（微生物学专业论文）木腐真菌胞外低分子活性物质的初步研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名隧 日期：掣 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅：本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) ，论文作者签名：f 习羔垒。导师签 日期：2 型：丝! ! 三 山东人学坝i 学位论文 摘要 随着对参与木质素自然降解过程中大分子酶类研究的深入，人们发现。单 独的大分子酶类不能构成完整的木质素降勰系统，必须有一些小分子活性物质的 参与才能完成对木质素的自然降解过程。通过研究发现，自腐菌在生长过程中， 会产生一些小分子物质。这些小分子物质有的铯产生羟自由基，有的能络合铁， 有的能还原三价铁为二价铁，有的还具有类似于酚氧化酶的活性。 我们通过野外采集、分离纯化等方式，获得了大量的菌种。这其中有白腐菌， 也有褐腐菌及其它菌。以这些菌为研究的对象，我们对它们在生长过程中产胞外 活性小分子物质情况及这些小分子物质在白腐菌生长过程中是否具有普遍性等 进行了研究。在研究过程中，我们还发现了一种具有酚氧化酶活性的小分子物质， 在文献中没有完全与此相同的报道。我们视其为一种新的成份，命名为l m s 并 对其进行重点研究。 以白腐菌l g 9 为研究对像，我们发现，其在生长过程中会产生胞外活性小 分子物质，这些小分子物质有的能产羟自由基，有的能还原三价铁为二价铁。有 的能络合铁离子。以其它菌种为研究对像，结合本实验室其他人的研究工作以及 查阅相关资料发现这些小分子物质在白腐菌中具有一定的普遍性，只是菌种不 同，其产生的胞外小分子物质的种类、活性的强弱不同。但是，这些小分子物质 的具体作用还不是很清楚，仍需要进行深入的研究。与大分子的酶类相比，它们 分子量很少，具有更强的渗透能力，因此推测它们在木质素生物降解的过程中发 挥重要的作用。在木材细胞壁降解的起始阶段，白腐菌菌丝分泌这些能络合铁离 子的物质及产羟自由基的物质，弗产生一些电子供体。由于这些物质分子蠡小于 木质素降解酶类，具有更强的渗透力，进入本质纤维索物质内部，并在那里催化 单电子供体与0 2 之间的氧化还原反应产生h 2 0 2 ，并将h 2 0 z 还原为羟基自由 基，羟基自由基作用于木质纤维素，使其结构破坏降解，打开术质索降解酶类进 入木材纤维s 2 层的通道，导致更强的木质索降解。因此，木腐真菌胞外小分子 活性物质在木质素降解体系中的作用值得深入研究。 对l m s 进行研究发现，在所有被作为研究对象的菌当中，凡是产漆酶的白 腐菌均产l m s 。因此。推测这些具有酚氧化酶活性( p o 活性) 的物质在产漆酶 的白腐菌中具有定的普遍性，且它们的用作与漆酶有关，它们与漆酶一起，在 山东人学颤i 学位论文 术质索的生物降解过程中共同发挥重要作用。结果显示：菌种不同，所产此类物 质种类不一样，有的菌只产一种，有的菌产两种，而有的菌则产三种或更多；菌 种不同，所产此类物质的活性也不一样。此类物质活性大小与各菌所产漆酶活性 大小相关比较发现，漆酶活性高的菌，所产此类物质活性不一定高，而漆酶活性 低的菌所产此类物质活性不一定低。有的菌产的这类物质氧化2 ，6 d m p ( 2 ， 6 - 二甲基酚) 的活性与此菌所产漆酶相差不大，如y d h s d 2 ，而有的菌产漆酶 活性很高但是此类物质活性很低，如y d h s d l 、真姬等。对此类物质活性大小 随培养时间的变化进行测定，与漆酶活性大小随培养时间的关系进行比较发现， 此物质活性随漆酶活性的出现而出现，漆酶活性达烈最高时其活性也达到最高， 随漆酶活性的降低而降低。各被试菌这类物质的产羹都非常低。 综上可以推测此类具有酚氧化酶活性的物质似乎是人们正在致力寻找的漆 酶的自然介体。对其值得进一步深入研究。 以l e n t i n u s l e p i d e u s ( 洁雕香菇) 所产的l m s 粗品为研究对象，对其在h p l c 上的分离纯化条件进行了摸索发现在现有条件下，l m s 在5 0 0 m m x8 m m s h o d e x p r o t a i n w o - 8 0 3 分离效果较好，以纯水作为流动相，流速为i m u m 较为 适宜。 以l e n t i n u sl e p i d e u s 所产的l m s 粗品为研究对象，对其部份性质进行了研 究。发现其主要有1 6 种氨萋酸组成，且在2 5 4 n m 处有吸收峰。而且含有铁、 铜、锰等金属离子。此l m s 在一定浓度的金属螯合剂e d t a 存在时，氧化2 ， 昏d m p 的活性受影响不大，说明这些金属元素是以化学键结合予分子当中而不 是一般的物理吸附。通过c a s 试验，发现此物质还具有一定的络合铁能力。此 物质氧化2 ，昏d m p 的最适p h 值为4 0 - 4 8 ，这正是真萄生长所需的环境，可 进一步推测它在真菌生长过程中对本质素进行降擎时发挥着重耍作用。在p h 傻 为4 8 的醋酸醋酸钠缓冲液长期冷冻保存对些特质活性没有影响。其氧化 d m p 的最适温度为7 0 ( 2 ，通过实验还发现其结构具有一定的热稳定性。但是， 冷冻干燥却能使其失活。 以l e n t i n u sl e p i d e u s 所产的l m s 租品为研究对象，研究了其对愈刨木酚、 3 4 d m p ( 3 ，4 二甲基酚) 、3 ，5 - d m p ( 3 ，5 - - 甲基酚) 、2 ，昏d m p 、1 ，2 ， 4 三甲基苯、1 ，2 ，3 三甲基苯、香草醛、丁予香酚、紫丁香醛联氮、3 ，5 - z 羟基甲苯及v a ( j 1 荜芦薛) 镶：畿藤的氧化情况。发现l m s b 对愈创术酚、3 ，4 - d m p 、 2 山东人学颟i l ：学位论史 2 ，6 - d m p 、紫丁香醛联氮有氧化作用且对这几种物质的氧化不需要h 2 0 2 的参 与而是单独进行。对香草醛、1 ，2 ，3 三甲基苯及v a 无明显作用，而对1 ，2 ， 4 三甲基苯、丁子香酚及3 ，5 二羟基甲苯是否有作用还有待进一步研究。 另外其它研究人员也发现了具有酚氧化酶活性的小分子物质，如l m m c 。经 过比较后发现，我们的l m s 与l m m c 有相似，也有不同相似之处在于；l m s 与l m m c 的分子量缀相近；l m s 除了眨氧化2 ，6 - d m p 之外。与l m m c 一样， 还能氧化其它漆酶底物：都具有较高的最适作用温度及较高的热稳定性：都台有 f e 等金属元素不同之处在于：具有不同的最适作用p h 值及p h 稳定性；就目 前的实验结果来看l m s 含有氨基酸似乎属于肤类，而l l m c 不含氨基酸，其结 果类似于h y d r o x a m a t ：l m s 具有一定络合铁的能力，而u m c 不能络合铁； 特征吸收波长不同。 关键词：自腐菌，胞外活性小分子，酚氧化酲活性。羟自由基 坐兰叁兰竺! ：兰些堡塞 a b s t 队c t a c c o m p a n yw i t h t h e l u c u b r a t i n g o ft h e e n z y m e s i n v o l v e di n l i g n i n d e g r a d a t i o n p e o p l ef o u n dt h a tt h ee n z y m ea l o n ec o u l d n tf o r ma ni n t e g r a t e d l i g n i nd e g r a d a t i o ns y s t e m s o m ee x t r a c e u u l a rl o wm o l e c u l a rs u b s t a n c e s 。 w h i c hh a v es p e c i a la c t i v i t y , m a yt a k ev e r yi m p o r t a n tr o l ei n l i g n i nd e g r a d a t i o n p r o c e s s r e s u l t so fr e s e a r c h e ss h o wt h a tw h i t e - r e tf u n g ic a np r o d u c es o m e e x t r a c e l l u l a rl o wm o l e c u l a rs u b s t a n c e sd u d n gt h e i rg r o w i n g s o m eo ft h e s e l o wm o l e c u l a rs u b s t a n c e sh a v et h ec h a r e c t e d s t i co fs i d e r e p h o r e ，s o m eo f t h e mc a np r o d u c eo h ( h y d r o x y lr a d i c a l ) a n ds o m eo ft h e mc a nr e d u c ef e 3 + i of e 2 + al o to f f u n g ih a v eb e e nc o l l e c t e da n di s o l a t e df 怕mt h e w i l db yt h es t u f fo f o u rl a b s o m eo ft h e ma r ew h i t e - r o to rb r e w n - r o tf u n g i u s i n gt h e s ef u n g i ，w e r e s e a r c h e dt h e i rp r o d u c i n go ft h o s ee x t r a c e l l u l a rl o wm o l e c u l a rs u b s t a n c e s t h a th a v es p e c i a la c t i v i t yd u d n gt h e i rg r o w i n g ，t h o s es u b s t a n c e s c a t h o l i c i t yi n t h o s e f u n g ia l s ow e r ed i s c u s s e d d u r i n g o u rr e s e a r c hp r o c e s s 。w ef o u n dak i n d o fe x t r a c e l l u l a rl o wm o l e c u l a rs u b s t a n c ew i t hp h e n o i o x i d a s ea c u v 沁j ( p o a c t i v i t y ) i t sc h a r a c t e r i s t i c so fp oa c t i v i t yw e r es i m i l a rw i t ht h a to fl a c c a s e t h e r ea r ef e wr e p o r t sa b o u tt h i sk i n do fs u b s t a n c ei nr e l a t i v er e s e a r c hp a p e r s w e r e g a r d e d i ta sak i n do fn e w c o m p o s i t i o n n a m e di ta st h el m s a n dw ed i d ad e e pr e s e a r c ht oi t u s i n g w h i t e - r o tf u n g u sl g - 9 ，w ef o u n dt h a ti tp r o d u c e ds o m ee x t r a c e l l u l a r i o wm o l e c u l a rs u b s t a n c e s s o m eo ft h e s ei o wm o l e c u l a rs u b s t a n c e sc o u l d c h e l a t em e t a l 。s o m eo ft h e mc o u l dp r o d u c eo h a n ds o m eo ft h e mc o u l d r e d u c ef e 3 t of e 2 + u s e i n gt h eo t h e rf u n g ia n dc h e c k i n gr e l a t e dd a t aw e f o u n dt h ep r o d u c i n go ft h e s ee x t r a c e l l u l a rw e r eu n i v e r s a li nw h i t e - r o tf u n g i b u t t h ec a t e g o r i e sa n da c t i v i t i e so ft h e s el o wm o l e c u l a rs u b s t a n c e sp r o d u c e db y d i f f e r e n tf u n g iw e r ed i f f e r e n t t h ef u n c t i o no ft h e s el o wm o l e c u l a rs u b s t a n c e s w e r en o tv e r yc l e a ry e t i ts t i l ln e e d sd e e pr e s e a r c h c o m p a r i n gw 确n o r m a l e n z y m e s 。t h e i r m o l e c u l a rw e i g h t sa r e v e r yl o w s ot h e y h a v e s t r o n g e r p e r m e a t i n ga b i l i t y t h e r e f o r ew e c a l c u l a t e dt h a tt h e yp l a i e dav e r yi m p o r t a n t r o l ei nt h el i g n i nd e g r a d a t i o np r o c e s s i nt h es t a r ts t a g eo ft h ed e g r a d a t i o no f w o o dc e l lw a l l t h ew h i t e - r o tf u n g is e c r e t e dt h o s el o wm o l e c u l a rs u b s t a n c e s a n ds o m ee l e c t r o n i cd o n o r s t h e yh a ds t r o n g e rp e r m e a t i n ga b i l i t ya n dc o u l d 一 坐奎叁兰竺! ：竺堡堡兰 e n t e ri n t ot h ew o o dc e l la n de a t a i y s t e dt h er e d o x - r e a e t i o nb e t w e e n t h ed o n o r a n d0 2t h e r et oc r e a t e dh 2 0 2 t h e nt h eh 2 0 2 w a sr e d u c e dt oo h t h eo h r e a c t e dw i t hc e l l u l o s ea n dl i g n i no fe e l lw a l ia n dm a d l j t sc o n s t r u e t i o f tb r o k e n d o w n t h er e a c t i o n so p e n e da g a t et h r o u g hw h i c h t h ee n z y m e sc o u l dg e ti n t o t h es 2l a y e ro fw o o df i b e ra n dc a u s et h es t r o n g e rl i g n i nd e g r a d a t i o n s ot h e r o l eo ft h el o wm o l e c u l a rs u b s t a n c ep r o d u c e db yw o o d - r o tf u n g id e s e r v e s d e e p l yr e s e a r c h i n g t h er e s u l l ss h o w nt h a tt h e f u n g iw eu s e d w h i c hc o u l dp r o d u e oi a c c a s e ， a l w a y ss e c r e t e dl m s s ow ec a l c u l a t e d t h a tw h i t o - r o tf u r i g i w h i c hc o u l d p r o d u c ei e i c r , , a s e ，p r o d u ce dl m sw i s e l y a n dt h e s e l o w m o l e c u l a rs u b s t a n c e s w i t hp o a c t i v i t yh a v es o m e t h i n g t od ow i t ht h el a c e a s e t h o ym a y p l a i dav e r y i m p o r t a n tr o l ei nt h el i g n i nd e g r a d a t i o np r o c e s s w i t ht h ei s 4 c e a s ot o g e t h e r a n d w ea l s of o u n dt h a td i f f e r e n tf u n g ip r o d u c e dd i f f e r e n tk i n d so fi m s s o m eo f t h e mp r o d u c e do n ek i n do fl m sb u ts o m eo ft h o mc o u l dp r o d u c et w oo rm i t r e k i n d so fl m s a n dt h ea c t i v i t i e so fl m sp r o d u c e db yd i f f e r e n tf u n g ia r ea l s o d i f f e r e n t t h ea c t i v i t i e so fi m sh a v es t r o n g 悖i a t i v i t yw i t ht h a to fl a e , c a s o w e d e t e r m i n e dt h ea c t i v i t yv a r i a t i o no fl m sa l o n gw i t ht l a er i s i n go fc u l t u r i n gt i m e a n dc o m p a r e dw i t ht h ev a r i a t i o no fi a c c s s e w of o u n dt h a tt h ea e t i v h yv a r i a t i o n r u l eo fl m si st h es a m ea st h ea c t i v i t yv a d a t i o nr u l eo f1 8 c c l s e 。l 。e w h e nt h o a e t 腑yo fl a c c a s eg e ti t sp e a k v a l u et h ea c t i v i t yo f sa l s og e ti t sh i g h e s t p o i n t 。a n dw h e n t h ea c t i v i t yo fl a e e a s ed i ed o w nt h ea c u v 比yo fl m s f a d ea w a y a tt h es ：a w l et i m e b u tt h ea c t i v i t yo fl m s p r o d u c e db yf u n g u s w i t hh 电hl a e e a s e a c t i v i t yi su n c e r t a i nh - 叼h i nt h eo t h e rh a n dt h ea c t i v i t yo fl m sp r o d u c e db y f u n g u sw i t hl o wl a c c s s ea c t i v i t yi su n c e r t a i nl o w 1 1 1 ea c t i v i t i e so f s o m el m s a r oa l m o s ta sh i g ha si t sl a e e a s ea c t i v i t yo ft h es a m ef u n g u s s u c ha s t h ol m s p r o d u c e d b y t h o f u n g u sy d h s d l a n dz h e n j l 1 y i e l d so fi m so fa l lf u n g ii n f r o ma l ia b o v ow ec o u l dc a l c u l a t ot h a tl m sw e r es o m e t h i n gl i k e t h e n a t u r a ll a c c a s em e d i a t o rs u b s t a n c e st h a tp e o p l ea l ec o n c e n t r a t i n g0 1 1 t h e y a r ed e s e r v e dt h of u r t h e rr e s o a t e h i n g u s i n gl m s f r o ml e n t i n l e p i d o u sw er e s e a r c h e dt h ee o n d i l i o nn e e d e d f o ri t s p u r i f i c a t i o n 0 1 3h p l c u n d e rt h ec u r r e n tc o n d i t i o n 。帅f o u n dt h a tt h e p u d f i c a t i o ne f f i c i e n c yw a s b e s tw h e n 、 坶u s e d5 0 0 1 t i i t tx8 r a ms h o d o xp r o t a i n ， 山东人学础i 学位论文 w s 一8 0 3a st h ei s o l a t i n gc o l u m no nh p l ca n di tw a se l u t e dw i t hd i s t i l l e da n d d e i o n i z e dw a t e r , t h ef l o wv e l o c i t yw a s1m l m w ed e t e r m i n e dt h eq u a l i t i e so fl m sf r o ml e n t i n u s l e p i d e u s i tc o m p o s e d o f16k i n d so fa m i n oa c i d sa n di t s a b s o r p t i o ns p e c t r ao b t a i n e df o rp a r t i a l l y p u n f i e dl m s d i s s o l v e di nb u f f e ro fa c e t i ca c i d ( p h 4 8 ) s h o w e do n ea b s o = p t i o n b a n do n l ya ta r o u n d2 5 4 n m t h ed e t e c t i o no fm e t a i o n so fl m sr e v e a l e dt h e p r e s e n c eo fi r o n m a g n e s i u m c o p p e ra n dm a n g a n e s ei n t h ec o m p o u n d a c e r t a i no fc o n c e n t r a t i o no fm e t a ic h e l a t o r , e d l a d i d n ta f f e c tt h ea c t i v 时o f l m sf o rt h eo x i d a t i o no f2 6 d m rt h ec h a r a c t e r i s t i cd e t e r m i n a t i o no f s i d e r o p h o r eo fl m s w a sc a r r i e do u t u s i n gt h e u n i v e r s a lc a sa s s a y w e f o u n d t h a ti tr e a c tw i t hc a s p o s i t i v e l yw i t h i naf e w h o u r s w ea l s of o u n di t so p t i m u m p hi s aw i d ea n da c i d i ca c i dr a n g e ( 4 0 - 4 8 ) f o r2 , 6 d p mo x i d a u o n t h e o p t i m u mt e m p e r a t u r ef o r2 6 一d m po x i d a t i o nb yl m s w a sr e a c h e da t7 0 c d u n n g1 h o u ro fi n c u b a t i o na t7 0 c ，t h ec o m p o n e n tr e m a i n e dc o m p l e t e l y s t a b l e t h el m ss h o w e dah i g ht h e r m o s t a b i l i 似b u td e h y d r a t i n gb yl y o p h i l i z i n g c a nm a k ei t sp o a ：c t i v i t yd r o p p e dq u i c k l y 0 u rr e s u l t ss h o w nt h a tt h el m sf r o ml e n t i n u sl e p m e u sc o u l do x i d a t e g u a i a c 0 1 3 ，4 d m r2 6 - d m pa n ds y d n g a l d a z i n e ，t h e o x i d a t i o nf o rt h e s e c o m p o n e n t s r e e d n tt h e h 2 0 2 i tw a su n c e r t a i n i fl m sc a n o x d i a t e l ，2 。4 一t d m e t h o x y b e n z e n e ，i s o e u g e n o l a n d d i h y d r o x y t o l u e n e i t c o u l d n to x i d a t ev a n i l l ya l d e h y d e 。1 2 ，3 - t d m e t h o x y b e n z e n ea n d v a t h eo t h e rr e s e a r c h e r sa l s of o u n ds o f n ej o wm o l e c u l a rs u b s t a n c e sw i t hp o a c t i v i t y , s u c ha sl m m c c o m p a r i n go u r l m sw i t hl m m s ，w ef o u n dt h a ts o m e c h a r a c t e r so fl m sa r es i m i l a rw i t ht h ec h a r a c t e r so fl m m c ，b u t t h e r ea r em o r e d i f f e r e n c e sb e t w e e nt h et w og e m p o n e n t s t h e ym a yh a v es i m i l a rm o l e c u l a r w e i g h t ；b o t ho f t h e mh a v eh i g ho p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dh i g ht h e r m o s t a b i l i t y ： b o t ho ft h e ya r er e v e a l e dt h ep r e s e n c eo fm e t a li o n b u tt h eh a v ed i f f e r e n t o p t i m u mp ha n dp hs t a b i l i t y t h e r ea r en oa m i n o a c i d si nt h ec o m p o n e n to f l m m c t h el m m cc a r t tc h e l a t ei t o n 。l m s a n dl m m ch a v ed i f f e r e n t a b s o r p t i o nb a n d s k e y w o r d s ：w h i t e r o tf u n g u s ，e x t r a c e l l u l a rl o wm o l e c u l a ra c t i v i t ys u b s t a n c e p o a c t i v i t y ( p h e n 0 i o x 村a 3 ea c t i v i t y ) 。a n dh y d r o x y lr a d i c a l 6 坐查生兰壁! ：兰丝堡苎 第一章木质素生物降解过程中木质素一介体反应系统的研究进展 木质索是一种具有复杂而不规则三维网状结构的高聚物。它的结构基本单元 是苯基丙烷，靠多种不同的碳- 碳键和醚键连接而形成一种生物大分子物质，它 是水不溶性的。植物木质化组织中含木质素2 0 - 3 0 本质索与纤维素和半纤 维素之间具有物理或化学结合，使植物的机械强度提高。白腐真菌以及某些细菌 可将木质素彻底降解，使有机碳变成无机碳返回自然晃碳循环圈。木质素的含量 仅次于纤维素，到目前为止尚未被很好的利用，很久以来人们对于用真菌在制浆 造纸工业中进行木质素降解和生物漂白方面做了许多实验和努力，然而要想得到 令人满意的木质素降解。必须经过长时间的培养，这与现有的制浆和漂白工艺不 相容。而且，与传统的化学漂白或酶处理比较起来，对活韵有机体的控制也很不 方便。使用木质素酶系统替代真菌培养进行制浆漂白，被认为是技术上可行的， 它的应用不需要对现有的工艺流程做大的改动。 1 木质素降解酶系统 1 1 主要的木质素降解酶 目前发现的最主要的木质素降解酶是本质素过氧化物酶( l i p ) 、锰过氧化物酶 ( m n p ) 和漆酶( 1 a c c a s e ) ，但其它咐酶类如纤维二糖醌氧化还原酶、纤维二糖脱氨 酶、乙二醛氧化酶、葡萄糖氧化酶( 葡萄糖1 氧化酶和葡萄糖2 - 氧化酶) 、藜芦醇 氧化酶和一些酯酶也参与了木材的自然腐烂这一复杂的过程。 1 2 关于术质素酶，介体系统 2 0 世纪8 0 年代，相继发现木质素过氧化物酶( l i p ) 和锰依赖过氧化物酶 ( m n p ) 使术质素降解酶类研究引起广泛兴趣。研究发现包括漆酶( l a c c a s e ) 在内的木质素降解酶因尺寸太大而似乎不能透过细胞壁，酶只有在广泛的脱木质 素之后才能进入到木材纤维的s 2 层1 1 j 。对于术材中孔径大小的测量是对这些观 察的很好的支持 2 1 。这似乎表明木质索生物降解过程中，酶与木质紊之间需要电 子传递介体物质参与作用。 很长一段时间以来，很多人认为单一的木质素酶就可以对木质索进行降解作 用。但是，使用单一的m n p 3 、l a c c a s e 和l i p 嘲或l i p 鞠进行纸浆漂白却观察不 坐查叁堂竺! ：兰丝堡兰 到广泛的卡伯值的降低和浆自度的提高。说明一些活性成分的丢失和单一的酶不 能模仿完整的术质素生物降解系统。 使用特别的设备将培养液用膜过滤以除去茁丝，发现滤液能使硫酸赫浆脱木 质素恻。表明对于漂白来说，真菌与纤维的接触不是必须的，而是真菌在生长过 程中产生一些氧化酶和一些低分子量的化合物共同导致了一个缓慢的、连续的木 质素降解过程。通过大小排阻色谱和木质素降解酶免疫标记实验发现，活性成份 可能是小分子物质而不是酶删。 次级代谢产物藜芦醇( v a ) 在木质素降解培养中的发现，使人们进步假设 一个小的可以扩散的氧化剂( 即阳离子自由基) 在木质素的氧化过程中是一个很 重要的因子。1 9 9 5 年，一个由藜芦醇间接介导的l i p 对酚的氧化机制被提出【9 】。 但是许多木质素降解菌不分泌l i p 而只分泌m n p h0 1 ，这说明还存在其它的机制。 比较l i p 、辣根过氧化物酶( h r p ) 和l a c c a s e 对各种甲氧基苯的氧化发现，它 们对非酚型物质的氧化都是由阳离予介导的，弗且以一种相似的方式产生醌类物 质和甲基醇而对非酚型物质进行氧化1 1 1 】。 能够支持介体假说的一个很好例子是m n p ，它将m n 2 + 氧化成m n 3 + ，m n 3 + 再作为可扩散的氧化剂对有机底物进行单电子氧化。值得注意的是，l i p 在有丙 二酸和草酸存在的情况下也能使m n 2 + 氧化生成m n 3 + 。在有适当的酚型底物存 在时，各种漆酶也能使m n 2 + 氧化生成m n 3 + 旧。 用t m m e 蛔v e 倦f c ：o 吖突变株进行实验发现【1 3 l ，不产生或只产生低活力的 漆酶和m n p 的突变株不能使浆漂自或脱木质素；通过控制产酶条件，改交漆酶 与m n p 比活进行的实验发现，提高漆酶活性同时降低m n p 活性，只有脱木质 素被提高而甲醇产量和自度没有改变；降低漆酶的活性而提高m n p 的活性则导 致木质索脱除的降低和较低的白度的提高；随着漆酶活性提高而m n p 活性不变， 可以提高木质素脱除而对白度和甲醇产量没有影响；与亲本相比。一株只分泌 6 0 活性的漆酶和7 0 活性的m n p 的菌株木质索脱除效果最好，甲醇产量和白 度没有改变：添加纯化的m n p 只能部分的恢复漂白作用。说明漂白脱本质素不 仅仅取决于m n p 和l a c s e 。这为介体假说提供了证据。 一些螯合剂、羟自由基和藜芦酵已被假设为自然发生的介体，但是关键的化 学物质似乎还没有发现和定性。虽然对起关键作用的化舍物的化学本质、种类和 数量的了解还不确切，但缀明显的是木质素的自然降解过程依赖于酶和介体存 0 一一 ! ! ! ：叁兰：丝! ：兰垡堡兰 在a 确定这些物质可以指导进行人工模拟术质素的自然降解过程从而有望有效 解决目秘的制浆造纸工业与环境的冲突等阀题。通过优化筛选介体化合物，漆酶 介体系统在脱木质素方面已达到可与无元素氯漂白浆相似的效果。近几年来利用 漆酶介体体系在有氧存在的的情况下，已经取得了较好的木质索脱除效果。 2 漆酶介体系统及其运用 漆酶首次被发现是在1 8 8 3 年i ”。真菌漆酶是在1 9 世纪9 0 年代年被发现的。 漆酶广泛地分布于高等植物和真菌，如：a g a r i c u s 、p o d o s p o r a ，、r h i z o c t o n i a 、 p h o l i o t a ，p l e u r o t u s ，n e u r o s p o r a ，a s p e r g i l l u s ，f u s a h u m 、s c h i n u s r i g i d o p o r u s 、b o t r y t i s ，s c h i z o p h y l l u m 、c e r r e n a ，p h l e b i a ( s y n m e r u l i u s ) 、 州c u a r i a 、p y c n o p o r u s 、j u n g h u h n i a 、l e n t i n u s 、a r m i l l a r i a 、m o n o c i i u m 、 f o m e s 、r u s s u l a 、l e p t o p o r u s 等。 具有酚氧化酶活性的漆酶类型在细菌中很少发现，目前为止只在 s t r e p t o m y c e sg a l b u s i 5 l 和a z o s p l 驴i l l u ml i p o f e m m l 司中有发现。 漆酶能氧化0 和p 联苯酚、氨基苯酚、多酚、多胺、木质素化合物、抗坏 血酸、一些无机离子和芳香胺。在真菌脱术质素中。漆酶具有催化脱羧、脱甲基 和脱甲氧基作用。漆酶被许多能够与铜接合位点相互作用的阴离子如叠氮化物、 氰化物、氰硫基和氟化物所抑制。因为这些试剂能置换漆酶活性位点上的铜，从 而可逆地抑制了酶的活性。关于漆酶的性质、基因及其克隆人们已经作了大量的 研究并取得了很多的成果，对于漆酶介体的分离、参与木质素自然降解过程的化 合物的研究则越来越受到关注。 已有研究结果认为，有效的介体是一些带有n - o h 基团的n - 杂环物，如1 - 羟基苯并三唑等。n o h 基团是介体的关键组成部分。某些过渡金属络合物能作 为漆酶的介体，介导漆酶对纸浆进行脱木质素和漂白1 1 7 】。 2 1 漆酶介体系统的动力学研究 研究漆酶，介体系统的动力学，有助于我们对漆酶，介体系统作用机理的研究。 以a b t s ( 2 ，2 - 联氮二( 3 乙墓并噻唑- 6 - 磺酸) 作为介体。研究漆酶催化的 氧对藜芦醇的氧化发现此反应为假一级反应。反应的速率常数取决于介体与底物 9 山东大学硕t 学位论文 的比值，当介体与底物的摩尔比为0 1 5 时达到最大值。介体在此反应中参与了 竞争反应。当介体与底物的摩尔比值低于o 1 5 时，介体主要作为漆酶的激活剂。 随着a b t s 浓度的增加，它会与原始底物竞争漆酶的活性中心，抑制漆酶对藜 芦醇的氧化。从而增加了氧化介体对藜芦醇的氧化作用【。以a b t s 作为介体， 研究漆酶催化藜芦醇氧化反应的耗氧量发现，需氧量动力曲线由两个阶段组成。 在起始阶段，藜芦醇主要被氧化成相应的阳离子。此时耗氧量曲线呈现出假零级 反应速率规律。耗氧量与a b t s 的浓度有关，每摩尔a b t s 消耗0 2 5 摩尔的氧 气。在后一阶段，藜芦醇主要被氧化成藜芦醛。耗氧量曲线呈现出假一级反应速 率规律。耗氧量与藜芦醛产量之间成线性关系。每形成一摩尔藜芦醛消耗氧气 o 4 2 摩尔i 。 比较了a b t s 和h o b t ( 1 羟基苯并三唑) 在氧化2 1 4 二甲氧基苄醇( d m b a ) 为2 4 二甲氧基苯甲醛( d m a ) 过程中的情况发现，以a b t s 作为介体时，介 体系统的反应明显地分为两个阶段。根据反应动力学曲线，氧化剂是a b t s 双 阳离子( a b t sd i c a t i o n ) 而不是酶。氧化态的a b t s 在氧化底物时反过来又会 被还原为a b t s 。”而以h o b t 作为介体的漆酶，介体系统在此反应中不能明显地 分为两个阶段，其耗氧量动力曲线在整个过程中都表现出零级反应规律。h o b t 被氧化为氧化态h o b t ，再作为氧化剂氧化底物。因此氧化态h o b t 的形成是 反应速率的决定步骤。d m a 的产生也遵循零级反应规律。增加h o b t 的浓度