（基础兽医学专业论文）前列腺素e合成酶在小鼠卵巢中的表达与调节.pdf

塑型矍耋! 垒些墼奎! ：垦塑墨皇墼耋篁量塑至 摘要 前列腺素e 合成酶( p r o s t a g l a n d i nes y n t h a s e ，p g e s ) 是p g e 2 生物合成过程的末端 限速酶，催化环氧合酶的产物p g h 2 转化成p g e 2 。根据p g e s 在细胞内的定位和对谷胱 甘肽的依赖性，分为膜相关的谷胱甘肽依赖型的p g e s ( m p g e s ) 和可溶性谷胱甘肽依赖 的p g e s ( c p g e s ) 。已经证实，p g e s 在小鼠胚胎着床和蜕膜化过程，以及牛的排卵过程 中起很重要的作用。本实验利用免疫组织化学以及原位杂交的方法，比较系统地研究了小 鼠排卵、黄体形成和退化过程中，m p g e s 和c p g e s 在卵巢中的表达规律。 f 促性腺激素诱导的小鼠排卵模型中，m p g e sm r n a 在初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞 上均有表达。在p m s g 注射3 h 时，m p g e sm r n a 表达达到高峰。注射h c g3 h 后，卵丘 颗粒细胞上有m p g e sm r n a 的表达，但卵泡壁颗粒细胞上只能检测到m p g e sm r n a 的 微弱表达。在有腔卵泡中，m p g e sm r n a 主要表达于包括卵丘细胞在内的颗粒细胞上。 m p g e s 蛋白在2 1 天未注射促性腺激素的小鼠卵巢初级卵泡和次级卵泡中的免疫染色较 强，仅在p m s g 处理1 2 小时后，才有比较微弱的下降趋势。在h c g 注射后3 小时，m p g e s 的表达呈现峰值，随后，蛋白的表达下降。 c p g e sm r n a 在初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞上均有较强的的表达。p m s g 注射 4 8 h 时，c p g e sm r n a 的表达下降，而且这种表达的下降一直持续到h c g 注射后1 l h 。在 h c g 处理3 小时后，c p g e sm r n a 在卵丘细胞中的表达也较强。在各级卵泡的卵母细胞 质中有很强的c p g e s 免疫染色，仅在p m s g 注射4 8 小时，在卵母细胞质中的c p g e s 免 疫染色有所下降。在p m s g 处理后的卵泡颗粒细胞中，几乎检测不到c p g e s 免疫染色。 但经h c g 处理后3 小时，c p g e s 免疫染色明显上调，直到h c g 处理后1 l 小时( 即排卵 时) ，c p g e s 免疫染色才有所减弱。 在h c g 注射后第2 3 天形成的黄体细胞中，有较强的m p g e sm r n a 表达。在黄体 细胞中的m p g e sm r n a 表达随后有所下降，但其下降趋势不很明显。m p g e s 蛋白在h c g 处理后第l 3 天新形成的黄体中有较微弱的表达，但从第9 天开始有所升高。c p g e s m r n a 在h c g 处理后第1 天的黄体细胞中表达较强。在第2 3 天的黄体细胞中，c p g e s m r n a 表达达到最高。在黄体细胞中的c p g e s 免疫染色与m p g e s 免疫染色相似。 这些结果表明，m p g e s 和c p g e s 可能在小鼠卵泡发育，排卵以及黄体形成和退化过 程中起定的作用。 关键词：m p g e s c p g e s j 小鼠卵巢姊卵，颗粒细胞、黄体， j t 7 芒 l 7 尹 l 、 、 、 奎! ! 垒些奎耋蝥兰竺圭兰堡竺三 e x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no fp r o s t a g l a n d i n e s y n t h a s e i nm o u s e o v a r y a b s t r a c t p r o s t a g l a n d i nes y n t h a s e ( p g e s ) i st h et e r m i n a lr a t e - l i m i t i n ge n z y m ef o rp g e 2s y n t h e s i s ， w h i c hc a t a l y z e st h ec o n v e r s i o no fp g h 2i n t op g e 2 t h e r ee x i s t st w oi s o f o r m so fp g e s g l u t a t h i o n e d e p e n d e n t m e m b r a n e - a s s o c i a t e d p g e s ( m p g e s ) a n d g l u t a t h i o n e - d e p e n d e n t c y t o s o l i cp g e s ( c p g e s ) p g e sh a sb e e np r o v e dt ob ei m p o r t a n tf o rm o u s ei m p l a n t a t i o na n d d e c i d u a l i z a t i o n ，a n df o ro v u l a t i o n i nb o v i n e t h ea i mo ft h i s s t u d yw a st oi n v e s t i g a t et h e e x p r e s s i o no f m p g e sa n dc p g e si nm o u s e o v a r yd u r i n gt h es e x u a lm a t u r a t i o n ，o v u l a t i o n ，a n d f o r m a t i o na n d r e g r e s s i o no f c o r p u sl u t e u mb yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n di ns i t uh y b r i d i z a t i o n m p g e sm r n aw a se x p r e s s e di ng r a n u l o s ac e l l so f p r i m a r ya n ds e c o n d a r yf o l l i c l e sd u r i n g o v u l a t i o ni n d u c e db yg o n a d o t r o p i n ah i g hl e v e lo fm p g e sm r n aw a ss e e n3ha f t e rp m s g t r e a t m e n tm p g e sm r n a s i g n a l sw e r ea l s os e e n3ha f t e rh c gt r e a t m e n t m p g e sm r n aw a s m a i l yl o c a t e di ng r a n u l o s ac e l l si n c l u d i n gc u m u l u sc e l l si nf o l l i c l e s ah i g l ll e v e lo fm p g e s i m m u n o s t a i n i n gw a so b s e r v e di nt h eo v a r yi nt h e2 1 d a y so l dm o u s e m p g e si m m u n o s t a i n i n g b e c a m e s l i 曲t l y w e b e r12 ha f t e rp m s gt r e a t m e n t t h e h i g h e s t l e v e lo fm p g e s i m m u n o s t a i n i n gw a s d e t e c t e d3ha f t e rh c gt r e a t m e n t c p g e sm r n aw a s s t r o n g l ye x p r e s s e di ng r a n u l o s ac e l l so f p r i m a r ya n ds e c o n d a r yf o l l i c l e s t h e r ew a sad e c l i n ei nc p g e sm r n a e x p r e s s i o n4 8ha f t e rp m s g t r e a t m e n t t h i sd e c l i n ew e n t o nu n t i l1tha f t e rh c g t r e a t m e n t c p g e sm r n aw a sa l s of o u n di nc u m u l u sc e l l s3ha f t e rh c g t r e a t m e n t - c p g e sm r n a s i g n a lw a sm a i l yl o c a t e di no o e y t ec y t o p l a s ma n dd e c l i n e da t4 8h 墼型墼耋! 窒璧璧耋尘里墼墨主墼童竺皇望薹 a f t e rp m s gt r e a t m e m n oc p g e sm r n as i g n a lw a sd e t e c t e di n g r a n u l o s ac e l l s c p g e s i m m u n o s t a i n i n g w a s u p 。r e g u l a t e d3ha f t e rh c g t r e a t m e n ta n db e c a m ew e a k e ra t1 1ha f t e rh c g t r e a t m e n t t h e r ew a sah i g hl e v e lo fm p g e sm r n ai nt h ec o r p u sl u t e u mo nd a y s2a n d3 a f t e r o v u l a t i o n m p g e si m m u n o s t a i n i n gw a sd e t e c t a b l ei n c o r p u sl u t e u mo nd a y s1 3a n e rh c g t r e a t m e n t ，a n di n c r e a s e df r o md a y9a f t e rh c gt r e a t m e n t c p g e sm r n a s i g n a l sw e r es t r o n g l y d e t e c t e di n c o r p u s l u t e u mo i l d a y 1a f t e ro v u l a t i o na n dr e a c h e di t s p e a ko hd a y s2 - 3 a f t e r o v u l a t i o n c p g e si m m u n o s t a i n i n gw a ss i m i l a rt om p g e s i nt h ec o r p u sl u t e u m t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tm p g e sa n dc p g e s m a yb ei n v o l v e di nf o l l i c l ed e v e l o p m e n t ， o v u l a t i o n ，a n df o r m a t i o na n dr e g r e s s i o no f c o r p u sl u t e u mi nm o u s e m a s t e rc a n d i d a t e ：s u nt o n g m a j o r ：b a s i cv e t e r i n a r ys c i e n c e s u p e r v i s o r ：y a n gz e n g m i n g k e y w o r d s ：m p g e s ，c p g e s ，m o u s e ，o v a r y , o v u l a t i o n ，g r a n u l o s a c e l l s ，c o r p u sl u t e u m i i 墼型堡耋塑鏖墼童! ：坠塑塞耋竺童篁皇堡至 ：，。一 1 前言 前列腺素( p r o s t a g l a n d i n ，p g ) 广泛存在于人和动物体内，为含有一个环戊烷和两个 脂肪酸侧链的二十碳不饱和脂肪酸，根据环上取代基和双键位置的不同，可分为a 、b 、c 、 d 、e 、f 、g 、h 和i 九型( b r e y e r e ta l ，2 0 0 0 ) 。 p g 的生物合成前体是花生四烯酸( a a ) 。在磷脂酶a 2 ( p h o s p h o l i p a s e a 2 ，p l a 2 ) 的 作用下，从膜磷脂中释放a a 。环氧合酶( c o x ) 催化a a 形成不稳定的环内过氧化物p g g 2 ， 随后又转变为p g h 2 。p g h 2 在不同的前列腺素合成酶的作用下最终形成p g f 2 a 、p g e 2 、 p g l 2 、p g d 2 和凝血噬烷a 2 ( t x a 2 ) ( b o n v a l e t e ta l ，1 9 8 7 ；s m i t h ，1 9 9 2 ) 。p g 是哺乳动物体 内作用极为广泛的局部激素，影响生殖过程的多个环节。 1 1p g e 2 由子宫内膜产生的p g s 是生殖过程的调节及妊娠成功建立的主要参与者，在受精、排 卵、黄体溶解和胚胎着床等生殖过程中发挥一定的作用。 p g s 不能被储存，但能被合成和释放。p g 是通过存在于细胞膜上的受体发挥其生理 作用。p g e 2 的受体e p 是一类与g 蛋白偶联的跨膜蛋白。根据引起平滑肌收缩和舒张的 作用不同，将其分为e p i 、e p 2 、e p 3 和e p 4 四种( b o i t ie ta l ，2 0 0 1 ) 。激活e p l 和e p 3 可 引起肌肉的收缩，而激活e p 2 和e p 4 则可引起肌肉的舒张，并且不同的e p 受体介导的信 号途径也不同。 1 1 1 p g e 2 与排卵 p g e 2 参与生殖的多个环节。哺乳动物排卵前，垂体释放大量的黄体生成素( l h ) ， 称为l h 排卵峰。l h 峰能够刺激排卵前卵泡内的分泌功能发生剧烈的变化，其中卵泡颗 粒细胞产生的p g 对于排卵是必需的。在排卵前l h 峰的诱导下，排卵前卵泡中形成p g ， 并且在排卵时p g 的浓度达到最高( b a u m i n g e re ta l ，1 9 7 5 ；b r o w ne ta l ，1 9 8 4 ；h e d i ne ta 1 1 9 8 7 ) 。用非类固醇的抗炎症药物( 如消炎痛) 既能抑制p g 的合成又能抑制排卵( t a n i o k a e ta l ，2 0 0 0 ) 。c o x 2 和p g e 2 受体缺陷型小鼠也不能正常排卵( d a v i se ta l ，1 9 9 9 ；m a t s u m o t o e ta l ，2 0 0 0 ) ，但是将c o x 一2 缺陷型小鼠用p g e 2 处理后可以恢复其排卵。排卵l h 峰之前， 牛卵泡液内的p g e 2 水平很低。而l h 蜂后2 0 小时，排p 前牛卵泡液内p g e 2 浓度显著升 高( l i ue ta l ，1 9 9 7 ) 。用p g e 2 或p g f 2 a 或二者共同作用可以克服消炎痛的抑制作用( s o g n e ta l ，1 9 8 7 ；h o l m e sc ta l ，1 9 8 3 ) 。但有人报道，这两种p g 不能使消炎痛处理过的动物恢复 排卵( e s p e y e ta l ，1 9 9 4 ) 。最近发现，在消炎痛处理后，l h 峰可诱导基侧卵泡边缘的异常 卵泡破裂t 而注射p g e i 、p g e 2 或p g f 2 q 可以抑制这种异常的卵泡破裂，并且可以恢复 其正常排卵，其中以p g e l 的效果最显著，但排出的卵子的数量却明显的减少( g a y t 矗n e ta l - l 东北农业大学农学硕士学位论文 2 0 0 2 ) 。排卵前，促性腺激素可诱导颗粒细胞中c o x 2m r n a 和蛋白的合成增加，同时诱 导卵丘细胞表达e p 2 。由于促性腺激素诱导颗粒细胞表达c o x - 2 的过程是由l h 受体通过 c a m p 信号介导的，而且p g e 2 作用于e p 2 可使c a m p 水平升高，c o x 2 、p g e 2 、e p 2 系统可能存在正反馈机制，从而放大l h 信号促进卵丘细胞的扩展并引发排卵( m a t s u m o t o e ta 1 2 0 0 1 ) 。 e p 2 基因敲除的雌性小鼠可以妊娠并且正常分娩，但产仔数却明显减少。在e p 2 ( 一，- ) 雌鼠中，排卵数和受精率明显下降，但是子宫的功能并没有任何变化。促性腺激素可诱导野 生型小鼠的卵泡卵丘细胞中表达e p 2m r n a 。在体外，f s h 和p g e 2 都可以使野生型小鼠 的未成熟的卵丘发生扩展，但在e p 2 ( _ ) 的小鼠中，p g e 2 不能产生同样的影响。在e p 2 ( - ) 的小鼠中，在排卵前卵泡中正常发生的卵丘扩展出现异常。这表明e p 2 在卵丘扩展过程中 起作用。用无卵丘的卵子进行体外研究表明野生型和e p 2 ( 1 小鼠的受精率并无差别。这 些结论说明，p g e 2 与促性腙激素协同作用来完成成功受精所必须的卵丘扩展( h i z a k ie ta l ， 1 9 9 9 ) 。 子宫内注射p g e 2 可以提高马的妊娠率，但这种提高只限于那些与具有优质精子的公 马交配的母马。对于和劣质精子交配的马来说，外源的p g e 2 并不能改变其妊娠率( w o o d s e ta 1 2 0 0 0 ) 。 1 1 2 p g e 2 与黄体形成和退化 在哺乳动物中，黄体是由排卵后的剩余组织形成的临时性内分泌器官，主要功能是分 泌孕酮。正常的黄体形成和及时退化对于维持妊娠、启动分娩以及在没有受精的情况下进 入下一个生殖周期是必须的。黄体的形成和退化依赖于促黄体生成因子和溶黄体因子之间 的相互作用。 在反刍类动物中，子宫来源的p g f 2 a 具有促进黄体溶解的作用。在很多种类的动物中， 高水平的p g f 2 a 在妊娠任何时期都可以干扰妊娠( h o r t o ne ta l ，1 9 7 6 ) 。比较而言，p g e 2 则 可以诱导全身反应，并且具有抗黄体溶解的作用( p r a t te la l ，1 9 9 5 ) 。p g e 2 也能作为一种 免疫调节物防止孕体的排斥反应( l a la ，1 9 9 0 ) 。在牛的子宫内膜细胞中，干扰素一t ( i n f t ) 可促进p g e 2 的产生，以及c o x + 2 和磷脂酶a 2 的表达( a s s e l i ne ta 1 1 9 9 7 ) 。在体外， h c g 诱导的人基质细胞的分化与c o x 2 上调后所产生的p g e 2 增加有关( h a ne ta l ，1 9 9 6 ) 。 妊娠的识别和建立依赖于p g e 2 和p g f 2 a 之间的平衡调节。p g e 2 p g f 2 的比例主要通过 以下三种途径调节：( 1 ) 普遍接受的p g f 2 a 产生下降；( 2 ) 通过一个假定的9 一酮一p g e 2 还原酶将p g e 2 转化成p g f 2 a ( a s s e l i ne ta l ，2 0 0 0 ) ：( 3 ) 通过刺激前列腺素e 合成酶从而 提高p g e 2 的生成。 将分别从黄体期的三个不同时期收集的黄体细胞( 排卵后1 3 天、排卵后1 0 1 2 天 和排卵后1 4 1 6 天) 进行培养时，p g e 2 能以剂量依赖的方式增加成熟黄体细胞中孕酮的 分泌。p g f 2 a n 以剂量依赖的方式降低黄体细胞中孕酮的分泌。将成熟的或退化的黄体细 胞在体外进行培养时，用p g f 2 和p g e 2 共同处理所产生的孕酮要高于用p g f 2 a 单独处理。 而且，将正在退化的黄体细胞进行培养时，用p g e 2 和p g f 2 a 以2 ：1 和4 ：1 的比例分别 2 墼型墼童! 垒塞璧童尘塞塑叁耋墼耋兰耋望薹：，：；一 处理后所产生的雌激素均比对照组高。这些数据证实了p g e 2 的促黄体作用和p g f 2 a 参与 黄体溶解的作用。因此，增加p g e 2 的剂量可以增加早期妊娠过程中胚泡需要的雌激素 ( g r e g o r a s z c z u k e ta l ，1 9 9 9 ) 。 在牛发情期的第8 9 天，肌肉注射p g f 2 c t 的类似物( e s t r u m a t e ) 可以诱导黄体溶解。 在处理后4 小时，黄体中p g f 2 a 和p g e 2 的释放迅速增加。到8 小时后，二者的分泌呈下 降的趋势。但在4 8 7 2 小时，这两种p g s 的释放又再次逐渐增加。这些结果显示，在正 在退化黄体中，p g f 2 c t 和p g e 2 的释放在黄体溶解的后期可被p g f 2 c t 的类似物诱导增加。 将去甲肾上腺素( n o r a d r e n a l i n e ，n a ) 通过尾静脉注入牛的腹部主动脉中，每5 1 5 分钟 检测血液中的胆固醇、孕酮和p g e 2 。在注射后，胆固醇并无变化，孕酮的分泌仅在短时 间内有所改变，但p g e 2 的浓度却有明显升高。这表明p g e 2 可能影响去甲肾上腺素刺激 的黄体中孕酮的分泌( k o t w i c ae ta l ，2 0 0 3 ) 。 在人黄体细胞中可检测到内皮素( e t 1 ) 的表达。内皮素在黄体中能够显著抑制h c g 诱导的孕酮生成。将黄体细胞体外培养后用内皮素1 和内皮素一3 进行处理时这两种内皮 素都能以剂量和时间依赖的方式刺激p g e 2 和p g f 2 a 的释放。p g s 在黄体的活动中发挥着 非常重要的作用，并且内皮素也能影响孕酮的产生。因此，p g s 、孕酮和e t s 在黄体的功 能调控中起重要作用( m i c e l i e ta l ，2 0 0 1 ) 。 1 1 3 p g e 2 与着床和蜕膜化 胚胎在子宫中成功的着床需要孕酮和雌激素的协同调控，它们通过多种局部信号分 子的介导，为胚胎的顺利着床作出相互协调的反应。哺乳动物胚胎着床需要p g 的参与。 由于p g 具有活化血管、促进有丝分裂和促分化的作用，p g 广泛参与着床过程中子宫上皮 细胞和基质细胞的增殖和分化、子宫上皮细胞与胚泡滋养层之间的相互作用、着床位点子 宫血管通透性的增加、子宫基质细胞的蜕膜化及胎盘形成所必须的血管发生。在啮齿类动 物中，p g e 2 和p g l 2 为参与着床和蜕膜化过程的两种最重要的p g 。p g e 2 和p g l 2 也为着 床位点表达最丰富的前列腺素( l i r ae t a l ，1 9 9 9 ) 。已经证明，p g e 2 在啮齿类动物的着床过 程中起重要的作用。p g e 2 的细胞表面受体e p i - 4 在围着床期的子宫中呈时空特异性表达。 在小鼠中，e p 2 在妊娠4 ，5 天的子宫内膜中表达，说明e p 2 可能与着床所需的子宫内膜上 皮分化有关，可能e p 2 的活化使c a m p 的水平提高，参与了腔上皮到基质的信号传递( l i r a e ta l ，1 9 9 7 ) 。e p i 在小鼠妊娠第6 - 8 天子宫的系膜侧蜕膜中表达，可能促进胎盘形成所需 的血管发生( y a n ge ta l ，1 9 9 7 ) 。用消炎痛抑制前列腺素合成后，大鼠子宫不能发生蜕膜 化反应，从而导致着床失败。将p g e 2 注入大鼠子宫后，可以部分恢复子宫内膜的蜕膜化 ( h a m i l t o ne ta l ，1 9 9 4 ) 。这表明p g e 2 可能在着床和蜕膜化过程中发挥重要的作用。并且， p g e 2 在胚泡发育的过程中也有重要的作用，能够诱导小鼠胚泡着床( h o l m e se ta 1 1 9 8 0 ) 。 虽然将p g e 2 注入c o x - 2 ( - ) 小鼠后，只能恢复部分( 大约3 0 ) 恢复子宫基质细胞的 蜕膜化反应，但p g e 2 与c p g i 共同处理则能够显著促进胚胎和蜕膜的生长，着床前的胚胎 3 奎垫垒兰奎兰垒兰塑圭兰堡耋三 = ： 也可以致密化，胎盘预形成位点的血管发育以及蜕膜的大小都与野生型小鼠中的情况类似 ( l i me ta l 1 9 9 9 ) 。很可能p g e 2 对于p g l 2 诱导的蜕膜化起到补充作用，由二翥共同作用 来调节子宫基质细胞的蜕膜化。 1 2p g e s 在哺乳动物生殖过程中的作用 1 2 1p g e s 的生物学特性 p g e s 是p g e 2 生物合成过程的末端限速酶，催化环氧合酶的产物p g h 2 转化成p g e 2 。 根据p g e s 在细胞中的定位和对谷胱甘肽的依赖性，将p g e s 分为膜相关的谷胱甘肽依赖 型p g e s ( m p g e s ) 和可溶性谷胱甘肽依赖p g e s ( c p g e s ) 。w a t a n a b e 等( 1 9 9 7 ，1 9 9 9 ) 首先从牛心脏中提纯了m p g e s ，以后在小鼠、大鼠和人中也陆续分离得到了同源产物 ( f o r s b e r g e ta l ，2 0 0 0 ) 。 m p g e s 为一1 6k d a 的膜结合蛋白，与微粒体谷胱甘肽硫一转移酶i ( m g s t i l t ) 在氨基 酸序列上有3 8 的同源性( j a k o b s s o ne ta l ，1 9 9 9 ) 。小鼠和大鼠的m p g e s 序列与人的同源 性分别为8 4 和8 2 ( y a r n a g a t a e ta l ，2 0 0 1 ：m a n c i n ie ta l ，2 0 0 1 ) ，小鼠与大鼠的同源性可达 到9 4 ( f i l i o ne ta 1 2 0 0 1 ) 。从牛心中分离出来的m p g e sc d n a 包括5 端8 个碱基对的 非转录1 区、4 6 2b p 的开放阅读框及3 端4 0 6b p 的非转录区。小鼠及大鼠的m p g e s 分 别含有8 2 0 和7 1 0 个氨基酸，拥有同个含4 5 9b p 的开放阅读框，编码含有1 5 3 个氨基酸 的多肽，但小鼠和大鼠在3 端的非翻译区不同( m u r a k a m ie ta l ，2 0 0 0 ) 。 m p g e s 广泛分布于各种组织和细胞中，包括前列腺、睾丸和小肠( j a k o b s s o ne ta l ， 1 9 9 9 ) 。m p g e s 是诱导型酶，在体外可被诱导c o x 2 的很多促炎症反应因子所诱导，包 括脂多糖( l p s ) 、白介素1 p ( i l 一1 p ) 和肿瘤转化因子d ( t n f c t ) 等( m a n c i n i e ta l ，2 0 0 1 ) 。 在人的肺泡a 5 4 9 细胞中，m p o e s 活性和蛋白水平受i l 1 b 的诱导而明显升高( f o r s b e r ge t a l ，2 0 0 1 ) 。m p g e s 与诱导型的c o x 2 偶联从而促进延迟性p g e 2 的产生。如果c o x 2 已 经存在于细胞中，m p g e s 也调节p g e 2 的快速生成( m u r a k a m ie ta l ，2 0 0 0 ) 。 c p g e s 具有与m p g e s 不同的细胞定位、酶学特点以及表达调控机制。c p g e s 在许多 组织和细胞中广泛表达，在睾丸中表达较高，但在肾、心脏及脑中也存在。c p g e s 的氮基 酸序列与人的p 2 3 蛋白部分序列一致。p 2 3 是一2 3k d a 的伴侣分子，结合到h s p 9 0 上( w e a v e r e ta l ，2 0 0 0 ) 。重组的p 2 3 在细菌和哺乳动物细胞中具有c p g e s 的活性。与m p g e s 不同， c p g e s 是组成型酶，并与c o x 1 相偶联，其表达在多种组织和细胞中不受前炎症刺激因 子的影响( t a n i o k ae ta l ，2 0 0 0 ) 。然而，在大鼠脑中，c p g e sm r n a 水平在l p s 处理后有 所增加。 1 2 2p g e s 与捧卵 m p g e s 在牛卵泡中并不是呈组成型表达而是在卵泡破裂之前由促性腺激素诱导产生。 在h c g 或l h 作用前牛卵巢中m p g e s 转录水平很低或检测不到。在h c g 处理后1 2 小 4 塞型墼耋! 窒璧墼变尘坠塑叁! 竺耋竺皇塑苎 时，m p g e sm r n a 表达水平升高。在h c g 作用后1 8 - 2 4 小时或自然发情后1 8 - 2 4 小时 牛卵巢中m p g e s 急剧增加。卵泡中的m p g e s 主要在颗粒细胞层上表达。m p g e s 蛋白只 能在颗粒层细胞的提取物中检测到，而在卵泡膜细胞中则没有( f i l i o n e ta l ，2 0 0 1 ) 。促性腺 激素对m p g e s 的这种诱导方式与c o x - 2 在排卵前卵泡中被诱导的方式相一致( s i r o i s e ta l ， 1 9 9 4 ；l i ue ta 1 1 9 9 7 ；l i ue ta l ，1 9 9 8 ) 。促性腺激素对m p g e s 和c o x 一2 的诱导也与卵泡内 p g e 2 浓度的急剧增加紧密相关。这些结果表明，在排卵前卵泡内p g 的升高依赖于促性 腺激素对m p g e s 和c o x 2 的协同诱导作用( f i l i o n e ta l ，2 0 0 1 ) 。m p g e s 在小鼠卵巢细胞 中高表达，且与e p 2 受体共表达，说明m p g e s 可能以自分泌的形式调节p g e 2 的合成( g u a n e ta 1 2 0 0 1 、。 1 2 3 p g e s 与着床和蜕膜化 在妊娠1 4 天小鼠子宫中，m p g e sm r n a 在腔上皮和腺体中有低水平的表达。在妊 娠第5 天，m p g e s 蛋白和m r n a 在包围着床胚泡的腔上皮下基质中呈强表达。在假孕小 鼠子宫中，没有相应的m p g e s 表达。在延迟着床的小鼠子宫中，也没有检测到m p g e s 蛋白和m r n a 的表达。用雌激素处理启动胚胎着床后，m p g e s 在包围胚胎的腔上皮下基 质中表达。这表明m p g e s 的表达受处于活性的胚泡所诱导( n ie ta l ，2 0 0 2 ) 。 啮齿类和灵长类动物在妊娠建立之后，子宫内膜基质细胞要分化成为蜕膜细胞，并且 作为母体部分参与胎盘的形成。蜕膜在胚胎着床和提供胚胎营养方面具有重要作用。 m p g e s 蛋白在妊娠5 - 6 天的初级蜕膜中表达，并在妊娠7 8 天整个蜕膜中表达。m p g e s m r n a 在妊娠5 - 8 天的整个蜕膜中都表达，且随着蜕膜化程度的加强m p g e s 蛋白和m r n a 的表达加强。这些结果说明，m p g e s 可能参与小鼠的蜕膜化过程( n ie ta 1 2 0 0 2 ) 。 在小鼠妊娠第1 天的子宫腔上皮和腺体上有较强的e p g e s 蛋白表达。在妊娠第5 天， 在腔上皮中检测到很强的c p g e s 蛋白。c p g e s 蛋白在妊娠第5 天蜕膜中表达较弱，在妊 娠6 7 天的初级蜕膜中表达较强，在第8 天的整个蜕膜中都有表达。与m p g e s 相同，随 着蜕膜化程度的加强，c p g e s 蛋白的表达也加强。这也表明，c p g e s 在小鼠胚胎着床和蜕 膜化过程中具有重要作用( n ie ta l ，2 0 0 3 ) 。但由于目前对m p g e s 和c p g e s 在着床和蜕膜 化过程中的研究仍然很少，并且还未建立两种基因敲除的动物模型，所以它们在生殖过程 中的功能还有待于进一步的探讨。 1 2 4 p g e s 与分娩 哺乳动物的分娩过程很复杂，涉及到母体、胎儿和胎盘之间的相互作用。分娩过程中 的一个明显变化是子宫肌收缩活动的增强。在子宫收缩和分娩过程中，p g 发挥着重要的 作用( w e i s s ，2 0 0 0 ) 。在分娩前和分娩过程中，由胎膜和胎盘合成的p g 明显增加( o l s o ne t a l ，1 9 8 3 ) 。p g 的增加是由于胎膜中c o x 2 的表达水平和活性上调所致。在人的分娩过程 中，p g e 2 的产生增加。两种p g e s 在人胎膜的羊膜上皮中均有表达，在羊膜上皮中还有 丰富的p g e 2 合成的前体物质一花生四烯酸( a a ) 。此外，m p g e s 定位在胎膜的绒毛膜滋 养层，而c p g e s 在绒毛蜕膜层中的成纤维细胞和巨噬细胞中表达。但是两种p g e s 在妊娠 5 东北农业大学农学硕士学位论文 过程中的表达无明显的变化。由此可推测在分娩过程中p g e 2 合成的限速步骤是由c o x 2 控制的( j u l i a n a e ta l ，2 0 0 3 ) 。绵羊中，从妊娠第6 5 天到分娩这段时间内，p g e s m r n a 和蛋 白在胎盘中表达，主要定位在胎儿滋养层绒毛和和母体组织中的血管内皮细胞，可能对于 胎盘组织的血液流动和内分泌功能起到一定的调节作用( m a n i ne ta l ，2 0 0 2 ) 。 1 3 本研究的目的和意义 综上所述，p g e s 在哺乳动物的生殖过程中有重要的作用。目前仅见到有关p g e s 基 因在小鼠早期妊娠子宫中的报道，以及在牛排卵前卵泡中的表达。关于m p g e s 和c p g e s 在小鼠卵泡发育、排卵和黄体发育过程中的研究，目前尚未见报道。本实验旨在利j ； j 原位 杂交和免疫细胞化学的方法，揭示m p g e s 和c p g e s 在小鼠排卵和黄体形成过程中的可能 作用。 6 墼型矍童! 垒垡璧童尘塞窒叁窒墼重垒耋塑薹 2 1 实验动物 2 材料与方法 本实验所用动物为中国昆明白小鼠。动物饲养于人工控制条件下室温2 2 0 c ，光照周 期为1 4 小时光照( 0 6 ：0 0 2 0 ：0 0 ) ，1 0 小时黑暗，可以自由取食、饮水。将未成年雌性小鼠 ( 2 1 日龄，体重1 5 - 1 8 克) 先注射孕马血清促性腺激素( p m s g 5i u 只) 以启动卵泡发 育，4 8 小时后，注射人绒毛膜促性腺激素( h c g ，5i u 只) 以诱发排卵。分别在p m s g 注射后0 5 、l 、3 、6 、1 2 、2 4 及4 8 小时，以及h c g 注射后0 5 、3 、5 、7 、9 、1 l 和1 3 小时取材。另外，自h c g 注射后第1 、2 、3 、5 、7 、9 、1 1 、1 3 及1 5 天( 以注射h c g 的 当天为第0 天) 分别取材。将材料分为两组，一组迅速放入液氮中，7 0 。c 保存，用于原 位杂交实验：另一部分用b o u i n s 固定后石蜡包埋，用于免疫组织化学实验。收集未注射 任何促性腺激素小鼠卵巢作为对照。 2 2 原位杂交方法 2 2 1 冰冻切片的制备 新载玻片( 0 8 2 5 7 5 m m ) 在0 1n 盐酸中浸泡2 小时以上后，用自来水冲洗数遍， 将载玻片上盐酸全部去除。洗净的载玻片在9 5 i 业酒精中浸泡l 天以上，用干净纱布擦 干后，在1 8 0o c 下烘6 小时以上。冷却后用2 的3 氨丙基三乙氧基硅烷 ( 3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y - s i l a n e ，a p e s ) 的丙酮溶液涂片，处理5 分钟后用灭菌的蒸馏水漂 洗两遍。漂洗后的载玻片在6 0o c 恒温箱中烘干过夜，贮存于载片盒中备用。处理过的载 片可保存数月。 使冰冻切片机降温至- 2 4 。c 。从- 7 0 冰箱中迅速取出组织块，放入切片机中平衡3 0 分钟以上。用冷冻包埋剂( t i s s u ef i e e z i n gm e d i u m ) 包埋组织块，并修块使之呈菱形切面。将 组织切成1 0p m 厚的切片，用a p e s 处理过的载片捞片。切好的切片放入切片盒中，在7 0 o c 冰箱中贮存。 2 2 2 探针的制各 2 2 2 1 小鼠m p g e s 探针的制各 根据小鼠m p g e s 全e d n a 序列( g e n e b a n k a c c e s s i o nn u m b e r a b 0 4 1 9 9 7 ) 设计并合成 引物序列。上游引物为5 - c g 鱼塑a c a c l i g c t g g t c a t c a a g ，下游引物为 5 - c g 鱼鱼螋t t c a g c t g c t g g t c a c a g 。使用t r i z o l 提取正常妊娠第7 天小鼠子宫 总r n a 。经过p t r c r 扩增得到4 2 7b p ( 1 0 8 5 1 8b p ) 的p c r 片段，p c r 扩增条件为9 4 c 1 奎些垒些奎兰童兰堡圭兰堡竺圣 3 0 m i n 、6 0 。c3 0 m i n 、7 2 。c4 5 m i n ，共3 5 个循环。由于在上游引物的5 端有e c o r i 酶切位 点，在下游5 端有b a m h l 酶切位点。因此回收该片段后，用e c o r i 和b a m h l 进行双酶切， 克隆到p g e m 3 z f ( + ) 质粒中。克隆的质粒经过测序后，与g e n b a n k 中的小鼠m p g e s 全 c d n a 序列比较，以确定克隆的片段是否正确。分别用e c o r 及b a m h l 酶线状化上述质粒 后，按b o e h r i n g e r m a n n h e i m d 公司的r n a 标记试剂盒说明进行探针的标记，t 7 聚合酶用 于标记正义c r n a 探针，s p 6 聚合酶用于标记反义c r n a 探针。 2 2 2 2 小鼠e p g e s 探针的制各 使用t r i z o l 提取正常妊娠第7 天小鼠子宫总r n a 。根据t a n i o k a 等( 2 0 0 0 ) 设计 的人p 2 3 引物5 a t g c a g c c t g c t t c t g c a 和5 兀a c l c a g a t c t g g c a t 进行 r t p c r 。p c r 扩增条件为9 4 。c3 0 m i n 、6 0 3 0 m i n 、7 2 。c4 5 m i n ，共3 5 个循环。将所得 到的4 8 1b p 的片段回收后，克隆于t 载体( p o e m - t v e c t o r s y s t e m l ，p r o m e g a ) 。将外源 片段插入t 7 及s p 6 启动子序列之间，并测序。使用t 7 和s p 6 引物以及p 2 3 引物进行p c r ， 以鉴定插入方向。t 7 引物为5 - g t a a t a c g a c t c a c t g g ，s p 6 引物为 5 - c g a t t t a g g t g a c a c t a t a 。使用t 7 和s p 6 引物进行p c r 扩增后，得到约6 0 0b p 左右片段，回收抽提后作为探针标记的模板，使用地高辛标记试剂盒标记探针。标记正义 c r n a 探针使用t 7r n a 聚合酶，标记反义c r n a 探针使用s p 6r n a 聚合酶。 2 2 3 缓冲液及溶液 ( 1 ) d e p c 处理水：无菌蒸馏水中加入0 1 ( v ) 焦碳酸二乙酯( d e p c ) ，室温搅拌4 小时 以上，1 2 0o c 高压灭菌2 0 分钟，冷却备用。 ( 2 ) 1 0 p b s ：将8g n a c i 、2g k c i 、3 6 3g n a h 2 p 0 4 1 2 h 2 0 及o 2 4g k h 2 p 0 4 溶于1 0 0 m l d e p c 水中，调p h 至7 4 ( 3 ) 2 0 s s c ：含1 5 m n a c i 及0 1 5 m 柠檬酸钠，p h 7 0 ( 4 ) 2 b s a ：o 0 2g b s a 溶于1m l d e p c 水中 ( 5 ) 缓冲液h1 0 0m m i r i s - h c l ，1 5 0m m n a c i ，p h7 , 5 ( 6 ) 缓冲液l h 1 0 0 m