 6 一b a a 1 d o m t c 3 h c 4 h c a n c a d c a l d 5 h c a m v3 5 s c a r b c c o a 3 h c c o a o m t c c r c h i c h s c i a p c o m t c 1 、a b d e p c e b e d t a f e a f 5 h g g e l l h h c a k a n i b a l a c l g l u n a a 4 - c o u m a r a t e ：c o al i g a s e 5 - h y d r o x yg u a i a c y la l c o h o l 6 一b e n z y l a m i n o p u r i n e 5 - h y d r o x yc o n i f e r a l d e h y d eo - - m e t h y l t r a n s - f e r a s e c o u m a t e3 - h y d r o x y l a s e c i n n a m a t e4 - h y d r o x y l a s e c o u m a r i ca c i d c i n n a m y la l c o h o ld e h y d r o g e n a s e c o n i f e r y ia l d e h y d e5 - h y d r o x y l a s e c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s3 5 sp r o m o t e r c a r b e n i c i l l i n c o u m a r o y l - c o a3 - h y d r o x y l a s e c a f f e o y l - c o a0 - m e t h y t r a n s f e r a s e c i n n a m o y l - c o ar e d u c t a s e c h a l c o n ei s o m e r a s e c h a l c o n es y n t h a s e a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，c a l fi n t e s t i n a l b i s p e c i f i cc a f f e i ca c i d 5 一h y d r o x y f e r u l i ca c i do - m e t h y l t r a n s f e r a s e c e t y i t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e d i e t h y i p y r o c a r b o n a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d f e r u l i ca c i d f e r u l i ca c i d5 - h y d r o x y l a s e g u a i a c y la l c o h o l g e n t a m i c i n m h y d r o x y p h e n y la l c o h o l h y d r o x y c i n n a r n i va c i d k a n a m y c i n i n d o l e 一3 - b u t y r i ca c i d l a c c a s e l - g l u t a m i ca c i d 1 - n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d v 缩略词 p a l p c a p c r p o x r j f r r r _ p c r s s i a s a d s t r s y p s y r 1 1 a l t d z p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a l y a s e p c o u m a r i ca c i d p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p e r o x i d a s e r i f a m p i c i n r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r s y r i n g y la l c o h o l s i n a p i ca c i d s i n a p y la c o h o ld e h y d m g e n a s e s t r e p t o m y c i n s y r i n g y lp r o p a n e s y r i n g a l d e h y d e t y r o s i n ea m m o n i a - l y a s e n i d i a z t t r o n v i 生塞型查旦茎 正文图表目录 蚓1 1 三种木质素单体结构及其聚合木质素 图1 - 2 高等植物木质素生物合成途径框架图 图2 1 含目的基因4 c l 的载体p q e 3 0 _ 4 c l 图2 - 2 重新构建的双元表达载体b i n l 9 p r t 0 1 图2 - 3 反义4 c z 载体j 哺dj 和x b a i 与x b aj 和s a l i 的取酶切结果 幽2 4 反义4 c l 基因的双元表达载体的结构示意图 幽2 - 5 正义4 c l 表达载体x h o i 和x b a i 与x b a l 和s a l 】的双酶切结果 图2 - 6 正义4 c l 基因的双元表达载体的示意图 图2 7 反义和正义4 c l 袁达载体转入农杆菌后的p c r 扩增结果 图3 1 1 0 8 杨茎段外植体的组织培养 图3 - 211 0 杨叶盘法农杆菌遗传转化再生 图4 1 转基因植株的p c r 检测结果 图4 27 1 7 杨对照和转基因植株4 c l 酶活性比较 图4 - 31 1 0 杨对照植株和转基因植株4 c l 酶活性的比较 图4 - 471 7 杨转基因植株的本质素含量 幽4 - 511 0 杨转基因植株的木质素含量 圉5 】7 1 7 杨转基因植株的r t - p c t 检测 表1 1 与木质素生物合成有关基因的克隆 表t - 2 木质素单体生物台成基因的超表达和抑制表达 表3 - 15 个杨树品种不同培养基上叶片再生体系诱导的结果 表4 - 14 c l 酶分析和计算中使用的吸收波长和摩尔消光系数 表4 - 27 1 7 杨转基因杨树木质部4 c l 酶的活性 表4 - 31 1 0 杨转基因杨树木质部4 c l 酶的活性 引言 1 引言 目前，世界制浆造纸工业主要以木材为造纸纤维原料，木材纤维在其原料结 构中的比重已达9 5 ( 李金花等2 0 0 3 ) 。木材纤维中的纤维素、半纤维素和木质 素主要存在于细胞中，其中纤维素是木材纤维的骨骼物质，而木质素与半纤维素 以包容物质的形式分散在纤维之中及其周围( b a u c h e re ta l1 9 9 8 ；m o n t i e s1 9 8 9 ： 杨淑蕙主编2 0 0 1 ) 。以木材纤维为原料的制浆造纸过程，其基本原理是用化学、 机械或兼用化学及机械的方法将植物原料中的纤维分离出来，再在浆、水混合的 悬浮体中使纤维重新交织成均匀而致密的纸张，而纤维的分离实质上是使纤维中 所含木质素取得塑化或溶解的过程( 杨淑蕙主编2 0 0 1 ；中野毕三著1 9 8 5 ) 。 木材纤维原料中各成分的含量和组成因原料的种类、部位、产地等不同而异， 造成各种原料的制浆生产工艺条件、综合利用途径以及产品的产量和质量也有所 不同，影响了木材纤维原料的制浆造纸价值( 杨淑蕙主编2 0 0 1 ) 。其中，木质素 是原料及纸浆的颜色的主要来源，原料和纸浆中木质素含量又是制订蒸煮及漂白 工艺条件的重要依据( 杨淑蕙主编2 0 0 1 ；b o e r j a ne ta l1 9 9 6 ；b a u c h e r e ta l1 9 9 8 ) 。 1 1 木质素概述 1 1 ，1 木质素的分布 木质素是地球上在数量上仅次于纤维素的有机物，占生物圈有机碳的3 0 ( a m t h o r2 0 0 3 ：b o e r j a ne ta l2 0 0 3 ) ，广泛地存在于较高等的维管植物门中，特别 是在木本植物中，木质素是木质部细胞壁的主要成分之一，针叶材( 裸子植物) 为2 5 3 5 ，阔叶材( 被子植物的双子叶植物) 达2 0t 扣2 5 ，单子叶植物( 禾 本科植物) 为1 4 2 5 ，而在林木中，木质素占木材干重的1 5 3 6 ( h i g u c h i 1 9 8 5 ) 。木质素仅在种子植物、蕨类植物和藓类植物等生活细胞的细胞壁内形成， 是所有维管植物的重要成分，大量存在于纤维、木质导管和管胞次生细胞壁中， 与纤维素及半纤维素一起形成植物骨架的主要成分( h i g u c h i1 9 8 5 ；h a n s - j o a c h i me t a i1 9 9 8 ；b o e r j a ne ta l2 0 0 3 ) 。 木质素属细胞次生结构，主耍贮存于细胞壁中，其结构方式和含量依不同的 植物种类、个体、组织、细胞类型、细胞层以及环境条件而变化，木质素含量不 仅存在植物种间、种内个体间的变异，而且随形态部位、细胞类型和细胞壁间层 等部位的不同而有很大变异，并受到发育和环境条件的影响( c a m p b e l la n d s e d e r o f f 1 9 9 6 ：s e d e r o f f e ta l1 9 9 9 ：h ea n dt e r a s h i m a1 9 9 1 ；c a s t 6 r ae ta l1 9 9 4 ；s a k aa n dd a i l 引言 1 9 8 5 ) 。在树体纵向分布上，木质素含量随高度的增加而逐渐降低，而在径向分 布上，针叶树的心材比边材少、秋材比春材少，阔叶树则没有显著差异：木质素 在植物细胞中的分布也不均匀，复合胞问层木质素含量较高，次生壁较低，但由 于次生壁比复合胞间层厚得多，针叶材本质素总量至少7 0 以上位于次生壁 ( c a m p b e l la n ds e d e r o f f1 9 9 6 ；b a u c h e re ta l1 9 9 8 ；h ea n dt e r a s h i m a1 9 9 1 ) 。 1 1 2 木质素的生物功能 木质素作为植物生长发育中的一种次生代谢物质，其代谢在植物细胞中发挥 着重要的生物学作用，主要表现在其合成过程中酶系活性的变化、中间产物及木 质素含量的增加，同植物发育中的细胞分化和抵抗病菌侵染等生理活动有着密切 的关系( b l a n c h e t t ea n db i g g s1 9 9 2 ；c h a b a n n e se ta l2 0 0 1 b ) 。许多环境因子如机械 损伤和病虫害等都会诱导植物细胞中术质素的合成，而植物细胞中为了机械支撑 和长距离水分运输也会合成大量木质素( v a n c ee ta l1 9 8 0 ；d i x o na n dp a i v a1 9 9 5 ) 。 木质素沉积在木质部导管和厚壁组织及韧皮部纤维中( 般沉积在这些细胞的次 生壁上) ，从而提供了细胞壁特性、机械强度和防水性等，在植物体的机械支持、 水分运输及其病虫害防御中具有重要作用( b a u c h e re ta l1 9 9 8 ；m o n t i e s1 9 8 9 ；w a l t e r e ta l1 9 9 2 ；h i g u c h i1 9 8 5 ；b l a n c h e r ea n db i g g s1 9 9 2 ) 。此外，在植物从水生向陆 生生境的适应进化过程中，木质素合成能力发挥了非常重要的作用，是适应陆地 环境的重要进化特征之一( k u b i t z i d1 9 8 7 ；d o u g l a s1 9 9 6 ) 。 因此，木质素生物合成及调节是植物生长和发育的关键因素之一，不仅提高 植物细胞壁坚固性和对病菌侵袭及机械损伤的抵抗力，而且确保木质部中可溶性 代谢物的运输，木质素在植物的生长发育和抗性方面具有重要的生物学功能 ( c a m p b e l la n ds e d e r o f f l 9 9 6 ；d o u g l a s1 9 9 6 ；w h e t t e na n ds e d e r o f f l 9 9 5 ；l e w i sa n d y a m a r n o t o1 9 9 0 ；b o r g o l i v i e re ta l1 9 9 3 ) 。 1 1 3 木质素的经济重要性 木质素的经济重要性早已被人们所认识。首先，木质素是地球上仅次于煤炭、 石油、天然气的第四大能源一生物质能源的来源之一，是仅次于纤维素的丰富的 天然有机资源，估计全世界每年可产生6 0 0 万亿t ，对木质素的利用已经成为人类 “绿色化学”最重要的研究课题之一，不仅因为木质索是可再生的植物纤维资源之 ，而且它是植物纤维所含各组分中太阳能蕴藏最高的组分，是石油的最佳替代 品( w h e r e na n ds e d e r o f f l 9 9 1 ；b a u c h e r e ta l1 9 9 8 ) 。 另一方面，以木材为纤维原料用于造纸时，木质素是影响造纸工业中纸浆产 量和质量的一个重要因素( w h e t t e na n ds e d e r o f f1 9 9 1 ；d e a na n de r i k s s o n1 9 9 2 ： 2 i 引言 b o e r j a ne ta l1 9 9 6 ) 。传统造纸业的原料是木浆，在未经处理的木浆中，含有能把 木纤维粘和在一起的木质素，木质素会使纸张发黑，在阳光的照射下会慢慢发黄、 变脆，但在制浆和造纸中除去木质素是一个极大的障碍，原因是木质素和纤维素 是构成木材组织的两大主要成分，木质素很结实，而纤维素很有韧劲，二者很难 分开，必须通过剧烈的化学处理工艺将木质素从纤维素中除去( 杨淑蕙主编 2 0 0 1 ) 。除去木质素的木材处理工序，需要消耗大量能源和使用一些有毒化学物 质，例如，在化学降解术质素工艺中普遍采用的k r a f t 制浆工艺，需要消耗8 0 0k g 的n a o h 和3 0 0k g 的n a 2 s 才能除去1 0 0 0k g 的木质素( c h i a n ge ta l1 9 8 8 ) 。在抽 提过程中，还需要一系列漂白过程，目前一般利用氯气或二氧化氯作为漂白剂除 去细胞纤维问的残留木质素，但氯气工艺产生的废弃物含有对环境有害的二嗯英 类物质，而二氧化氯工艺则成本高、能耗高，并且这些木质素抽提工序具有降低 细胞纤维长度的弊端，从而降低了纸的强度( b o e r j a ne ta l1 9 9 7a n d1 9 9 6 ：a m i n e t a l1 9 9 8 ) 。 因此，木质素的遗传改良具有潜在的重要商业价值，降低木材木质素含量或 改变木质素结构组成，使得木质素在制浆过程中更易被去除，无论是从提高纸浆 得率和质量、降低造纸经济成本还是环境保护方面，都具有重要意义。对于林木 育种者来说，目标是创造出更有利于制浆工业脱木质素的工程植株，并且其木质 素含量降低和或木质素结构改变而植物发育和抗性不受影响。然而，由于林木种 内木质素含量变异小，并且变异受环境条件的影响大，利用常规育种方法很难对 这一性状进行有效地定向改良。 近十几年来，随着遗传学、分子生物学和生物化学的发展，在木质素生物合 成有关酶编码基因的克隆和功能研究方面取得了显著进展，使得人们对木质素生 物合成途径也有了更多、更深入、更全面的认识，而木质素生物合成途径中的许 多重要酶及其编码基因的表达调控，已成为了利用转基因植物来改良木质素含量 和组成的研究热点( b a u c h e re ta l1 9 9 8a n d2 0 0 3 ；a n t e r o l ae ta l2 0 0 2 b ；d i x o ne ta l 1 9 9 6 ；s e d e r o f f e ta l1 9 9 ；g r i m a - p e t t e n a t ia n dg o f f n e r1 9 9 9 ；b o e r j a l le la l1 9 9 6a n d 1 9 9 7 ：b o u d e ta n dg r i m a p e t t e n a t i1 9 9 6 ：w h e t t e na n ds e d e r o f f1 9 9 1 ：s e d e r o f fe ta l 1 9 9 4 ；l a p i e r r ee ta l2 0 0 0 a ) 。因此，研究者尝试利用基因工程创造满足造纸原材 料特性需求的林木新品种，以这些酶编码基因作为靶基因，通过基因工程技术抑 制林木木质素生物合成途径，达到定向改良木质素含量或组成、提高造纸原料需 求特性的目的，这些相关领域的基础研究和应用研究成为当前林木木质素改良研 究的热点，目前越来越多的实验室培育出了理想的木质素改良的基因工程植株 f m e y e r m a n se ta l2 0 0 0 j o u a n i ne ta l2 0 0 0 ；h ue t a l1 9 9 9 ；k a j i r ae ta l1 9 9 6 ：l a p i e r r e e ta l1 9 9 9 ：b a u c h e re ta l1 9 9 6 b ：p i l a t ee ta l2 0 0 2 ) ，所获得的研究结果首先是基于 引苦 对木质素结构及其生物合成途径的基本认识之上。 1 2 木质素的结构和变异 木质素是由具有芳香族特性的结构单体聚合生成苯丙烷型的立体结构高分子 化合物，而苯丙烷是组成木质素的基本结构单元，在其苯环上被不同数量的三个 甲氧基所代替，产生了三种不同的木质素结构单元，一般称为木质素单体或单木 质醇( m o n o l i g n 0 1 ) ( b o e o a ne ta l2 0 0 3 ；b a u c h e r e ta l1 9 9 8 ；b o u d e te ta l1 9 9 5a n d 2 0 0 0 ；w h e t t e na n ds e d e r o f f1 9 9 5a n d1 9 9 8 ) 。这些木质素单体聚合成不同种类的 木质素，其中：愈创木基苯丙烷单元( c o n i f e r ya l c o h o l ，松柏醇) 聚合为愈创木基 木质素( g u a i a c y ll i g n i n ，g 一木质素) ，紫丁香基苯丙烷单元( s i n a p y la l c o h o l ，芥 子醇) 聚合为紫丁香基木质素( s y f i n g y ll i g n i n ，s - 木质素) ，而对一羟基苯丙烷单 元( p c o u m a r y la l c o h o l ，p - 香豆醇) 聚合为对羟基苯基木质素( p - h y d r o x y p h e n y l l i g n i n ，h 木质素) ( 见图l 一1 ，b a u c h e r e ta l1 9 9 8 ；w h e t t e na n ds e d e r o f f l 9 9 5 ) 。 2 0 h o h 对羟基苯基丙烷单元 ( 口香豆醇) p c o u m a r y la l c o h o l 聚合 木质素 0 o - r h 术质素 h - l i g n i n c h ，o h q 删， o h 愈创木基苯丙烷单元 ( 松柏醇) t o n i f e r ga l c o h o l l 聚舍 本质素一 佾 弋p o c h 3 o _ r g 木质素 g - l i g n i n 紫丁香基苯丙烷单元 ( 芥子酵) s i n a p y la l c o h o l l 聚合 本质素一 、 删少。c 心 s - 术质素 s - l i g n i n 图1 - 1 三种木质素单体结构及其聚合木质素 f i g u r e1 - 1s t r u c t u r eo f t h et h r e em o n o l i g n o l sa n d t h er e s i d u