（动物学专业论文）mk调节小鼠子宫蜕膜细胞凋亡的实验研究.pdf

重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 学位论文作者签名：物盎丞逊日期：趔! ! 簦堡璺主! 舅 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 论文作者签名：j 勘善盈掣l 一 指捌币鲐珥盗量： 日 期：皿竺亟塑 目录 符号说明。1 中文摘要3 英文摘要。5 论文正文m k 调节小鼠子宫蜕膜细胞凋亡的实验研究。8 前言8 第一部分m k 过表达与干扰腺病毒的制备1 0 1 材料和方法1 0 2 结果2 3 3 对论3 0 第二部分m k 对小鼠子宫蜕膜细胞凋亡作用的初步研究。3 3 1 材料与方法3 3 2 结果3 6 3 讨论4 0 全文总结4 3 参考文献。4 4 附图4 9 文献综述。5 l 致谢5 6 攻读硕士期间发表文章及参加会议5 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 a b s a b p c d n a d d a b d d h 2 0 d e p c d m e m d n a d n t p e d t a f 1 2 f b s g f p h h c g i c m l ( d k g m k m m o i m l m i n 符号说明 英文全称 a b s o r b a n c e b o v i n es e r u ma l b u m i n b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a d a y d i a m i n o b e n z i d i n e d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d i e t b y i p y r o c a r b o n a t e d u i b e c c o s m o d i f i e de a g l e m e d i u m d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d n u t r i e n tm i x t u r ef 12 f c t a lb o v i n es e r u m g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n h o u r h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i n i n n e rc e l lm a s s k i l o d a l t o n k i l o g r a m m o u s ek i l l e r m i l l i m o l m i l l i l i t e r m i n u t e 中文全称 吸光度 牛血清白蛋白 碱基对 互补脱氧核糖核酸 天数 二氨基联苯胺 双蒸水 焦碳酸二乙酯 d u l b e c c o 改良e a g l e 培 养基 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 h a m sf 1 2 培养基 胎牛血清 绿色荧光蛋白 小时 人绒毛膜促性腺激素 内细胞团 千道尔顿 千克 小鼠死亡受体 毫摩尔 毫升 分钟 重庆医科大学硕士研究生学位论文 m g o d p f u p c r p b s p m s f r p m r n a r t s e c s d s t r i s t b e t e 山 嵋 v w m i l l i g r a m o p t i c a l d e n s i t y p l a q u ef o r m i n gu n i t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h o s p h a t eb u f f e rs a li n e 毫克 光密度 空斑形成单位 聚合酶链式反应 磷酸盐缓冲液 p h e n y i m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e苯甲基磺酰氟 r o t a t i o n sp e rm i n u t e r i b o n u c l e i ca c i d r e v e r s et r a n s c r i p t i o n s e c o n d 辕f 食 核糖核酸 逆转录 秒 s o d i u md o d e c y l s u l f o n a t e 十二烷基硫酸钠 t r i s h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e三羟甲基氨基甲烷 t r i s - b o r a t e e d t a t r i 硼酸e d t a 缓冲液 t r o p h e c t o d e r m滋养外胚层 m i c r o l i t e r m i c r o g r a m v o l t w e e k 2 微升 微克 伏 周龄 重庆医科大学硕士研究生学位论文 m k 调节小鼠子宫蜕膜细胞凋亡的实验研究 摘要 胚胎着床是人类和哺乳动物生殖过程中妊娠建立的第一步，也是 决定妊娠成功与否的关键。成功的植入取决于处于接受态的子宫内膜 和具有侵入性的胚胎之间的同步协调反应。子宫内膜接受态的改变涉 及到众多基因的调控以及错综复杂的调节因子网络，其中细胞增殖与 凋亡等复杂的分子细胞事件对这一改变的顺利进行起着重要作用。 t r a i l 为t n f 家族成员，能够与死亡受体结合诱导肿瘤细胞凋亡，在小 鼠m k 为t r a i l 唯一的死亡受体，所以m k 可以诱导肿瘤细胞凋亡。蜕 膜是子宫内膜间质分化形成的一种特殊组织，蜕膜细胞具有肿瘤细胞 大核多核的特点，它对妊娠的建立和维持至关重要。已有实验证明m k 在蜕膜细胞中表达，因此推测腿可能在小鼠蜕膜细胞的凋亡过程中起 着重要作用。 目的：探讨m k 对小鼠子宫蜕膜细胞凋亡的调节作用，为胚胎着 床的分子机理补充新的证据。 方法：1 采用分子克隆技术，构建m k 重组腺病毒；2 从妊娠d 4 小鼠的子宫组织中提取基质细胞并人工诱导蜕膜化；3 免疫细胞化学 技术检测妊娠小鼠子宫蜕膜细胞感染重组腺病毒后催乳素的表达变 化；4 流式细胞术检测蜕膜细胞感染重组腺病毒后细胞凋亡情况；5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 妊娠d 4 d 鼠宫角注射m k 腺病毒，于d 8 观察着床胚胎数。 结果：1 成功构建了m k 重组过表达与干扰表达腺病毒，过表达 腺病毒滴度为5 3 x 1 0 1 1 p f u m l ，干扰表达腺病毒滴度为6 8 x 1 0 p f u m l ： 2 免疫细胞化学显示，感染m k 过表达腺病毒的蜕膜细胞的催乳素含量 减少，而感染m k 干扰表达腺病毒的蜕膜细胞催乳素含量增加；3 流式 细胞术分析结果显示，感染m k 过表达腺病毒的蜕膜细胞凋亡率增加 ( p o 0 5 ) ，感染m k 干扰表达腺病毒的蜕膜细胞凋亡率降低( p o 0 5 ) ； 4 妊娠d 4 d x 鼠宫角注射m k 过表达或干扰表达腺病毒，胚胎植入数量均 明显减少( 尸 0 0 5 ) 。 结论：1 成功构建小鼠m k 基因的重组腺病毒；2 m k 基因可以 诱导蜕膜细胞凋亡，可能在调节蜕膜细胞凋亡过程中起重要作用。 关键词：m k ，子宫蜕膜细胞，凋亡 重庆医科大学硕士研究生学位论文 m kg e n er e g u l a t e sa p o p t o s i s0 fm o u s e d e c i d u a ls t r o m a lc e l l s a b s t r a c t b l a s t o c y s ti m p l a n t a t i o ni so n eo ft h ee a r l i e s te v e n t si nt h er e p r o d u c t i o n o fh u m a n sa n dm a m m a l st h a td e t e r m i n e sw h e t h e rp r e g n a n c yw i l ld e v e l o p u p t ot e r m s u c c e s s f u l i m p l a n t a t i o nd e p e n d s o nb l a s t o c y s ti n v a s i o n ， e n d o m e t r i u ma c c e p f i v i t ya n dt h e i rs y n c h r o n i z e dd e v e l o p m e n t e n d o m e t r i a l r e c e p t i v ec h a n g e si n c l u d ep l e n t yo fc o m p l i c a t er e g u l a t o r yf a c t o r si n v o l v i n g i n r e g u l a t i n gc e l lp r o l i f e r a t i o n ，a p o p t o s i sa n do t h e rc o m p l i c a t em o l e c u l a r e v e n t s t r a i li so n em e m b e ro ft h et u m o rn e c r o s i sf a c t o r ( t n f ) f a m i l y ， a n dc a ni n d u c ea p o p t o s i so ft u m o rc e l l sb yb i n d i n gi t sd e a t hr e c e p t o r so f w h i c hm ki st h eu n i q u ed e a t hr e c e p t o ri nm i c e d e c i d u a ，t r a n s f o r m e df r o m e n d o m e t r i a ls t r o m a ，w h i c hs h a r em a n yc h a r a c t e r i s t i c so fc a n c e l c e l l ss u c h a sm a c r o n u c l e u sa n dm u l t i n u c l e u s ，i sc r u c i a lf o rs u c c e s s f u lb l a s t o c y s t i m p l a n t a t i o na n d t h em a i n t e n a n c eo fp r e g n a n c y m kh a sb e e np r o v e dt ob e e x p r e s s e di nt h ed e c i d u a lc e l l s h e r e ，m kw a ss p e c u l a t e dt op a r t i c i p a t ei n t h ea p o p t o s i so fd e c i d u a lc e l l s o b j e c t i v e s ：t op r o v i d en o v e le v i d e n c et oc l a r i f yt h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo f e m b r y oi m p l a n t a t i o n ， m o l e c u l a r c l o n g i n g ， 5 lr lrorl 重庆医科大学硕士研究生学位论文 i m m u n o c y t o c h e m i s t r y ，f l o wc y t o m e t r ya n do t h e rm e t h o d sw e r eu s e dt o e x p l o r et h er e g u l a t o r yr o l eo fm k o nm o u s eu t e r i n ed e c i d u a lc e l l s m e t h o d s ：1 t h er e c o m b i n a n tm ka d e n o v i r u sw e r ec o n s t r u c t e d ，f o r f u r t h e ra p p l i c a t i o n 2 u t e r i n es t r o m a lc e l l sw e r ee x t r a c t e df r o mu t e r u so f m i c ea td 4o fp r e g n a n c ya n da r t i f i c i a l l yi n d u c e di n t od e c i d u a l i z a t i o ni n v i t r o 3 p r o l a c t i nw a sd e t e c t e d b y i m m u n o c y t o c h e m i c a ls t a i n i n g i n d e c i d u a ls t r o m a lc e l l st r a n s f e c t e dw i t hm ko v e r - e x p r e s s i o na n ds i r n a r e c o m b i n a n ta d e n o v i r u s ，r e s p e c t i v e l y ；4 t h er a t e so fa p o p t o s i so fd e c i d u a l s t r o m a lc e l l s ，t r a n s f e c t e dw i t hm k o v e r e x p r e s s i o na n ds i r n ar e c o m b i n a n t a d e n o v i r u s ，w a s e x a m i n e db yf l o w c y t o m e t r y 5 t h e n u m b e ro f i m p l a n t a t i n ge m b r y o s i nu t e r i n eh o r n si n j e c t e dw i t ha d e n o v i r u sw a s r e c o r d e da n da n a l y z e d r e s u l t s ：1 t h er e c o m b i n a n tm ka d e n o v i r a lv e c t o r sw e r ec o r r e c t l y c o n s t r u c t e da n dt h et i t e ro ft h e o v e r - e x p r e s s i o n a d e n o v i r u sw a s 5 3x10 1 1 p f u m lw h i l et h et i t e ro ft h es m a l li n t e r f e r i n ga d e n o v i r u sw a s 6 8 1 0 1 1 p f u m 1 2 i m m u n o c y t o c h e m i c a ld e t e c t i o ns h o w e d t h a tt h ep r o l a c t i n i nd e c i d u a ls t r o m a lc e l l sd e c r e a s e da f t e rt r a n s f e c t e dw i t hm k o v e r - e x p r e s s i o na d e n o v i r u sa n di n c r e a s e dw i t hm ks i r n aa d e n o v i r u s 3 r e l a t i v ea p o p t o t i c 。p e r c e n t a g ed e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r ys h o w e dt h a ti t i n c r e a s e da f t e rt r a n s f e c t e dw i t hm ko v e r - e x p r e s s i o na d e n o v i r u sa n di t d e c r e a s e da f t e rt r a n s f e c t e dw i t hm ks i r n aa d e n o v i r u s ( p 0 0 5 ) 4 u t e r i n e 6 rllr 重庆医科大学硕士研究生学位论文 h o mi n j e c t i o no fm ko v e r - e x p r e s s i o no rs i r n aa d e n o v i r u sl e a dt o s i g n i f i c a n tr e d u c t i o no ft h en u m b e ro fi m p l a n t i n ge m b r y o sa t d 8o f p r e g n a n c yi nm i c e ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n s ：1 t h er e c o m b i n a n tm ka d e n o v i r u sw e r e c o r r e c t l y c o n s t r u c t e d 2 m ki sc a p a b l eo fi n d u c i n ga p o p t o s i so fd e c i d u a ls t r o m a l c e l l sa n di tm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei 1 1r e g u l a t i n gt h ep r o g r e s so f d e c i d u a ls t r o m a lc e l l s k e yw o r d s ：m k ，u t e r i n ed e c i d u a lc e l l s ，a p o p t o s i s 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 m k 调节小鼠子宫蜕膜细胞凋亡的实验研究 前言 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体( t n fr e l a t e da p o p t o s i si n d u c i n g l i g a n d ，t r a i l ) 是t n f 家族成员，能够通过内源性( 线粒体) 和外源 性( 死亡受体) 两种途径诱导肿瘤细胞凋亡而不会对正常组织细胞的 生长产生影响，因此近年来被认为是一种极具潜力且安全的抗肿瘤因 子。t r a i l 通过靶细胞表面的受体来执行其功能，在人类已发现有5 种t r a i l 受体嘲，d r 4 、d r 5 、d c r l 、d c r 2 y f l i o p g ( o s t e o p r o t e g e r i n ) ， 其中d r 4 、d r 5 为死亡受体，含胞内死亡结构域( d e a t hd o m a i n ，d d ) 和依赖c a s p a s e 途径的凋亡信号的识别结构。 d r 5 ( d e a t hr e c e p t o r5 ) 是1 9 9 7 年p a n 等克隆发现的含有死亡结构 域的t r a i l 受体，属于i 型膜蛋白，可与t r a i l 结合诱导细胞凋亡。近 年来发现一些抗d r 5 单抗特异性地作用于d r 5 ，与t i 认i l 一样通过细胞 内凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡【3 1 ，它既不受t r a i l 其它受体及护骨素的 影响，同时，在体内比t i m i l 更稳定 4 1 。在小鼠也发现5 种t r a i l 受体， 其中t r a i l 的死亡受体( m o u s ek i l l e r ，胍) 与人类的d r 5 是同系物， 是唯一可诱导细胞凋亡的t r a i l 受体。 蜕膜是子宫内膜间质分化形成的一种特殊组织，它对妊娠的建立 和维持至关重要。已有研究发现m k 在蜕膜细胞中表达，推测脉在小 重庆医科大学硕士研究生学位论文 鼠子宫蜕膜化过程中对蜕膜细胞的增殖和凋亡具有一定作用。本研究 构建了m k 基因过表达与干扰表达的重组腺病毒，感染人工诱导蜕膜化 的小鼠子宫蜕膜细胞，进一步研究m k 在蜕膜细胞凋亡过程中的作用， 为阐明m k 对胚胎植入的影响提供新的证据，为肿瘤的治疗提供新的视 野。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分m k 过表达与干扰腺病毒的制备 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 实验动物 清洁级昆明小鼠，6 8 w ，体量2 0 2 5 9 ，由重庆医科大学实验动物中心提供，合 格证号为【s c x k ( 渝) 2 0 0 7 0 0 0 1 】。 1 1 2 载体质粒 含红色荧光蛋白( r f p ) 的干扰表达载体质粒p s e s h u s 重庆医科大学生物化 学与分子生物学教研室提供；含绿色荧光蛋白( g f p ) 的过表达载体p a d t r a c k - t 0 4 、 a d e a s y 1 由重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室提供。 1 1 3 主要试剂 兔抗m k 抗体( s c 1 9 5 2 9 ) ：购自美国s a n t ac r u z 公司 山羊抗小鼠d a c t i n 多克隆抗体( s c 1 4 9 6 ) ：购自美国s a n t ac r u z 公司 山羊抗小鼠波形蛋白多克隆抗体( s c 7 5 5 7 ) ：购自美国s a n t a c r u z 公司 生物素化羊抗兔二抗：购自北京中山生物技术有限公司 链霉素亲和素过氧化物酶复合物：购自北京中山生物技术有限公司 d a b 显色试剂盒：购自北京中山生物技术有限公司 p m s f ：购自碧云天生物技术有限公司 r i p a 裂解液：购自碧云天生物技术有限公司 5 s d s 上样缓冲液：购自碧云天生物技术有限公司 e c l 发光试剂盒：购自碧云天生物技术有限公司 d m e m f 1 2 ( 1 ：1 ) - 购自美i n s i g m a 公司 f b s 胎牛血清：购自美国g i b c o 公司 限制性内切酶s f i i ：购自t a k a r a 公司 1 0 “。7。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 限制性内切酶h i n d i i h 购i 刍t a k a r a 公司 限制性内切酶s a i l ：购自t a k a r a 公司 限制性内切酶e c o r v ：购自t a k a r a 公司 限制性内切酶印，i ：购i ! l t a k a r a 公司 限制性内切酶p i n ei ：购e n e we n g l a n db i o l a b 公司 限制性内切酶p a ci ：购1 1 1 n e we n g l a n db i o l a b 公司 t 4d n a 连接酶：购自t a k a r a 公司 d i s p a s e 分散酶：购自上海罗氏制药有限公司 t r y p s i n 胰酶：购自美 s i g m a 公司 c o l l a g e n a s e 胶原酶：购自美i 雪s i g m a 公司 质粒提取试剂盒：购i 刍o m e g a 公司 纯化试剂盒：购l ! l o m e g a 公司 r 卜p c r 试剂盒：购自t a k a r a 公司 膜蛋白提取试剂盒：购自凯基生物发展有限公司 l i p o f e c t a m i n e r m 2 0 0 0r e a g e n t 转染试剂盒：购i 刍i n v i t r o g e n 公司 d m e m f 1 2 无酚红培养基：购自i n v i t r o g e n 公司 活性炭处理胎牛血清：购自l n v i t r o g e n 公司 预染蛋白质分子量标准：购自碧云天生物技术有限公司 非预染蛋白质分子量标准：购自碧云天生物技术有限公司 s d s p a g e 凝胶配制试剂盒：购自碧云天生物技术有限公司 r n a 提取试剂盒：购自美 i n v i t r o g e n e 公司 焦炭酸二乙酯：购自美 s i g m a 公司 琼脂糖：购自美i 虱s i g m a 公司 d n am a r k e r ：购自t a k a r a 公司 内参对照b a c t i n l 拘弓l 物由t a l ( a r a 公司合成，基因扩增片断大小为2 2 8 b p ，上游 引物为：5 - a g c c a t g t a c g t a g c c a t c c 3 ，下游引物为：5 - c t c t c a g c t g t g g t g g t g a a 3 。其他引物及干扰序列都由t a k a r a 公司合成。 1 1 4 主要溶液及其配制 ( 1 ) 0 0 1 mp b s ( p h 7 2 - 7 6 ) 重庆医科大学硕士研究生学位论文 n a c l n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 蒸馏水1 0 0 0m l ( 2 ) 5 琼脂糖电泳缓冲液 t r i s 硼酸 o 5 me d l a 蒸馏水定容至 ( 3 ) l b 固体培养基 蛋白胨 酵母粉 琼脂 n a c l d h 2 0 ( 4 ) l b 选择培养基 9 9 6 9 0 4 9 5 4 9 2 7 5 9 2 0 m l 1 0 0 0 m l 1 0 9 5 0 9 l o g 1 0 9 1 0 0 0 m l 卡那霉素( k a n a m y e i n ，k a n ) 溶于蒸馏水中，过滤除菌，终浓度为5 0 m g m l ，- 2 0 。c 保存。 含k a n 的l b 固体培养基：将配好的l b 固体培养基高压灭菌后冷却至 6 0 。c 左右，) j l * k a n 储存液，使终浓度为5 0 嵋m l ，摇匀后铺板。 ( 5 ) s d s 电泳缓冲液( 1 0 x ) 5 0 0 m l t r i s b a s e 1 5 1 9 甘氨酸 7 2 9 s d s 5 o g d d h 2 04 0 0 m l 充分溶解后定容至5 0 0 m l 。 ( 6 ) 转膜液( 用于湿转) t r i s - b a s e 5 8 9 1 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 甘氨酸 2 9 9 s d s 0 3 7 9 甲醇 2 0 0 m l 蒸馏水 6 0 0 m l 按顺序加入上述各种物质后，定容至1 0 0 0m l ( p h = 9 2 ) 。 ( 7 ) t b s t1 0 0 0 m l t r i s - h c i ( 1m ，p h = 6 8 ) 2 0 m l n a c i 8 8 9 t w e e n2 00 5 m l ( 8 ) 丽春红溶液储存液( 1 0 ) ： 丽春红 2 0 9 三氯乙酸 3 0 9 磺基水杨酸 3 0 9 d d h 2 08 0 m l 定容至1 0 0m l 。 ( 9 ) 封闭液 脱脂奶粉 5 0 9 t b s t1 0 0 m l ( 1 0 ) 考马斯亮蓝染液 甲醇45ml d d h 2 0 4 5 m l h a c1 0 m l 考马斯亮蓝r 2 5 0 0 1g 溶解后用滤纸过滤。 1 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 1 5 主要仪器 低温高速离心机 低速离心机 p c r 仪 - 8 0 低温冰箱 琼脂糖电泳仪 凝胶数字成像仪 超纯水仪 紫外分光光度计 电子天平 普通显微镜照相系统 倒置荧光显微镜 c x 4 0 倒置显微镜 湿转移仪 蛋白核酸垂直电泳系统 d y y 型稳压电泳仪 恒温摇床 t c 2 3 2 3 型二氧化碳孵箱 - 2 0 低温冰箱 1 2 方法 美i 雪s i g m a 日本h e r m l e 美国b i o - r a dg r a d i e n tc y c l e r 日本s a n y o 美国b i o r a d 美国b i o - r a d 美国e l i xm i l l i p o r e 美i 雪g e n e q u a n tp r o 上海天平仪器厂j a 5 0 0 3 日本o l y m p u s 日本o l y 口u s 日本o l y 田u s 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 江苏太仓实验设备厂 美国s h e l 1 a b 日本s a n y o 1 2 1m k i i 物与干扰序列设计与合成 根据g e n e b a n k 公布的m k 编码区序列( n m _ 0 2 0 2 7 5 3 ) ，采用引物设计软件 p r i m e rp r e m i e r5 0 设计引物。其上、下游分别加入勋j i 和砌讲i i 酶切位点，交由 t a k a r a 公司合成。上游引物：5 g a g a g t c g a c a t g g a g c c t c c a g g a c c c a g 3 ， 下游引物：5 g a a t a a g c t t t c a a a c g c a c t g a g a t c c t c 3 ，产物大小为 l 16 6 b p 。根据h t t p ：w w w d h a r m a e o n c o m s i d e s i g n 针对m k 基因设计3 个潜在的s i r n a 位点和一个随机对照序列如下表。 1 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 质粒名称核苷酸序列 1 2 2m k 基因的克隆 ( 1 ) 小鼠子宫组织的获取：将d 4 d * 鼠脱颈处死剪取子宫，用眼科剪剥离子宫角上 的脂肪后，称取子宫组织约1 0 0 m g 。 ( 2 ) 子宫组织的总r n a 提取： 1 ) 将获得的小鼠子宫组织放入1 5 m l 的e p 管中，加入1 0 m l 的t r i z o l 后，充分碾磨， 振荡混匀冰上放置1 5 m i n ； 2 ) 加入预冷的氯仿2 0 0 u l 后，12 0 0 0 r p m ，4 0 c 离心10 m i n ； 3 ) 吸取上清液3 0 0 u l 移到另一e p 管中，再加入等体积的预冷异丙醇混匀，冰上 放置2 0 m i n ，1 2 0 0 0 r p m ，4 0 c 离心1 0 m i r a 4 ) 小心移去上清，用7 5 d e p c 酒精洗2 次，每次1 0 m l ，1 2 0 0 0 r p m ，4 0 c 离一1 二, 5 m i n ； 5 ) 弃上清，空气干燥5 m i n ：溶解于1 5 u l 的d e p c 灭菌水中，储存于8 0 0 c ； 6 ) 用蛋白核酸分析仪测定r n a 的浓度与纯度：取3 0 u l r n a 样品用d e p c 水稀释 2 0 倍，进行核酸分析。r n a 样品浓度= 3 0 8 4 u g u l ，a z 6 0 a 2 s o = 1 9 1 3 。 ( 3 ) r t p c r 反应： 1 ) r t 反转录反应：按照t a k a r a 式剂盒d r r 0 1 9 a 说明书进行操作。 反应所需成分如下： 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 ) c o m p o m e n t sv o l u m v o l u m ( 1 1 1 ) 1 0 r tb l l f f e r m g c l 2 ( 2 5 m m ) d n t pm i x t u r e ( 1 0 m m ) r n a s ei n h i b i t o r a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e r a n d o m9m e r s r n a l 心j a s ef r e ed h 2 0 t o t a ls a m p l e 1 o 2 o 1 0 o 2 5 o 5 0 5 1 0 3 7 5 1 0 0 v o l u m ( p 1 ) s t e r i l ed i - 1 2 0 5 x p c rb u f f e r m g c l 2 m p c d n a p r i m e r s t a rh s d n a p o l y m e r a s e t o t a ls a m p l e 循环设置：9 4 c x 5 m i n ，1 个循环，9 4 ( 2 x 3 0 s e c ，5 0 c x 3 0 s e c ，7 2 c x l m i n ，5 个 循环，9 4 c x 2 m i n ，9 4 ( 2 3 0 s e c ，6 0 。c 3 0 s e c ，7 2 c x l m i n ，3 0 个循环；7 2 c 5 m i n 。 电泳检测：反应结束后取出反应产物5 0 u l ，1 琼脂糖凝胶电泳( 1 0 0 v ，3 0 m i n ) ， 凝胶成像。 1 6 ) 、j “ 国 2 石 m m m 2 似 l 2 l l l l 2 o 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 2 3m k 与载体质粒p a d t r a c k t 0 4 双酶切 反应所需成分如下： c o m p o m e n t sv o l u m ( 1 1 1 ) l o kb u f f e r h i n d i l l s a li s t e r i l ed h 2 0 5 0 2 5 2 5 5 0 3 5 o 5 0 o 3 7 。c 水浴锅3 h 。1 0 琼脂糖凝胶电泳( 1 0 0 v ，3 0 m i n ) ，检测是否酶切完全。 1 2 4m k 与载体质粒p a d t r a c k t 0 4 酶切产物纯化 ( 1 ) 向酶促反应液中加入3 倍量的d bb u f f e r ，均匀混合； ( 2 ) 将试剂盒中的s p i nc o l u m n 安置于c o l l e c t i o nt u b e 上； ( 3 ) 将上述操作步骤l 的溶液转移至s p i nc o l u m n ，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃滤液； ( 4 ) 将5 0 0 u l 的r i n s e a 力l ：l 入s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离，l 二, 3 0 s e c ，弃滤液j ( 5 ) 将7 0 0 u l 的r i n s e b j j l ：l 入s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离一1 二, 3 0 s e c ，弃滤液； ( 6 ) 重复操作步骤5 ； ( 7 ) 将s p i nc o l u m n 安置于新的1 5 m l 的离心管上，在s p i nc o l u m n 膜的中央处加入 2 5 3 0 u l 的灭菌蒸馏水，室温静置5 m i n ； ( 8 ) 1 2 ，0 0 0 r p m 离，i 二, l m i n 洗脱d n a 。 1 2 5m k 与载体质粒p a d t r a c k t 0 4 p s e s h u s 酶切纯化产物t 4 连接 连接反应体系成分组成如下表： 1 0t 4d n al i g a s eb u f f e r 10t 4d n a l i g a s eb u f f e r 2 5 1 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 m k 片段 p a d t r a c k t 0 4 载体 t 4d n a l i g a s e s t e r i l ed h 2 0 t o t a l m k s i r n a 片段 p s e s h u s t 4d n a l i g a s e s t e r i l ed h 2 0 t o t a l 6 0 2 0 1 0 1 3 5 2 5 0 反应条件：1 6 c 水浴反应，过夜( 1 2 - 1 6 h ) 。 1 2 6 大肠杆菌感受态细胞的制备 ( 1 ) 大肠杆菌d h 5 c t 涂布l b 平板，过夜。从l b 平板上挑取一个单茵落转到含有 5 m l l b 液体培养基的试管中，3 7 c 振荡培养8 1 2 h ； ( 2 ) 将培养物接种到2 0 0 m ll b 培养基中，3 7 1 2 培养至o d 约为0 3 至l j 0 5 ，然后置于 冰浴中2 0 m i n ； ( 3 ) 用预冷的5 0 m l 管收集茵体，4 6 0 0 0 r p m 离一0 5 分钟，弃上清； ( 4 ) 用预冷的0 1 mc a c l 2 1 0 m l 重悬菌体，4 1 26 0 0 0 r p m 离一t , 5 m i n ，弃上清； ( 5 ) 重复步骤4 ； ( 6 ) 加入预冷的0 1 mc a c l 21 0 m l 管，重悬茵体，置于4 ； ( 7 ) 立即取1 0 0 9 l 新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物； ( 8 ) 转化结束后1 4 h 左右观察转化平板，检测转化效率； ( 9 ) 取出置于4 。c 的感受态细胞，加入等体积的2 0 1 2 预冷的0 1 mc a c l 2 一甘油，混 匀后以1 5 0 9 l 管分装至2 0 1 2 预冷的无菌微量离心管中，立即置于8 0 c 保存。 1 2 7 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 ( 1 ) 取新鲜制各的或冻存的大肠杆菌感受态细胞l 管，置于冰浴5 1 0 r a i n ； ( 2 ) 加入适量质粒或连接产物，轻轻混匀，冰浴2 0 3 0 m i n ； ( 3 ) 4 2 ( 2 水浴热激活9 0 s e c ，立即转入冰浴2 m i n ； ( 4 ) 加入8 0 0 u l l b 培养基，颠倒混匀，3 7 ，1 3 0 r p m ，复苏l h ； ( 5 ) 无菌操作取2 0 0 u l 转化菌液涂布l b 卡那霉素抗性平板，3 7 ( 2 ，培养过夜。 1 2 8 菌液p c r 尽量挑取小的单个茵落，接种到1 5 m l 含卡那的l b 液体培养基中，3 7 。c 培养， 1 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 6 - 2 0 h 。取2 u l 作为模板，进行p c r 反应。反应体系成分组成如下表： c o m p o m e n t sv o l u m ( 曲 s t c f i l ed h 2 0 5 p c rb u f f c r m g c l 2 m g c l 2 心订 s e n s ep r i m e r a n t i - s e n s ep r i m e r