（微生物学专业论文）绿僵菌转化16α、17α环氧黄体酮的工艺研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论绿僵菌转化1 6 仅、1 7 a 一环氧黄体酮的工 学位 硕士研究生 文题目艺研究 级别 学生学科导师 姓名 李安华微生物学吴坤邱立友 专业姓名 学位论文 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名：套辫导师签名：所彳l 日期：2 j 唧年莎月0 日日期：口7 年月o 日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。f 沦、 邕旦1 研究生签名：荟凌卒导师签名：卯砂众学院领专签名：酬1 气i = y ，1 1 1 i事建 隰j 噼例。日吼口7 年月f o 日咖。一一 致谢 在本文完成之际，我首先感谢导师吴坤教授和邱立友教授对我的悉心栽培。 两位导师渊博的知识，严谨的治学态度和谦逊豁达的为人令我终身难忘。两位 导师敏捷的思维方式，勇于创新的治学精神以及高尚的人格魅力令我终身受益。 能作为两位导师的学生，我深感荣幸! 在三年的学习和生活中，导师们的热情 鼓励和无私帮助让我难忘，谨此向我的两位导师致以最崇高的敬意和最衷心的 感谢。祝两位导师身体健康、家庭幸福、万事如意! 本研究的试验过程是在河南利华制药有限公司进行的，王明道副教授、刘 新育老师在试验设计、技术技能以及论文的撰写和修改等方面给予了大量的帮 助，他们开拓创新的思维方式，丰富的理论知识以及对科学事业的追求都给我 留下深刻的印象，这些将使我终身受益。在此表示深深的谢意! 河南利华制药有限公司生物实验室的员工刘辉、王爱香、于凤莹、赵晶晶 和发酵岗位的谭刚、李琦等在试验中给予很大的帮助，无私的提供试验便利和 配合，同时也提出了不少宝贵建议，对于他们大公无私的帮助，特此致以深深 的谢意! 。 在学校实验室做试验期间，同学李彦朋、王兰青、张小强等在试验技能和 方法上提供了不少帮助，对于他们的帮助，在此表示深深的谢意! 感谢我的家人对我的理解和支持，感谢我的爱人来秀红在生活中给予的关 心和理解! 最后真诚感谢三年来给予我无私帮助和支持的老师、同学、朋友和亲人! 祝愿他们工作顺利，生活幸福! 李安华 2 0 0 7 年6 月 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 a 、1 7 a - 环氧黄体酮的工艺研究 摘要 本课题主要实验一种新的1 6 a 、1 7 a 一环氧黄体酮转化菌种一绿僵菌，先用一般生产上 用的直接投底物法进行尝试，并对发酵条件进行优化，发现绿僵菌羟化能力很强，在2 投 料浓度下摇瓶转化率可达到7 0 左右，但在i o o l 发酵罐中放大却达不到期望的转化率，只 有4 0 左右。通过检测溶氧，发现溶解氧很低，在投底物时溶氧浓度只有3 的溶氧饱和度， 确定了溶氧是限制绿僵菌转化能力的主要因素。 为了改善溶氧，试验了静息细胞转化工艺，通过对转化条件的优化，得到了静息细胞 工艺的最优参数，以1 的量接种于摇瓶种子发酵培养基中，2 8 c ，1 8 0 r m i n 培养4 0 h 左右。 再以5 接种量将种子发酵液接种于二级培养基中，发酵条件不变，培养2 3 h 左右，过滤1 2 0 m l 发酵液的菌丝，再把菌丝投入l o o m l 缓冲溶液中，温度3 0 c ，1 8 0 r m i n ，继续转化3 0 h 。 发酵结束，转化率6 0 左右，随后在i o o l 发酵罐中放大，转化率为4 5 左右。 为了解决溶氧问题，先在摇瓶上试验，从减少菌体生物量入手，采用添加抑制剂、减 少营养、稀释菌体来解决生物量和转化率问题，发现在接种时添加1 的乙醇，可对生物 量有一定的减少作用，并且有促进转化的作用。稀释菌体可有效减少生物量，转化率也下 降较少。 对稀释菌体进行了优化和补充，形成了稀释补料工艺，工艺参数为l m l 孢子悬液接种于 l o o m l ( 5 0 0m l 三角瓶) 发酵培养基中，2 8 c ，摇床1 8 0 r m i n ，培养4 8 h 后， 将发酵液按1 ： 1 量添加无菌水稀释发酵液，然后加入2 底物，氧化8 h 、2 0 h 分别加入0 5 葡萄糖，氧化3 4 h 加入0 5 葡萄糖和0 0 5 氨水，氧化6 4 h 升温出料，生物量保持在1 0 - 1 5g 1 ，在摇瓶中的转 化率可达到7 2 左右。随后在i o o l 发酵罐中放大，转化率为5 3 左右。 关键词：甾体转化绿僵菌静息细胞稀释菌体 补料 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 a 、1 7 a - 环氧黄体酮的工艺研究 1 文献综述 1 1 甾体药物的发现 1 1 1 甾体药物介绍 甾体具有环五烷多氢菲的母环结构，结构如图1 1 。甾体激素主要包括性甾体激素和肾 上腺皮质甾体激素两大类。前者有雌激素、雄激素及孕酮等；后者主要有盐皮质激素和糖 皮质激素。甾体激素药物因具有多种生理活性和医疗用途而得到迅速发展。目前常用的已 有5 0 多种药物，成为医药工业的一大门类。据统计，其销售额仅次于抗菌素。近年来还对 其他医疗领域不断扩大应用范围，如用于心血管，抗肿瘤、利尿、麻醉、肌松以及和内分 泌有关的老年性疾病等新药不断涌现u 1 。此外，甾体激素亦开拓应用于促进家畜繁殖生长 及植物生长。甾体药物的发展方兴未艾。我国自1 9 5 8 年以来，在科研单位与生产厂家密切 协作下，甾体药物逐步发展，已形成工业生产体系，目前国际上重点品种包括性激素，皮 质激素，避孕药物，蛋白同化激素等，国内均已生产，不仅满足国内需要，并有部分出口。 2 3 1 6 1 5 图1 1 甾体环结构及各个碳位置 f i g u r e1 1s t e r o i dc i r c l es t r u c t u r ea n de a c hc a r b o np o s i t i o n 1 1 2 性甾体药物的发现 1 9 2 9 年首先发现的是雌激素，发现者之一德国科学家布特南德设想它的化学结构可能为 甾体化合物类。接着被搞清的是被命名为雄酮的雄性激素( 1 9 3 1 年) ，这是由布特南德首先发 现的，在初步分析了这种激素的结构后，他下结论认为这也是一种甾体化合物。此后，有关 科学家投人到寻找孕酮的雌性激素的工作中，最后在1 9 3 4 年3 月的一天，布德南德与他的助 手首先见到了这种物质的结晶。荷兰的拉克和他的研究小组成功地分离了最后一种主要的性 激素一睾酮( 一种更有效的雄性激素，此前雄酮被错认为是真正的雄性激素) 。三个月之内， 他们与其他研者一起确定了其结构式。从临床治疗角度上，促使人们寻找是否存在种能挽救 阿狄森氏病患者的物质，1 9 3 9 年布特南德因其出色的工作获得了诺贝尔奖眩挪。 1 1 3 肾上腺皮质甾体药物的发现 1 8 9 4 年，一位英国内科医生报道已成功地用肾上腺水提取物使他儿子的血压升高；然而 这种水提取物除了升高病人的血压外，对其它症状没有任何改善。随后发现这位英国医生的 水提取物中含有一种由肾上腺髓质产生的全新激素一肾上腺素，至此得出结论，所期望的激 2 微生物学硕士论文 绿僵茵转化1 6 a 、1 7 旷环氧黄体酮的工艺研究 素可能在肾上腺皮质中。但是用水提取方法就是不能得到有活性的皮质激素的物质。1 9 3 0 年，根据罗戈夫和斯图尔特用甘油提取的实验，斯温格尔和菲尔纳两位研究者推测，这种待 发现的激素很可能是与胆甾醇相类似的物质，不能用水提取，而且由于含量少，需要用大量 肾上腺。他们用了3 5 0 只猫的。肾上腺，用乙醇提取，终于得到有活性的提取物。一年后，乔 治索思建立，一个标准提取程序，使提取物能更安全地被临床上使用眩挪。 1 2 微生物转化甾体的发展历史 1 2 1 生物转化甾体的发现 最早发现微生物转化甾体的是b o n d z y n s k ih u m n i c k i ，他们发现在肠内胆固醇的双键被 氢化n 】，1 9 0 8 年b o n d i 研究了胆酸的代谢和各种分枝杆菌分解氧化甾醇类化合物，1 9 1 3 年s o h n g e n 发现很多微生物如诺卡氏菌、假单孢菌、分枝杆菌、棒状杆菌和节杆菌能利用甾 醇作为唯一碳源生长哺3 ，t u r f i t t 发现微生物能降解胆固醇及b 一谷甾醇成c 一1 9 甾体激素。引， 直至u 1 9 4 9 ，h e n c h 发现可的松对风湿性关节炎有突出的疗效，而且证实可的松和氢化可的松 都属于肾上腺皮质激素，才使甾体皮质激素可能成为高疗效和高经济价值的药物口1 。甾体 皮质激素开始是从动物体内提取的，这显然没有实际应用价值，于是从半合成入手，h e c h t e r 将皮质酮( c o r t e x o n ) 灌注于肾上腺，经酶的1 1b 羟基化生成皮质甾酮，这个方法曾经在工 业上短暂的应用过n 们。甾体激素结构复杂，最初从生物组织中提取获得，但其量甚微，不 能满足医疗需要。1 9 4 6 年美国m e s c k 公司的s a r e t t 等曾用二年多时间，通过3 0 多步化学反应， 由1 2 7 0 磅牛胆汁中的脱氧胆酸台成了9 3 8 毫克可的松，总收率仅0 1 5 ，无法应用于生产。在 合成过程中最大的困难是向甾体骨架的1 1 位碳原子引入一个羟基。 1 2 2 生物转化甾体技术的发展 德国生化学家h e c k e s 等用肾上腺素的组织匀浆研究成功使脱氧皮质酮转化成可的松， 证明生物的酶可以将氧原子直接引入到甾体的c l i 位上。在这一启发下，1 9 5 2 年，p e t e r s o n 和m u r r y 仓s 造性的用黄体酮经霉菌1 1q 羟基化，收率很高，然后再用化学方法1 0 步合成可的 松n 。这一方法的成功，大大简化了半合成步骤，使甾体皮质激素的工业生产向前迈进了 一大步，从可的松在1 9 4 9 年的价格每克3 0 美元，降至u 1 9 6 7 年的每克1 美元，可以看出专一性 的微生物转化反应的研究成功并应用于工业生产，对甾体激素的工业生产有多大的影响。因 此引起了微生物学家、有机化学家和药物学家们的极大兴趣，开展了大量的对微生物转化甾 体的研究n 扪，至今，已发现微生物对甾体骨架每个位置几乎都能进行羟基化反应，包括两 个角甲基c 1 8 及c - 1 9 以及其侧链，微生物除了能上一个羟基外，有时能同时上两个羟基或多 个羟基，如69 一、i ia 一及1 2b 一、1 5q 一双羟基，微生物上羟基是许多化学方法难以合成的， 脯乳动物体内细胞的酶，也只能羟化少数几个位置。美国普强公司是最早用化学结合微生物 生产糖皮质激素，然后s y n t e x ，s e a r l e ，s q u i b b ，m e r c k ，p f i z e r ，s c h e r i n g 等公司开始生产。 鉴于我国资源丰富，利用天然甾体资源改造其结构来合成甾体药物是较为经济合理， 我国利用丰富的植物资源，薯蓣皂素，番麻皂素及剑麻皂素生产大量生产甾体药物，其中微 3 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 a 、1 7 a 一环氧黄体酮的工艺研究 生物技术不断得到改进提高，形成了具有我国特色的甾体药物生产路线。从1 9 5 8 年开始，黄 鸣龙及其工作者，以薯芋皂素开环及环氧化所得中间体1 6q ，1 7a 一环氧黄体酮为底物，经 黑根酶在i ia 引入羟基，如图1 2 ，再经溴化氢开环，脱溴，上c _ 2 1 碘，置换生成乙酸可的 松，并由上海通用药厂生产n 朝，接着研制生产氢化可的松，乙酸强的松，强的松龙，地塞 米松和倍他米松等甾体皮质激素，其中乙酸强的松是国内生产量最大的皮质激素药物，产量 约占全国甾体皮质激素总产量的6 0 。 沃氏物 霉菌物 图1 21 6 a ，1 7 q 一环氧黄体酮转化反应式 f i g u r e1 2t h er e s p o n s ee q u a t i o no f1 6a ， 1 7a e p o x y p r o g e s t e r o n e 1 9 6 0 年w e a v e r 等人利用研磨得很细的黄体酮，并以t w e e n 8 0 作为分散剂，在黑根酶发酵 液中添加黄体酮的量达2 0 - 5 0 9 l ，仍然可以得到高产率的1 1a 一羟基黄体酮，同时发现丙酮、 二甲基甲酰胺、乙醇、丙二醇等溶剂，在很低的浓度下对菌体表现出一定的毒性，能干扰羟 基化作用，因此利用这类物质作为溶媒，转化率难以提高，而且w e a v e r 等人指出，由黄体酮 生成的羟化产物，并不抑制发酵的c l l 位的羟化作用，而且其他类的甾体化合物生成的羟化 产物，对发酵真菌的i iq 一羟基化却表现出抑制作用，如黑根霉羟化1 6a ，1 7a 一环氧黄体酮 生成的产物，在很低的浓度下，会抑制黄体酮以及由黄体酮生成的甾类化合物的羟化作用。 7 0 年代，随着固定化技术的发展，各国专家又开始对黑根霉、赭曲霉，新月弯孢霉等羟 化霉的固定化发生兴趣，但由于这种酶是胞内酶，而且是一复杂的酶控制体系，如果将其固 定化，反应时辅助因子( 如n a d p h ) 则需要从环境中提供，因此对于这种带有辅酶系统的复 合酶而言，研究的重点转向固定化细胞。 在多种酶系统的固定化方法中，尽管研究了菌体包埋法、交联法、共价结合法和吸附法 等多种方法，但研究最多和最有成效的是活细胞包埋法。其活性取决于载体表面、尺寸、孔 隙度及亲水性以及反应条件、固定化方式等n u 5 1 氐1 7 3 。 1 9 8 0 年m a d d o x 等人分别采用聚丙稀酰胺凝胶、琼脂凝胶和海藻酸盐包埋黑根酶菌丝，他 们发现只在琼脂和海藻酸盐海藻酸盐凝胶表现出羟化活性，且在琼脂凝胶表现的更高更快。 1 9 8 3 年，p i n h e i r o 等人同样分别用聚丙稀酰胺凝胶、海藻酸盐、环氧树脂、脂原蛋白等包埋 4 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 a 、1 7 a - 环氧黄体酮的工艺研究 赭曲霉孢子，他们还研究了单体浓度、细胞装载浓度、最适p h 值、温度和底物浓度等因素的 影响，发现经过一段正常的延迟期并使用四次后，在聚丙稀酰胺凝胶中包埋的孢子羟化能力 最强，使用十五次后，其活力降为原来活力的1 8 ，活性可以在含氮培养基上得到再生u 引。 上海第一医学院郁定坤等在实验室中也采用海藻酸钙、聚丙稀酰胺、三脂酸纤维、聚 乙烯醇、琼脂、明胶、戊二醛等包埋黑根霉菌丝，聚丙稀酰胺等方法包埋的菌丝不显示转 化能力，琼脂颗粒的机械强度差，仅海藻酸钙固定的黑根霉细胞活力回收率达6 5 ，使用 次数为1 0 次以上，以培养液作为转化物质，有利于菌体再生及辅酶的再生u 引。此外。日 本，前苏联及欧洲各国科学家们进行类似的固定化羟化反应试验，效果均较好。 d u t t a 等报道应用经活化的a s p e r g i l l u so c h r a c e u si s 的固定化分生孢子进行1 1 a 羟基化 黄体酮，固定化分生孢子保留了游离分生孢子7 9 的活性，通过营养活化后，表现出1 1 位羟 基化活性的提高，且不会有副产物产生。固定化细胞和经活化以后的固定化细胞的半衰期分 别为1 4 天和1 2 天，产率分别为1 8 7 m m o l g 分生孢子和4 1 6 m o l g 分生孢子，在固定化及活化 过程中分生孢子的p h 值和温度保持不变，在活化过程中分生孢子的萌发可用电镜观察到比引。 发展了一种新的细胞固定化技术即将聚合脲包在藻酸钙表面形成一薄层，有利于底物在凝 胶上分布，他们研究了这种固定j 比4 s p e r g i l l u so c h r a c e u s 细胞在不同有机溶剂的双相培养基 中对黄体酮的1 1 位羟基化，其中含乙酸乙酯的培养基能显著提高转化率，可能因其疏水层的 存在增加了凝胶中底物的分布。应用乙酸乙酯水双相培养基能使底物浓度从l o g l 提高到 8 0 9 l ，且转化率直线上升、其底物浓度比未使用聚合脲的固定化细胞提高了6 倍以上，这 种反应能在温和的条件下进行，具有很大的工业应用潜能比1 1 。 8 0 年代中期，一种新技术双液相发酵法诞生了，这种方法考虑到甾体化合物在水中溶解 度很小( 一般1 0 一l i o m o l l ) ，而酶转化法反应发生在水相中，因此影响转化反应的速率和 产率。意大利的e a n t o m t i 等使用了与水不相容的或微溶的有机溶媒，进行甾体转化，建立 了二相系统造成水相中含有亲水性的酶和辅酶，在有机相中含有甾体，当开始搅拌时，基质 从有机相转到水相，经酶的催化生成产物，最后又回到有机相，在反应中止时，产物在有机 相中，而酶在水相中，提取产物非常简单，只需进行简单纯化和结晶，其优点是一、简化了 分离工序。二、提高了甾体投料浓度。由于不均相的催化，可减少产物和底物对酶的抑制作 用。随着两相生物转化技术的研究，两相生物反应器的开发日趋活跃啪2 蜘1 。 阳葵等报道了磁场因子、磁化水与生长调节剂的配合使用以及磁化水处理绿僵菌 ( m e t a r h i z i u ms p ) 对1 6 a ，1 7 a - 环氧黄体酮1 1 a - 羟基化反应的效应，发现转化能力有明显改 善，其效应与添加适量极性生长调节剂( 主配方是硝基酚钠类一元酚的混合物，添加量质量 分数为0 0 2 ) 时相当。两者配合使用，有利于缩短发酵周期。磁化处理后菌种的优良特性 可在传代中保持至第3 代曙副。 阳葵等报道了采用超声因子、超声方式和时间对绿僵菌( m e t a r h i z i u ms p ) 氧化1 6 a ，1 7 a 一环氧黄体酮的影响。超声波是指频率高于2 1 0 m z 的声波，是较常规方法更有效的细化颗 5 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 a 、1 7 a - 环氧黄体酮的工艺研究 粒、增大传质表面的手段。超声波的生物学效应有：声流效应、空化效应、振动效应、触 变效应、热效应等。超声处理可分散细胞凝团并强化传质。这一过程主要发生于固液两相界 面及细胞壁、细胞膜附近的区域。超声场中的环境介质分子及细胞在超声波的作用下都处于 不断的振动，对环境介质而言。空化效应可加强其分子的扩散效应，加速体系的混匀进程， 减少各种代谢产物在液相的浓度梯度；对细胞而言，触变效应可降低其胞液的粘度，提高膜 的通透性。另外，声流效应和振动效应可使微观组分处于相对的移动及转动状态，减少了细 胞膜和液体界面处的膜传质阻力，既有利于其内部物质的向外传递，减少产物抑制作用，又 可加速液相中的底物向细胞、组织等培养物内部传递，避免底物供应的“瓶颈矧。z a b a n e h 等报道了超声处理在氢化可的松脱氢反应中的应用，发现在固定化简单节杆菌脱氢过程中结 合超声处理，转化率有明显提高。 1 2 3 生物转化甾体技术的机理 甾体微生物转化与一般的氨基酸和抗生素发酵不同，转化产物不是微生物的代谢产物， 而是利用微生物的特定的酶对甾体某一位置的结构进行改造，来获得一定的产物，换句话说， 甾体不是微生物代谢途径中起生理作用的物质， 因此甾体物质会象有机质一样被微生物代 谢成水和二氧化碳，微生物转化甾体会如下步骤进行，1 、通过扩散和接触底物进入细胞。2 、 底物在菌体内被转化。3 、转化产物被分泌出细胞啪1 。 有种看法把甾体转化看成微生物对甾体底物的解毒作用。象用简单节杆菌转化可的松 为1 ，2 一脱氢可的松，在投料浓度为l g l ，转化2 4 h 后，底物已转化完全，但产物也不见了，被 分解了，又如梨头酶转化1 1 去羟皮质醇，成氢化可的松，投料浓度为l g l ，在转化终止时， 得到的产物与其物料是不平衡的。说明有一部分已被降解破坏。诺卡氏菌能将化合物1 7 a 一 甲基- 1 7b 。一羟基雄甾一3 酮降解成二氧化碳和水。 目前对于微生物来源的羟化酶的结构特征还缺少确切的数据，研究主要采用单点突变 ( s i n g l es i t em u t a t i o n ) 的方法，来改变甾体羟化的区域和立体选择性，从而推测其“活性 位点模型”( a c t i v e s i t em o d e l e s ) ，研究表明少数氨基酸残基在甾体羟化反应的区域和立 体选择性上起着关键作用，它们可能涉及到底物的识别位点。研究还表明羟化酶微生物作用 于甾体的羟化酶是细胞色素p - 4 5 0 依赖型单加氧酶( m o n o - - - o x y g e n a s e s ) ，它可以使一个氧原 子加到底物分子中，另一个氧原子使还原型n a d h 或n a d p h 氧化产生水，其催化机制为：通过 铁卟啉环中f e 3 + 与卟啉环平面上方与水分子形成一个配位键，在正下方与酶分子中的半胱氨 酸残基的硫原子形成一个配位键，当底物结合到酶分子中时，底物取代水分子与铁卟啉环接 近，通过电子传递系统( n a d h 、f 心、f e - s 、c y t b 5 等) 将电子转移给铁卟啉环中的铁，使f e 3 + 被还原为f e 2 + ，分子氧与c y tp 4 5 0 结合，氧从铁中获得电子，f e 扣被氧化为f e 3 + ，氧合c y tp 4 5 0 再从电子传递系统接受一个电子，使氧分子的共价键弱化，最终氧分子裂解，其中1 个氧与2 个氢离子形成水离去，另一个氧使f e 3 + 氧化为f e 4 + 或f e 5 + ，后者可作为强亲电试剂进攻底物， 并促使氧与底物结合，最后酶将加单氧产物释放，同时使铁的价态恢复为f e 3 + ，酶恢复形成 6 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 a 、1 7 a - 环氧黄体酮的工艺研究 一个催化循环3 1 3 2 船3 。 1 2 4c 1 1q 羟化酶 霉菌中根霉如黑根霉、少根根霉、黑曲霉、赭曲霉、弯孢霉和克银汉霉等都能进行c l l a 羟化酶。s h i b a h a r a 等以及g o s h 和s a m a n t a 曾经研究将赭曲霉的游离细胞对黄体酮的e l la 羟基化，认为c i iq 羟基化是诱导酶。黄体酮是最有效的诱导剂，同时产生61 3 一羟化作为副 产物，c llq 羟化酶可被甲吡酮抑制，亦被c 0 及氯汞基苯甲酸酯抑制。黑根酶的c 0 抑制在 u v 4 5 0 1 出现最大吸收值。这说明羟化酶是与细胞色素p 4 5 0 有联系的氧化酶阳3 引。黑根酶在未 经诱导的线粒体部分细胞色素p 4 5 0 含量比较低，仅0 o l n m o l m g 蛋白质，经黄体酮诱导后， 可提高至0 2 - 1 n m o l m g 蛋白质。这一诱导因子显然比苯巴比妥诱导大白鼠线粒体的细胞色素 p 4 5 0 仅提高1 5 - 2 倍高的多哺1 ，对于1 1a 羟化酶的必须组成及在细胞的位置至今还不清楚。 s c d l a c z e a k 等曾经研究了细胞壁的作用。他们制备了真菌的原生质体，然后观察其对甾体的 转化，发现比完整细胞增 j i t 4 倍，所以说用原生质体来转化比整体细胞更有利口l 剐。但在 工业上大量生产时这样的操作是不经济的。 1 2 5c 1 1b 羟化酶 由于c l l1 3 一羟基是抗炎药物必需的集团的作用将e l l 酮还原成b 一羟基生成氢化可的松 才有生理活性，所以c l lb 一羟基引起了科学家的注意。z u i d w e g 分离新月弯孢霉的1 1b 羟基 化酶，他发现羟基化过程除了需要分子氧外还需要n a d p h ，但他没有发现带有亚铁原卟啉或 黄素酶嘲1 。c l l1 3 一羟基酶极不稳定，需要大量乙二胺四乙酸及s h 保护剂，其无细胞制剂的 酶活力可以被甲吡酮及对氯苯甲酸汞所抑制。m u l l e r - f r o h n c 等认为1 11 3 一羟化酶是结合在 膜上的依赖与膜结合的细胞色素p 4 5 0 系统的酶系，而且还需要n a d p h 还原酶。l i n 及s m i t h 研 究用离心2 5 0 0 0 - 6 0 0 0 0 分离到的新月弯孢霉无细胞制剂，在不存在线粒体的情况下，不能分 离到具有1 1b 一羟化酶的活力部分1 。以1 9 去甲基睾酮为底物，在无细胞抽提物内反应可得 到1 0 1 3 及1 4 a 羟化产物。从l ( m 值证实1 1 1 3 羟化、1 0 1 3 羟化及1 4 a 羟化这三种产物，是由同一 种酶产生的，而不是由不同的酶产生的。1 11 3 一羟化其上羟基的立体位置是竖直的，由于1 0 ， 1 3 角甲基的存在，1 1b 一竖键羟基的立体阻碍比1 1a 一横键羟基位阻要大。这就是1 11 3 一羟化 比1 1a 一羟化收率要低的原因，且副产物要多。 1 2 6 脱氢酶 抗炎甾体激素药物的母核c 一1 ，2 位置脱氢导入双键后，能成倍地增加抗炎作用。例如乙 酸可的松c - 1 ，2 位上导入双键生成1 ，2 一脱氢乙酸可的松( 强的松) 后，抗炎作用增力d 3 - 4 倍； 而c 一1 ，2 位脱氢的甾体激素在动物体内不能转化，这是人工改造后获得高效药物的典型例子。 化学方法脱c - i ，2 位氢一般用二氧化硒法，收率很低，且不易除尽产品中的硒。所以微生物 脱氢较化学法好。细菌的脱氢能力较真菌大，特别是棒状杆菌( c o r y n e b a c t e r i u m ) 即节杆菌 ( a r t h r o b a c t e r ) 和分支杆菌( m y c o b a c t e r i u m ) 活力最大。球形芽孢杆菌( b a c i l l u ss p h a e r i c u s ) 、 诺卡氏菌( n o c a r d i a ) 对可的松和氢化可的松也有较高的脱氢活力。此外还发现了对甾体母核 7 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 0 【、1 7 a - 环氧黄体酮的工艺研究 有脱氢活力的微生物，较多伴有降解侧链和c 一2 0 位酮基还原以及c - 9q 羟化，引起环打开等 副反应。脱氢酶亦是诱导酶。d a v i d s o n 及t a l a l a y 的早期研究，描述了从假单胞菌 ( p s e u d o m o n a st e s t o s t e r o n i ) 诱导产生可溶性c 一4 ，5 脱氢酶。他们用硫酸铵沉淀法及离子交换 树脂纯化，可提高酶活力1 0 0 倍h 。s m i t h 报道从芽胞杆菌( b a c i l l u ss p h a e r i c u s ) 、分支杆菌 ( m y c o b a c t e r i u m ) 和简单节杆菌( a r t h r o b a c t e rs i m p l e x ) 等制得具有c - 1 ，2 脱氢酶活力得无 细胞制剂，但是分离的酶制剂在工业生产中至今尚未应用。脱氢酶在脱氢过程中不需要氧分 子的存在，由于c - 1 ，2 脱氢酶比羟化酶稳定，所以在2 0 世纪9 0 年代初，3 一甾酮一c 一1 ，2 一脱氢酶 ( r s i d h ) e 。c 1 3 9 9 4 已经从多种细菌中分离成功心4 3 ，枷，如简单节杆菌( a r t h r o b a c t e r s i m p l e x ) 、假单胞杆菌( p s e u d o m o n a s ) 、诺卡氏菌( n o c a r d i a ) 、红酵母( r h o d o c o c u s ) 及分支杆 菌( m y c o b a e t e r i u m ) 等的c - 1 ，2 一脱氢酶都已分离纯化。这些细菌内的c - 1 ，2 一脱氢酶是单一的 蛋白。分子量为5 6 - 6 2 k d a 。每l m o l l 蛋白含有i m o l l 的f a d 辅基，而其天然的电子受体为维 生素k 2 。近年来由于分子生物学的高速发展及基因克隆技术的广泛应用，分子克隆技术应用 在甾体的转化方面也有一些报道，例如将简单节杆菌的c 一1 ，2 一脱氢酶的基因克隆到链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s ) 的重组质粒内使其大量地将c - 1 ，2 一脱氢酶分泌在培养液中成为胞外 酶，其酶活力比原来地简单节杆菌活力高出1 0 0 倒拍1 。而简单节杆菌的脱氢酶是胞内酶。 1 3 微生物转化甾体的一般工艺 由于微生物转化具有这样一个特点，它的产物不是微生物的代谢产物而是微生物酶催化 甾体底物后的产物，因此，通常分两个阶段进行，第一阶段是菌的培养，需供给菌体丰富的 营养，使其充分繁殖，常选用最适当的温度、p h 和通气条件培养。培养时间长短随菌种而异， 一般来说，细菌需要1 2 - 2 4 h ，霉菌需要2 4 4 8 h 完全生长。第二阶段是加入甾体底物融解在丙 酮、乙醇、丙二醇、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜等极性强的有机溶剂内，然后加至培养好的 菌液中进行转化。这种投料方式的投料浓度受到两个因素限制：一是溶剂对菌的毒性，二是 甾体在该溶剂中的溶解度。一般其浓度为2 0 0 m g l l g l ，为了使发酵工艺更经济，目前国外 的甾体微生物转化工艺趋向于高浓度底物转化，而高浓度底物转化就必须采用固体投料方 式，将甾体磨成很细的粉末直接加入。国内目前在甾体微生物转化中，用高浓度底物转化的 有乙酸可的松的脱氢，浓度为4 左右，由于甾体化合物的疏水性，在底物浓度较高时，产 物在发酵液中结晶析出，属于拟结晶发酵。 转化时由于微生物的状态不同，可分为下列4 种情况进行反应： l 、直接投底物的反应：在培养菌体的适当时间添加底物，一边继续培养，一边进行反应。 2 、由静态菌体悬浮进行的反应呻4 7 瑚1 ：在适当的培养基中，使菌体充分生长发育后，用过 滤或离心法分离菌体，将收集到的菌体，悬浮在水或适当的缓冲液中，再将甾体加入， 使其进行反应。该法有一下优点：能自由地改变反应液中的底物和菌体量的比例，与生 长培养法相比，一般能缩短反应时间，在转化的液体中杂质较少，分离纯化容易。一次 配成的静态菌株，能够在低温中保存保持其活性，故可省去多次培养反应菌的手续，使 8 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 a 、1 7 a - 环氧黄体酮的工艺研究 用过的反应菌有时还能多次反复使用。例如诺卡氏菌氧化胆固醇时，湿菌体的酶活性在 - 2 0 以下保存，能够长时间地稳定不变。 3 、混合培养进行反应m m5 1 剜j 氟羟脱氢皮质甾醇，它是一种高效皮质激素，必须用两种 微生物分别进行培养，需要用简单节杆菌进行1 ，2 脱氢，再由玫瑰产色链霉菌进行1 6 羟 化。如果用两步转化分别反应，则需要增加工作量，并延长生产周期，应用混合培养法， 即将两种菌进行混合培养，将玫瑰产色链霉菌和简单节杆菌用同一培养基进行混合养， 然后加入底物使羟化与脱氢一步转化而成，这样即省培养时间又简化抽提分离过程，亦 减少了副产物的产生口朝。用合成氢化可的松时用诺卡氏菌和蓝色梨头酶用同一培养基 混合培养，然后加入底物转化，可使氧化成酮，脱氢，氢化，乙酸酯水解，通过这四个 转化反应，可转化为氢化可的松，这是微生物转化的优点。 4 、固定化菌体或固相酶进行反应：在湿或干菌体活性比较稳定的情况下，将一次制成的菌 液进行反复使用是可能的，但迟早会因菌体自溶而失活，因此，要能长期使用，必须固 定化菌体或固相酶，使菌体与酶的活性不受影响地固定在不溶于水的载体中，新月弯孢 霉的湿菌体用化合物s 诱导后固定载聚丙烯酰胺的凝胶中，能有效进行羟基化反应，此 外还有简单节杆菌固定在聚丙烯酰胺、海藻酸和骨胶原等固化剂中的报道，活性非常稳 定，能长期的用于脱氢反应眦5 5 弱5 7 1 。另可将固相酶脱氢酶装在玻璃柱中，组成反应柱， 使反应液连续通过，能有效地进行脱氢反应。 1 4 微生物转化甾体的影响因素 1 4 1 溶氧的影响 物理因素搅拌：增加搅拌速度，可以增加溶氧及使底物均匀分散而提高转化率。通气： 增加氧气的供给。h a n i s c h 等研究了用黑根酶对孕甾酮进行1 1a 羟化反应时，通气、搅拌对 酶活力的影响，发现溶解氧对反应非常重要，而且并不是所有转化过程都是需要一样的溶氧， 而是在诱导酶的生成时溶解氧要求比较低，转化时溶解氧要求高，研究结果，最适溶解氧， 在诱导时为1 0 空气饱和度，转化时为2 1 空气饱和度嘲1 。c l a r k 等也研究了丝状梨孢霉使 化合物s 进行1 l 羟化和羟化时溶解对酶活力的影响，结果是诱导时的最适溶解氧是1 5 空气 饱和度，而转化时为3 0 空气饱和度，这样酶活力最大啷1 ，可看出溶解氧对酶反应的重要。 1 。4 2 培养基组成的影响 培养基的组成对菌的生长和转化有很大的影响。培养基中主要含有葡萄糖、玉米浆、 蚕蛹粉和硫酸铵，如果配比不协调，将会带来不利因素，在低糖时，回收甾体率高，但转 化率低，当糖浓度到一定程度时，转化率不再提高，据v e z i n c 等人研究了在缺少完全培养 基条件下，利用孢子的甾类化合物转化作用，发现添加糖类物质能加速真菌孢子进行的羟 化作用，另据资料报道，玉米浆的灰分，c a 、z n 和脯氨酸的含量与羟化作用有关，培养基 中有无玉米浆转化率明显不同。对于微生物的羟化反应，培养基中m n 2 + 、f e 2 + 、醋酸、苹果 酸盐、核黄素对转化有刺激作用，m 9 2 + 、p 0 4 对任何羟化都是必需的，二甲亚砜对1 1 位羟 9 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 a 、1 7 a - 环氧黄体酮的工艺研究 化有显著促进效果嘞1 。 氮源：无机氮，常用铵盐有氯化铵和乙酸铵等，有机氮，常用的有玉米浆、蛋白胨和酵 母膏等。 碳源：糖类，常用的有葡萄糖和蔗糖，还有麦芽糖和糊精等。 金属离子：有些酶反应需要金属离子，例如m g 和z n ，而有些金属离子会使酶失活，可抑 制其副产物的生成，例如在f e 3 + 离子存在时，玫瑰产色链霉菌转化氟羟基氢化可的松，可引 起异构化，通过加入0 5 磷酸氢盐而防止，又例如简单节杆菌转化胆固醇时，加入c 0 2 + 或n i 2 + 等金属离子可以抑制胆固醇的母核降解，而使雄甾烯双酮作为产物积累下来。 1 4 3 底物物理状态对转化率的影响 由于甾体c i i 位羟化确是孢内酶，甾体基质必须透过细胞膜才能有效转化，而甾体基质 的水溶性很差，这就限制了基质反应浓度和转化率的提高。羟化酶为胞内酶，因此整个生物 转化过程可分为酶促反应( 即扩散进入细胞的底物分子在酶催化作用下转化为产物) 和扩散 过程( 包括底物颗粒的溶解，底物分子向细胞内扩散和产物分子向细胞外扩散) 两部分。其中， 底物的溶解被认为是该过程的控制步骤哺 因此，甾体基质加入方式和物理状态对转化率有显著的影响，基质添加方式一般有下 列几种：l 基质微粒化；2 把基质制成平滑颗粒，然后加入；3 通过选择较好的分散剂， 使底物和细胞能充分悬浮均匀混合，增加有效碰撞；4 将基质先经过化学处理，有利于反 应，但反应结束后，还需要复原，所以这种反应很少采用。 ， 1 4 4 预诱导剂加入对转化率的影响 由于微生物产生的羟化酶是一种诱导酶，在发酵初期加入预诱导剂能提高酶活力，预 诱导剂一般选用基质或基质类似物，投入预诱导物的浓度和时间对诱导效果影响很大，浓 度过大，时间过早，反应影响茵体的生长和转化，据蒋昱人报道，利用梨头霉将化合物转 化为氢化可的松时，培养8 小时加入浓度为0 0 4 的底物时，其预诱导效果最佳。 1 5 绿僵菌的分类和特性 1 5 1 绿僵菌的分类 绿僵菌属( m e t a r h i z i u ms o r o k i n ) 是s o r o k i l 3 于1 8 8 3 年建立的，它隶属于真菌门 ( e u m y c o t a ) 、子囊菌亚门( a s c o m y c o t i n a ) 、核菌纲( p y r e n - - - m y c e t e s ) 、球壳菌目( s p h a e r i a l e s ) 、 麦角茵科( c l a v 括i p i t e t a c e a e ) 。自s o r o k i n 建立绿僵菌属以来，先后发表1 0 余个种。由于不同 作者采用的标准不统一，故分类状况比较混乱。目前国际上被广泛接受的分类观点是t u l l o c h 建立的，他将绿僵菌属定为2 个种，即金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌，金龟子绿僵菌包括小孢 变种和大孢变种旧1 。 1 5 2 绿僵菌的营养条件 1 5 2 1 水分 水是微生物生长必需的一种重要物质，它在微生物机体内的生理作用主要体现在一下 1 0 微生物学硕士论文 绿僵菌转化1 6 c t 、1 7 a 一环氧黄体酮的工艺研究 几个方面： ( 1 ) 水是微生物细胞的重要组成部分，占细胞总量9 0 左右 ( 2 ) 细胞内一系列生理生化反应都离不开水，水是微生物代谢过程中必不可少的溶剂，代谢 物只有先溶于水，才能参与各种反应；另外，水还直接参与某些重要的生物化学反应。 ( 3 ) 水是营养物质和代谢产物实现细胞内外物质交换的媒介。 水可控制微生物细胞内外温度的变化。由于水的比热高，又是热的良好导体，因此可 有效的吸收代谢过程中放出的热并将吸收的热迅速散发出去，避免微生物细胞内温度陡然 升高，有效的控制微生物细胞内温度，营养必须溶于水中，通过渗透才能进入细胞。细胞 膜是控制营养物质进入和代谢产物排出的主要屏障。对于生长来说，营养物质不仅要求保 证足量，而且需要保证平衡，使细胞的中间代谢产物不在细胞内积累和失调性分泌。 i 5 2 2 碳源： 绿僵菌是化能异养微生物，只利用有机碳源。碳源除了能合成代谢产物外，还要合成 细胞物质和提供能量。绿僵菌能很好利用淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类。蛋白质、脂 肪和其他有机物也能补充作为碳源。 1 5 2 3 氮源： 氮源的作用是合成细胞物质如蛋白质、氨基酸、核酸、维生素，绿僵菌能利用的很多 的有机和无机氮源，如氨基酸、蛋白质、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、氨水、尿素等。绿僵 菌在有机氮源和无机氮源同时存在时，优先利用无机氮源，无机氮源被利用后，对p h 有 影响。如n i - h 被利用后，使培养基变酸，从而铵盐称为生理酸性盐：n 0 3 被利用后使培养 基变碱，故硝酸盐称为生理碱性盐。 1 5 2 4 无机盐类 磷在核酸、磷蛋白、磷脂和许多辅酶中普遍存在，磷也参与能量代谢和许多有机化合 物的磷酸化作用。另外磷的不足会干扰氮的消化，并使维生素的合成减慢。硫是某些氨基 酸、蛋白质、维生素、辅酶的组成部分。硫可以无机盐和有机化合物提供。 铁是生物体内过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素、细胞色素氧化酶、黄素蛋白等的 组成部分，它也能激活多种酶类，参与细胞的氧化过程，因此f e 能刺激菌体生长，孢子萌 发。铜是一些氧化还原酶系的组成部分，也能激活许多其他酶，铜的络合能力很强，能与 许多官能团起反应，如羟基、多羟基、烯醇基、巯基起反应，也能与许多氨基酸、肽和蛋 白质形成络合物。锌是许多酶不可分割的组成部分或非专一性激活剂。钾是所有活性生物 体必须含有的元素，参与糖的磷酸化作用、a t p 水解作用、脱羧作用。钾能激活丙酮酸激 酶、丙酮酸羧化酶等，钾对维持细胞内渗透压也有重要作用。钾缺乏时能抑制蛋白质合成 合菌体生长。钙和镁是多种酶的激活剂和稳定剂。 1 6 研究意义： 1 6 a 、1 7 a 一环氧黄体酮上羟基是甾体合成中的关键一步，使用黑根霉转化1 6 a 、1 7 a 一 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 a 、17 a - 环氧黄体酮的工艺研究 环氧黄体酮从上世纪六十年代就开始了，在2 投底物浓度下的转化率4 0 左右，转化率 也不是很稳定，成为制约生产的瓶颈，影响的生产总量。 霉菌中许多菌种如少根根霉、黑曲霉、赭曲霉、弯孢霉和克银汉霉等都能进行c l la 羟化酶。其中绿僵菌具有很强的羟化能力，但发酵条件还没有进行摸索，本试验希望通过 优化新菌种的工艺，来替代黑根霉，提高转化率，达到降低生产成本，提高生产量的目的。 1 2 微生物学硕士论文绿僵菌转化1 6 c t 、1 7 旷环氧黄体酮的工艺研究 2 直接投底物转化法的研究 在甾体作为底物的微生物转化过程中，主要采用直接投底物转化法。这种方法是先培 养菌体，待菌体培养好后，再投入底物进行转化。该方法操作简单，发酵培养基成本低， 同时菌丝活力高，不易染菌，为大生产广泛采用。 2 1 材料和方法 2 1 1 实验仪器 l d 2 x - 4 0 型立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂 h z q q 全温振荡器 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 电子分析天平奥豪斯( 上海) 国际贸易有限公司 j a 2 1 0 0 2 型电子天平上海精天电子仪器厂 s w - c j - 2 f d 净化工作台苏州净化设备有限公司 生物显微镜日本奥林巴斯集团 霉菌培养箱上海申贤恒温设备厂 电热鼓风干燥箱天津泰斯特仪器有限公司 p h s 一2 c 酸度计上海精密科学仪器厂 数显恒温水浴锅金坛市富华仪器有限公司 可调式移液枪 上海大龙医疗设备有限公司 冷藏箱新乡新飞股份有限公司 高效液相色谱仪美国奥泰公司 1 0 0 l 机械搅拌发酵罐镇江东方生物工程公司 9 0 1 型强力搅拌器河南巩义市英峪仪器厂 t d l - 5 大容量离心机上海飞鸽 2 1 2 实验试剂 沃氏物( 1 6 a ，1 7 c t - 环氧黄体酮) 甲醇 氯仿 丙酮 乙醇 t w e e n 8 0 甘油聚醚 葡萄糖 玉米浆 硫酸铵 蚕蛹粉 氢氧化钠