（动物学专业论文）噬菌体ks4612部分特性及全基因组分析.pdf

摘要2 酮基d 葡萄糖酸( 2 k e t o d g l u c o n i ca c i d ，2 k g a ) 是化学合成食品抗氧化剂d 异抗坏血酸及其钠赫的前体，在大规模工业生产上通常采用细菌发酵方法由d 葡萄糖转化而来。荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) a 4 6 是以k 1 0 0 5 菌株为出发菌株，经紫外诱变选育的2 k g a 高产菌株，其发酵周期短，转化率高，对噬菌体k s 5 0 2 、5 0 3抗性稳定，在国内2 k g a 工业生产中得到普遍采用：在近年来国内2 k g a 的工业生产中，该菌株遭受了新的噬菌体侵染，发酵生产出现异常，给生产企业带来了很大的经济损失。噬菌体种类繁多，且分布广泛。因此，在没有找到相应抗噬菌体菌株的情况下，尽早发现噬菌体污染并及时采取补救措施，是减小经济损失的必要手段。无论是研究细菌与噬菌体问的相互关系，揭示噬菌体介导的基因水平转移所导致的生物多样性等相关问题，还是研究噬菌体的工程改造和寻找新的抗噬菌体方法，都需要对噬菌体及其宿主菌的遗传背景有清楚的认识。由于噬菌体的基因组可小至数千、数万碱基或者碱基对，因此对噬菌体基因组的测序和改造都极具可操作性，对噬菌体功能基因组学研究也相对比较容易，一旦取得成功，其学术价值和应用价值都不可估量。本研究以从2 k g a 产生菌荧光假单胞菌a 4 6 异常发酵液中分离纯化得到的噬菌体k s 4 6 1 2 为对象，初步研究了该噬菌体对荧光假单胞菌a 4 6 的感染及防治策略，并对已完成全基因组测序的k s 4 6 1 - 2 展开了基因组学分析和某些基因功能研究。主要结果包括以下几方面：1 利用透射电镜观察了2 酮基d 葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌a 4 6 感染噬菌体k s 4 6 1 - 2 后的菌体形态变化。随着噬菌体感染时间的延长，菌体形态变化差异显著。2 荧光假单胞菌a 4 6 耐噬菌体k s 4 6 1 2 的突变频率在2 5 l o 击左右。3 噬菌体k s 4 6 1 2 在p h 7 5 8 0 的条件下容易吸附于宿主而增殖。4 高锰酸钾、硫酸铜、柠檬酸铵和草酸铵4 种常用抗噬菌体药物中，草酸铵能够有效抑制该噬菌体的增殖而对宿主菌的生长无明显影响，最佳添加浓度为0 7 。5 用d n a s t a r 软件包中e d i t s e q 软件对k s 4 6 1 2 基因组的一般特性进行分析。k s 4 6 1 - 2 基因组全长8 5 2 2 9 b p ，碱基组成：a = 3 0 5 1 ，g = 2 1 0 7 ，t = 2 9 4 5 ，c = 1 8 9 7 ，稀有碱基- - 0 0 0 ：a + t = 5 9 9 6 ，c + g = 4 0 0 4 。6 利用o r ff i n d e r 软件进行o r f s 初步分析，综合利用针对一般微生物基因注释工具g l i m m e r 在线分析软件和s o f i b e r r y 网站的g e n ef i n d i n gi nv i 删g e n o m e s 功能确定出1 6 3 个推定基因，对k s 4 6 1 2 基因组中o r f s 进行逐个b l a s t x 同源检索分析，得到4 4个已知功能的基因。7 在法国p a s t e u r 实验室网站上对k s 4 6 1 2 基因组进行t r n a 分析，预测出2 个t r n a ，并利用d n am a s t e r 模拟出其二级结构。8 在e m b l - e b i 网站上利用c p gi s l a n d s 功能和s o f l b e r r y 网站上的c p g f i n d e r 功能，分析得到噬菌体基因组上含有7 个大于2 0 0 b p 的g c 岛。其中，g c 含量偏离最大的两个基因，即o r f 9 9 和o r f l 0 0 可能是水平转移而来的外源基因。9 利用s o f i b e r r y 网站o p r e ；0 na n dg e n ef i n d i n gi nb a c t e r i a 栏中的b p r o m ( p r o m o t e rf i n d i n gi nb a c t e r i a ) 功能，预测出噬菌体基因组上1 0 1 个可能的启动子。1 0 利用法国巴斯德网站的p a l i n d r o m e 软件分析基因组，得到1 5 个反向霞复序列；e q u i c k t a n d e m 软件分析未发现基因组上有串联重复序列。1 1 经s o f i b e r r y 网站上的f i n d t e r m 软件分析，在基因组上冬找到了2 4 个可能的4 i依赖p 因子的转录终止子1 2 选择9 个同源蛋白种类较多的功能基因，利用d n a s t a r 软件包中的m e g a l i g n软件，分别将它们与各自的同源蛋白进行了多。垂对比，并绘出系统发尘树。1 3 对溶菌酶基因和穿孔素坫因表达产物进行了跨膜结构预测，结果显示，溶菌酶含有1 个跨膜区域，穿孔素含有7 个跨膜区域。关键词：荧光假单胞菌，噬菌体，感染与防治，生物信息学，基因组注释，系统发生树。a b s t r a c t2 - k e t o d g l u c o n i ca c i d ( 2 k g a ) i so n eo ft h eo r g a n i ct h a ti sp r o d u c e di nal a r g e - s c a l ed u r i n gi n d u s t r i a l i z e db a c t e r i a lf e r m e n t a t i o n t h i sp r o d u c ti sm o s t l yu s e da sd - i s o a s c o r b i ca c i d ，w h i c hi sak i n do ff o o da n t i o x i d a n t ，u s e di nt h es o d i u ms a l ts y n t h e s i s p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n sa 4 6 ，w h i c hw a sam u t a n ts t r a i nb yu l t r a v i o l e tr a y ( u v ) i n d u c i n gf r o mpf l u o r e s c e n sk10 0 5 ，w a sab a c t e r i o p h a g eu s e di nd o m e s t i c2 k g af e r m e n t a t i o n , b e c a u s ei t sh i g hc o n v e r s i o nr a t i oa n ds h o r tf e r m e n t a t i o np e r i o d i nr e c e n t l yy e a r s ，t h e r ew e r en e wp h a g e si n f e c t i n ga 4 6r e s u l t e di na b n o r m a lf e r m e n t a t i o nb r o t ha n dt h ef a c t o r ys e r i o u sd a m a g e t h es p e c i e so fb a c t e r i o p h a g e sa r er e m a r k a b l yn u m e r o u si nt h ed i f f e r e n te n v i r o n m e n t s s o ，f i n d i n gp o l l u t i o no fb a c t e r i o p h a g ea se a r l ya sw ec a na n dt a k i n gr e m e d i a t i o nm e a s u r ei nt i m ec a nr e d u c ee c o n o m i ce x p e n s e d e e p - l o o k i n gi n s i g h ti n t ot h eg e n e t i cb a c k g r o u n do fp h a g ea n di t sh o s ti sv e r yi m p o r t a n tf o rn om a t t e ri n v e s t i g a t i n gt h ei n t e r a c t i o no fb a c t e r i aa n dp h a g e ，a n dr e v e a l i n gt h eb i o l o g i c a ld i v e r s i t ym e c h a n i s mr e s u l t i n gf r o mg e n eh o r i z o n t a lt r a n s f e rc a u s e db yp h a g e ，o re n g i n e e r i n gr e m o d e l i n go fb a c t e r i o p h a g ea n dl o o k i n gf o rn e wp h a g e - r e s i s t a n tb a c t e r i as t r a i n s i ti sp o s s i b l et os e q u e n c ea n dr e m o d e lt h eg e n o m eo fb a c t e r i o p h a g ee a s i l y , w h i c hj u s th a st h o u s a n d so rt e nt h o u s a n d sb a s e so rb a s ep a i m i fi ti so n c es u c c e s s f u l ，t h e r ew i l lb eag r e a tv a l u eo fs c i e n c ea n da p p l i c a t i o n t h eb a c t e r i o p h a g ek s 4 61 - 2 ，w h i c hw a sf i r s ts e p a r a t e df r o mt h ea b n o r m a lf e r m e n t a t i o nb r o t ho fp f l u o r e s c e n sa 4 6 ，i n f e c t i o no na 4 6a n dt h ec o r r e s p o n d i n gc o n t r o lw e r er e s e a r c h e d t h eg e n o m es e q u e n c i n go fk s 4 61 2h a sb e e nc o m p l e t e d ，a n dt h eg e n ef u n c t i o no ft h i sg e n o m eh a sb e e ni n i t i a t e d t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：1 t h ec h a n g e so fc e l lm o r p h o l o g yo fpf l u o r e s c e n sa 4 6 ，as t r a i np r o d u c i n g2 - k e t o - d - g l u c o n i ca c i d ，w e r eo b s e r v e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p ea f t e ri n f e c t e db yt h eb a c t e r i o p h a g ek s 4 61 2 t h ec u r r e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o r p h o l o g yc h a n g e ds i g n i f i c a n t l ya si n f e c t i o nt i m ew e n tb y 2 t h em u t a t i o nf r e q u e n c yo fpf l u o r e s c e n sa 4 6r e s i s t a n tt ot h eb a c t e r i o p h a g ew a sd e t e r m i n e dt ob e2 5 xl0 - 6 3 t h eb a c t e r i o p h a g ew a ss e e ne a s i l ya d h e r et h eb a c t e r i aa t7 5 - 8 0p hv a l u e 4 a m m o n i u mo x a l a t ec o u l dr e m a r k a b l yr e s t r a i nt h em u l t i p l i c a t i o no ft h eb a c t e r i o p h a g e ，b u th a dn oe f f e c to nt h eg r o w t ho ft h es t r a i na 4 6 t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fa d d i t i o na m m o n i u mo x a l a t ew a s0 7 5 a n a l y s i so f8 5 2 2 9 b pw i t he d i t s e qs o f t w a r ei nd n a s t a rs h o w e dt h e4b a s ec o n s t i t u e n t ：n ia = 3 0 5 1 ，g = 2 1 0 7 ，哆钉二2 9 4 5 ，c = 1 8 9 7 ；a + t 兰5 9 9 6 ，c + g = 4 0 0 4 6 16 3c a n d i d a t eg e n e sh a v e b e e np r e d i c a t e df r o mt h eg e i l o m eu s i n gt h es o f t w a r eo fo r ff i n e r , g l i m m e ra n dg e n ef i n d i n gi nv i r a lg e n o m e so ft h ew e bs o f l b e r r y e a c ho r fw a sq u e r i e dw i t hb l a s t x ( b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht 0 0 1 ) 1 1 1 ef u n c t i o n so f4 4o r f sw e r ed e f i n e dw i t hh o m o l o g ys e q u e n c e sp r e s e n ti nt h ep u b l i cd a t ab a s e s 7 t w ot r n a sw e r ep r e d i c t e du s i n gt h es o f t w a r eo ft h ew e bp a s t e u ri nt h eg e n o m e , a n dt h es e c o n d a r ys t r u c t u r e so ft w ot r n a sw e r es i m u l a t e db yd n am a s t e r 8 a n a l y z i n gt h eg e n o m eu s i n gt h es o i h v a r ec p gi s l a n d so ft h ew e be m b l e b ia n dc p g f i n d e ro ft h ew e bs o f i b e r r y 1 1 1 er e s u l ts h o w e dt h a t7g ci s l a n d s ，w h i c hw e r em o r et h a n2 0 0 b p ，w e r ef o u n d ，a m o n gw h i c ht w oo r f s ，o r f 9 9a n do r f10 0 ，h a v i n gt h eh i g h e s tg 圮c o n t e n t ，m a yb ea c q u i r e dg e n e sb yh o r i z o n t a lt r a n s f e r 9 101p r o m o t e r sw e r ef o u n du s i n gb p r m ( p r o m o t e rf i n d i n gi nb a c t e r i a ) o ft h ew e bs o f l b e r r y 10 a n a l y z i n gt h eg e n o m eu s i n gt h es o f t w a r ep a l i n d r o m eo ft h ew e bp a s t e u r , 15i n v e r t e dr e p e a t sw e r ef o u n d n ot a n d e mr e p e a t sw a sf o u n du s i n gt h es o t h v a r ee q u i c k t a n d e m 1 1 2 4p g s s i b l et e r m i n a t o r sa r ef o u n di nt h ei n t e r g e n i cr e g i o n sb ya n a l y z i n gt h eg e n o m eu s i n gt h es o f t w a r ef i n d t e r m o ft h ew e bs o f t b e r r y 12 c h o o s i n g9f u n c t i o ng e n e s ，w h i c hh a v em o r eh o m o l o g yp r o t e i n s ，m u l t i p l es e q u e n c ea l i g n m e n tw a sm a d et oi t sh o m o l o g o u sp r o t e i n sw i t hs o f t w a r em e g a l i g ni nd n a s t a r , a n dt h e nt h ep h y l o g e n e t i ct r e e sw e r ed r o w n 13 t h et r a n s m e m b r a n er e g i o n so fl y s o z y m ea n dh o l i nw e r ep r e d i c t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tl y s o z y m eh a so n et r a n s m e m b r a n er e g i o n ，w h i l eh o l i nh a ss e v e n k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s ，b a c t e r i o p h a g e , i n f e c t i o na n dc o n t r o l ，b i o i n f o r m a t i c s ，g e n o m ea n n o t a t i o n ，p h y l o g e n e t i ct r e ei v学位论文原创性声明本人所提交的学位论文 ：噬菌体k s 4 6 1 - 2 部分特性及全基因组分析，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中标明。本声明的法律后果由本人承担。嚣纛觚彳uo z 每s 乒“pi指嚣竺嚣? 辩们1 年厂月，6 日j1学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在年解密后适用本授权书)名1k多卵名月签，币年教4 ，导懒1丫i玄版衽“签月o (者：删f论沙硕一卜学位论文：噬菌体k s 4 6 1 - 2 的部分特性及伞皋冈纽分析1 1发酵工业噬菌体防治第一章论文综述噬菌体是侵入细菌中病毒的总称，故也称细菌病毒。其生活特性是专性寄生的，只能在活着的宿主菌细胞中生长，且具有宿主特异性，在宿主菌细胞内裂殖能导致宿主细胞的破裂并死亡。根据噬菌体与宿主的关系，可将其分为烈性噬菌体与温和噬菌体两大类：温和噬菌体侵染宿主后，则将其核酸整合在宿主基因组上，并以原噬菌体状念存在。宿主菌则转为溶原性菌株，但也有机率较少的温和噬菌体类似于烈性噬菌体，引起宿主细胞的裂解死亡；而烈性噬菌体通过吸附、侵入、蛋白合成、装配与释放等步骤使宿主细胞在较短时问内裂解死亡，并产生大量子代噬菌体。理化诱导因素可以明显提高温和噬菌体对裂解途径的选择，且多宿主的同一种噬菌体对不同的宿主可表现为烈性或温和噬菌体】。几乎所有使用细菌的发酵工业，都有被噬菌体侵染的可能性，发酵细菌一旦遭受到噬菌体污染，将严重影响发酵的正常进行，甚至发生倒灌，使生产企业蒙受巨大的经济损失。1 1 1 影响发酵的噬菌体主要特点细菌发酵企业周围一般都存在大量与之相对应的噬菌体，其生长、生存环境主要是存有相应宿主菌的各个发酵流程部位及下水道、空气等位置。不同噬菌体的生物学特性各异，通常发酵工业中出现的噬菌体的抗热性比从自然界分离出的高，且绝大部分噬菌体能抵抗恶劣的环境，在短时间煮沸和冷冻条件下，都不能杀灭噬菌体，脱水干燥也不易将其杀死。但总体上来说，噬菌体的抗热性较差，在1 0 0 的湿热条件下容易失活。但是，温和噬菌体的溶原化现象给杀灭噬菌体带来了一定的困难，比如芽孢杆菌的温和噬菌体，由于它们以原噬菌体的状态整合在宿主的核酸上，发生溶原转化，噬菌体核酸随宿主形成芽孢而得以保护，从而使其抵抗恶劣环境的能力大为增强。噬菌体作用于发酵细菌的过程相当快，且对宿主细胞的吸附具有高度的特异性，这一特异性是由噬菌体的构造和宿主细胞的表面结构所决定的。一般来说，两者或其中之一的遗传特性改变，可使噬菌体与宿主间的吸附能力发生改变；另外，存在于g 菌细胞硕：i ：学位论文：噬菌体k s 4 6 1 2 的部分特性及伞堆i 太| 组分析中的质粒常会引起细胞膜的组成和特性改变，从而导致噬菌体与宿主的吸附特性的改变【2 】。从噬菌体吸附于宿主菌开始，到复制新的子代噬菌体完成，噬菌体的溶菌周期仅需几十分钟，此过程同时还能生成大量噬菌体新颗粒，裂解量从几个到上力个以上，具体情况与噬菌体、宿主及培养条件等有关。通常在良好的培养条件下，噬菌体的潜伏期较短，裂解量大：反之，潜伏期延长，裂解量减少【3 j 。荧光假单胞菌发酵生产2 酮基d 葡萄糖酸的异常发酵液中分离得到噬菌体k s 4 6 1 2 ，在宿主细胞最优培养条件下，其潜伏期约3 0m i n ，爆发期约1 4 5m i t t ，裂解量为2 4 4 1 。噬菌体成熟新颗粒产生的同时，宿主菌细胞也将破裂，释放出的成熟噬菌体又去侵染新的宿主细胞。正是因为噬菌体数量的快速增长并对宿主菌产生毁灭性的作用，才导致发酵异常，甚至倒灌。噬菌体对p h 的适应范围与宿主类似，多数噬菌体在中性环境中稳定，也有少数噬菌体在p h3 5 、p h1 4 0 时仍能保持活性。噬菌体存活的p h 范围也不尽相同，且噬菌体往往在其保持活性的最低p h 以下和最高p h 以上失活能力明显增强。工业发酵时的p h一般控制在有利产物合成的范围，一般不会威胁到噬菌体生存。1 1 2 发酵过程中噬菌体的感染途径及检测发酵过程中噬菌体的感染途径很多，但大部分是山于生产过程中，人们4 加注意地把大量活细菌未加处理或处理不彻底阿随意排放，这些活菌同少量与其相关的其它济原性菌株接触而栖息在周围环境中，条件改变时演变为烈性噬菌体，并在环境中逐渐增髋，随着宅气流动，污染发酵液和整个发酵室，由此恶性循环。可见，空气是传播噬菌体的媒介，是感染的主要途径。噬菌体污染发酵后的情况因发酵工业的种类、噬菌体的特性及污染时间、污染程度和发酵时的物化因素等不同而异。一些生产菌株被噬菌体污染后，菌体形态则会发生明显变化，直至菌体裂解为菌体残留片。噬菌体污染发酵后通常有以下几种情况：( 1 ) 在发酵周期末出现污染或污染程度轻常使发酵液稀薄、p h 异常、发酵过程减慢、发酵产率下降；( 2 ) 污染程度重、且污染发生在对数生长期，就会造成生产菌大量裂解死亡，并伴有大量泡沫产生，使发酵停止；( 3 ) 在某些杆菌的异常发酵中，有时会有芽孢出现早、生产周期缩短，产率低，但不会出现典型的溶菌现象f 5 j 。除了根据生产异常加以推断噬菌体污染与否外，也可以根据培养特征及镜检加以诊断。双层平板法是目前广泛用于检测噬菌体的方法，该法通过噬菌斑的形成，既能检测2颂i j 学位论文：噬菌体k s 4 6 1 2 的部分特性及伞桀天l l n 分析出噬茵体，又能较准确测定出其效价。该方法的不足之处是通常需要培养十几个小时才能有结果，不能及时判断出噬菌体污染与否。利用电子显微镜可以克服这个不足，不但能够及时证实噬菌体的存在，还可以观察到生产菌感染噬菌体后的形态改变，判断噬菌体污染的程度。但是，电子显微镜仪器设备较昂贵。采用玻片快速培养法可以把培养时间缩短至2 ，5 0h ，再结合光学显微镜观察，也可以较为快速地检测出噬菌体的存在与否，但测定效价的准确度不如双层琼脂法。对于温和噬菌体的检测，不但需要敏感性的指示菌，而且还需要在培养基中添加适量的诱导剂( 比如丝裂霉素) ，提高温和噬菌体的裂解能力，从而增加其检出率。1 1 3 噬菌体的防治针对上述发酵工业中噬菌体污染的特点及其污染途径，噬菌体的防治般从一下几点着手【6 7 】：首先，控制噬茵体的感染源。由于噬菌体具有宿主专一性，防止活菌体的流失是杜绝噬菌体污染的最有效的办法。这就要求在发酵生产过程中，对于为了控制生产而不断取出的样品，用完之后要加以灭菌处理，防止活菌体流失积累，同时，对取样的发酵液和试管及时用消毒液进行消毒( 一般用2 0 0p l 二氧化氯液浸泡) ，对操作室进行定期清理、消毒，防止活菌扩散。对于化验室就设在发酵车间的厂家束说，更应加以注意。其次，切断噬菌体的感染途径。完善发酵罐的空气过滤系统是该方法的主要内容。现在国内发酵空气过滤系统有很多，由于膜过滤器能对0 0 1 m 的生物体进行拦截，过滤效果突出，因而，大部分厂家都选用该过滤器，这就要求重视膜过滤器对油水处理的高要求性，稍有不慎，极易造成二次污染，不但影响生产，还会缩短膜过滤器的使用寿命。因此，对于膜过滤器系统来说，增加除油设备非常必要，它既能延长过滤膜的使用寿命，又能保证生产过程不受噬菌体和杂菌污染。另外，对于发酵罐中的一些死角要清洗干净，并灭菌彻底，以防成为噬菌体污染隐患。再次，选育新的优良抗噬菌体菌株。发酵企业周围环境中富集了来自污水、土壤及空气中的生产菌噬菌体及溶原菌，由于基因突变和重组随机发生，致使噬菌体在其滋生环境中存在情况实际上是一个噬菌体群，噬菌体群的宿主范围明显大于单一噬菌体的范围。所以，建立和完善发酵工艺，确定发酵菌种的溶原性及其稳定性，避免使用不稳定的溶原性菌株，把好种子关，可以有效地控制噬菌体污染。随着分子生物学及育种手段3顾i ：学位论文：噬菌体k s 4 6 1 2 的部分特性及伞皋洲纽分析的不断进步，不断选育出更多新的抗噬菌体生产菌株，是企业解决噬菌体污染的重要手段。优良的抗噬菌体菌株具备如下特征：( 1 ) 对出现过的噬菌体具有稳定的抗性；( 2 )为非溶原性；( 3 ) 具有高产物合成能力。总而言之，为了防止噬菌体的污染必须对种子、发酵废液、空气以及周围环境定时进行检测，保持生产区的清洁，疏通排污系统，消除死角，有效使用新的抗噬菌体优良菌株。只有不放过任何活菌体的流失和认真消除系统死角，才能真j 下从源头和感染途径上控制噬菌体污染。1 1 4 噬菌体污染后的解决办法在实际生产中，一旦发现生产受到噬菌体污染，则应立即查找事故原因，作出相应的处理，并采用适当的挽救措旌，减小企业损失。目前，在治理噬菌体污染方面主要有以下几个方法：首先，使用合适的药品和试剂。在发酵工业中常用的药品试剂主要有抗生素、柠檬酸、六偏磷酸钠、草酸、肌醉六磷酸等f 引，实验发现一些氨基酸及其衍生物、维生素对某些噬菌体的增殖也有明显抑制作j i j 9 1 。药i | 和试荆的种类以及量的选择主要根据发酵工艺过程、产品的化学特点及其纯化要求来确定的，应该满足药剂的添加既不影响生产菌的正常生长和发酵，同时还能选择性地干扰噬菌体增殖过程中的某个坏节。例如，某些金属螯合剂类试剂可以降低发酵液中的二价阳离子的浓度，即可有效地抑制噬菌体的吸附；抗生素的加入必须是低浓度的j j 能有效控制噬菌体的增殖而对生产菌的生长影响不大。其次，为了挽救生产，还可以在添加合适的药剂的同时，流加新的发酵菌液，加大发酵菌体浓度，以达到稀释噬菌体浓度的目的，从而使发酵进行下去。总之，随着生物技术实验手段的不断探索与进步，人类对噬菌体生物学特性不断的深入研究，尤其是对其基因组方面的分析，可以积累大量有关噬菌体基因及蛋白水平的资料，将为发酵工业中控制噬菌体提供史多、更有效的措施，确保发酵生产的j 下常进行。4颐i ：学位论文：噬菌体k s 4 6 1 - 2 的部分特性及伞幕因组分析1 2 噬菌体基因组一般测序方法及分析内容噬菌体作为细菌的病毒，在自然界中广泛存在，几乎在每一个生物小环境中都能检测到，而且它们可能是地球上最丰富的一类生物体【i o 1 。目前，i c t v ( i n t e r n a t i o n a lc o m m i t t c ef o rt a x o n o m yo f v i r u s e s ) 将病毒分为3 目，6 1 科，2 4 l 属【眩】，噬菌体为其中的一目，包括1 3 科，3 0 属【3 l 。a c k c r r n a n n 认为噬菌体属于一个目，1 7 个科和3 个未定的群，共2 0 个科( 其中有的科与目具有同等的地位) ，有待i c t v 重新划分1 1 4 】。噬菌体作为细菌的病毒种类很多，且分布较广，型态多样化，可归纳成六种主要形念【4 l ：( 1 ) 蝌蚪状，收缩性尾；( 2 ) 蝌蚪状，非收缩性长尾；( 3 ) 蝌蚪状，非收缩性短尾；( 4 ) 球形，无尾，大顶衣壳粒：( 5 ) 球形，无尾，小顶衣壳粒；( 6 ) 无头尾【b 1 ；还有丝状、椭圆形、锥形等，这些形状的噬菌体比较少。有人估计，自然界中细菌的数量大约为1 0 3 0 ，假设每个细菌有1 0 种对应的噬菌体，那么，噬菌体的数量将达到i 0 3 1 之巨1 1 6 j 。噬菌体基因组可由d n a 或r n a 组成，核酸外包裹着一层蛋白质外壳，少数噬菌体含有少量的脂质及非核酸糖类。噬菌体的大小相差很悬殊，例如最小的噬菌体颗粒直径大约2 0n m 左右，约相当于最大蛋白质分子( 如血蓝蛋白) ，而最大的噬菌体头径可达1 8 0n m ，这些都是光学显微镜分辨范围( 2 0 0r i m ) 所不及的。目前，完成全基因组测序并登录g c n b a n k 的噬菌体已经达5 1 7 株之多，其中假单胞菌噬菌体有5 0 多株，并且，这些数据还在呈不断上升趋势。1 2 1 噬菌体基因组研究的基本方法和手段1 2 1 1基因组测序方法自1 9 1 5 和1 9 1 7 年发现噬菌体以来，有关噬茵体的研究一直受到各国学者的关注。细菌遗传学和分子生物学中的很多重要原则都是根据对噬菌体研究结果进行阐述的。由于噬菌体的基因组可小至数千、数力碱基或者碱基对，因此对噬菌体基因组的测序和改造都极具可操作性，对噬菌体功能基因组学研究也相对比较容易，一旦取得成功，其学术价值和应用价值都是不可估量的。因此，随着人类基因组测序的完成，测序手段的不断改进，近年来，噬菌体基因组学和功能基因组学的研究十分活跃。大规模基因组测序需要以下几个支撑技术：( 1 ) s a n g c r 双脱氧术端终止法；( 2 ) p c r技术：( 3 ) d n a 自动测序仪的发展；( 4 ) 生物信息学分析软、硬件设施。5硕- j ：学位论文：噬菌体k s 4 6 1 - 2 的部分特性发伞桀j 大j 纰分析目前，噬菌体基因测序的策略都是基于。鸟枪法”随机测序和重叠群组装的方法进行，对核酸类型是r n a 的测序需要先得到其互补d n a ( c d n a ) ，然后按照d n a 测序方法进行。d n a “鸟枪法”随机测序方法主要包括以下步骤：( 1 ) 构建随机文库：在纯化出单一噬菌体d n a 后，首先通过超声剪切、或者不完全酶切法得到基因组d n a ( r n a 噬菌体则先获得其e d n a ) 的小片段，用琼脂糖凝胶电泳分离、回收1 6 - 4 0k b 左右的小片段。获得的小片段用t 4d n a 聚合酶补平，连接到经酶切( 主要是s m a i ) 并去磷酸化的载体d n a 上，转化至感受态细菌，随机挑取克隆，提取质粒，制备模板进行测序。( 2 ) 克隆片段的测序：d n a 测序主要采用化学裂解法和d n a 链末端合成终止法。化学裂解法为a l l a nm a x a m 和w a l t e rg i l b e r t 所建立，常称为m a x a m g i l b e r t 法；d n a链末端合成终止法也称s a n g e r 法。但是，除了早期少数噬菌体是用手工测序以外，其它的噬菌体基因测序工作都是通过现代化的自动测序仪进行的。随着荧光标记技术的发展，自动测序技术也得到了飞跃的进步，测序仪器也更新换代。例如a b i 公司的3 7 7型垂直板自动测序仪为自动荧光垂直板凝胶电泳测序仪，含有9 6 个泳道，读长高达7 0 0 - - 一8 0 0b p ，同分析能力达3 0 0 个样品；安玛西亚公司的m e g a b a c e l 0 0 0 为自动荧光毛细管凝胶电泳测序仪，也含有9 6 个泳道，读长高达5 0 0 - - 6 0 0b p ，同分析能力达1 0 0 0个样品。所有这些测序仪器的改进，大大提高了测序速度和质量，有力地推动了噬菌体基因组学研究的发展。( 3 ) 将所测序列用测序软件进行拼接：当测序反应达到8 倍以上覆盖率的测序量时，就可以得到少量几个大小不一的重叠群。( 4 ) 最后，通过引物延伸或p c r 法填补各重叠群之问的缺口，得到完整的全基因组序列。英国新科学家杂志网站2 0 0 8 年2 0 同报道，美国科学家通过研究发现，目前通常用于大片段脱氧核糖核酸测序的“鸟枪法 存在缺陷，发现该方法无法测到人类基因组中占到基因组3 到5 的重复d n a 片段，但是这个缺陷并不能抹杀该方法的作用，同时，该报道还提出最佳的d n a 测序法是，将两种测序方法相结合t 用“鸟枪法”进行整体测序，识别出“鸟枪法 无法测序的区域，再通过传统方法对这些区域测序，以弥补上述缺陷。1 2 1 2 噬菌体基因组的分析内容和工具基因组学包括结构基因组学、功能基因组学和比较基因组学等，它是以分子生物学、6顺l j 学位论文：噬菌体k s 4 6 1 2 的部分特性发伞堆冈组分析计算机科学和信息网络技术为研究手段，以生物体内全部基因为研究对象，在全基因背景下和整体水平上探索生命活动的内在规律及内外环境影响机制的科学。由于噬菌体为原核生物，其个体小，基因组相对也比较简单，对它的基因组学研究主要包括以下方面：全基因组的测序、基因组形状和末端的确定、基因组g + c 含量以及g c a t 岛分析，o r f的搜索、编码序列的推定以及t i a 基因、r r n a 基因的检索、基因的同源性检索、基因的功能研究、基因对密码子的使用有无偏嗜性、转录的起始与终止、核糖体结合位点、重复序列、插入序列、转座子的鉴定、溶原性噬菌体整合位点的分析、基因的进化与转移、基因组结构与基因的组织、衣壳蛋白以及颗粒的包装与形成，等等。国际互连网为基因组学研究提供了大量卓有成效的方法和手段。其中，比较著名的包括：美国国立卫生研究院( n a t i o n a li n s t i t u t e so fh e a l t h ，n i h ) 开办的网站n c b i( h t t p ：w w w n c b i 。n l m n i h g o v g o r f g o r f h t m l ) ，欧洲生物信息学研究所( e u r o p e a nb i o i n f o r m a t i c si n s t i t u t e ，e b i ) 网站( h t t p ：w w w e b i a c u k ) ；另外还有：法国p a s t e u r 实验室网站( h t t p ：w w w p a s t e u r f r e n g l i s h h t m l ) ，果蝇基因组计划( b e r k e l e yd r o s o p h i l ag e n o m ep r o j e c t ，b d g p ) 网站( h t t p ：w w w f r u i t f l y o r g i n d e x h t m l ) ，美国乔治亚州技术研究所m a r kb o r o d o v s k y 实验室网站( h t t p ：o p a l b i o l o g y g a r e t h e d u g e n e m a r k ) ，s o f l b e r r y网站( h t t p ：w w w s o f l b e r r y c o m b e r r y p h t m l ) 。其中，对蛋白质功能进行分析的工具有：b l a s t p ，b l a s t x ，f a s t a ，p f a m 等，这些网络共享资源可以对基因组学分析研究提供强有力的工具支持。1 3 噬茵体基因组过去三年里，n b c i 上登录的已测序噬菌体数目增加了5 0 0 多种，是2 0 0 5 年的的3倍，这些噬菌体的宿主菌至少有7 0 多种，其中，2 3 的噬菌体主要集中在8 种宿主菌。噬菌体基因组对比分析得到三个关键的特征和意义：第一，噬菌体基因组之间存在着高度的遗传差异性，揭示了噬菌体进化起源比较早；第二，基因组结构上存在镶嵌基因，反映出在进化过程中发生了高度的基因水平交换；第三，噬菌体基因组中包含有大量的未知功能基因，这无疑是一个有待开发的巨大基因库。由于噬菌体个体较小，容易分离，使噬菌体9 x 17 4 于19 7 7 年成为第一个完成全基因组测序的物种【l7 1 。该噬菌体基因组全长5 3 8 6b p ，为一s s d n a 噬菌体。第一个完成测序的d s d n a 噬菌体为九噬菌体【l 引，该噬菌体基因组全长4 8 5 0 2b p ，之后基因组全长3 9 9 3 67坝i ：学位论文：噬菌体k s 4 6 1 2 的部分特性及伞堆i 矧组分析b p 的t 7 噬菌体也完成了测序【i9 1 。十年之后，从感染的e s c h e r i c h i ac o l i 分离出来的第一个有尾噬菌体l 5 也完成了基因组测序1 2 0 】，从那时起，随着d n a 测序技术的不断改进，开始了大量的噬菌体基因组测序。上世纪8 0 年代后期，随着荧光标记技术在噬菌体定位上的应用【2 1 ，2 2 1 ，人们重新重视了噬菌体在生物和环境中的角色。海水中的病毒颗粒达1 0 7 个m l 这个数量与陆地上的非常相似【2 3 1 。保守估计，生物圈中细菌种类为1 0 3 0 ，按噬菌体与细菌比率为5 1 0 ：1 2 4 2 卯，如此算来，全球噬菌体数量估计达1 0 3 1 ，这个数字是惊人的，暗示着原核病毒是揭示所有生物类群的主要窗l ! | 2 6 1 。实验证明，这个数据大约同时以1 0 2 3 个s 的速度不断感染宿主菌，使得噬菌体数量也在发生着动态变化。1 3 1已测序噬菌体概况目前，在n b c i 噬菌体基因组数据库已经有5 0 0 多种已完成测序的噬菌体，包含2 2 3m b p 的序列信息量。噬菌体基因组平均大小相当于细菌染色体的1 ，n b c i 上已经有7 4 1 条细菌染色体序列信息( 2 4 2g b p ) ，为噬菌体j 列信息的1 0 0 倍，这就解释了为什么噬菌体具有高度的差异性和较多的种类，在未来儿年罩，我们可以实现完成对更多的噬菌体和细菌进行基因组测序。虽然溶原性噬荫体的溶菌机制还不太清楚，但在细菌基因组罩包含有大量的溶原性噬菌体的基凶务【序列【z 丌，这些溶原性i 噬茵体数目有可能已经超过现已报道的噬菌体数量。8i- _ - - _lli - - - 一一- - i - - 一一一节2 窖品名8 器2 雩828 名2 ；2222 客宕器828 各金；28 星f - f - f r 一“n 一，一量至i 乏霜禽禽暑 季8 岛2 暑o 2 昌8 = ；i = 二；二囊乏4 暑g 零；冠村“s i z e ( k b p )图1 1 已测序噬菌体基冈组人小分布情况f i g 1 - 1s i z ed i s t r i b u t i o no fs e q u e n c e db a c t e r i o p h a g eg e n o m e s幻铃o矗璺藿口io皇e)z颂i ：学