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RNAI实验步骤案例1、RNAI技术简介RNAi(RNA interference，即RNA干涉)是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA)，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的1。RNAi现象首先是1998年在线虫中发现。Fire及其同事们在尝试着用反义RNA抑制基因表达时，试图研究正链RNA与反义RNA的协同作用，然而他们却意外地发现正链RNA与反义RNA的混合物，即双链RNA对基因的沉默作用较任一单链RNA都要强十倍以上1。这种双链RNA导致的RNA干涉现象随后在果蝇、昆虫、真菌、植物拟南芥等生物及哺乳动物细胞中也分别发现，并且在线虫中，RNA干涉对90%以上的基因的转录后表达产生抑制作用2。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。RNAi机制包含两个过程：首先dsRNA被Dicer切割产生siRNA；然后RISC识别并结合siRNA。介导靶基因mRNA在与dsRNA同源的区段内，按照同样的间隔被降解成2123nt 的小片段3。1.1 microRNA简介microRNA（简称miRNA）是一类由基因组编码、细胞内源表达的、约为22 nt的非编码小RNA。它通过降解靶基因mRNA或抑制其翻译过程（高等动物中主要是后者），来调控真核细胞的基因表达3。虽然microRNA可以引发靶基因mRNA的降解，或转录抑制，但多数情况下（尤其是在高等动物中）主要通过与mRNA 的3UTR不完全的配对抑制其翻译，从而影响很多蛋白质的产量3。1.1.1 miRNA与肿瘤的研究 关于癌症基因研究的的最新进展是miRNA领域，miRNA是长度大约在22个核苷酸的单链RNA分子，miRNA可以通过调节靶mRNA的平移效率来负性调节基因的表达。miRNA参与了许多细胞过程，包括细胞增殖，分化，发育，细胞凋亡，炎症反应，应激反应，能力代谢，衰老，细胞迁移等3。miRNA也可能作为癌基因或抑癌基因，并已在多种肿瘤发现miRNA的异常表达，其中就包括乳腺癌，肺癌，前列腺癌和结肠癌等。 癌症相关的miRNA研究中指出，let-7家族是可以负性调控癌基因Ras基因表达的一种miRNA。Let-7是目前研究最多的miRNA，有多项研究指出在人类肿瘤中各种let-7基因定位在肿瘤基因中的缺失区域4。 C-kit基因是一种编码酪氨酸激酶生长因子的受体蛋白，与大部分恶性肿瘤的发生、增殖、迁移相关。miR-211和miR-222与原癌基因C-kit的蛋白表达量呈负相关。此外，还发现miR-211和miR-222还可以通过抑制抑癌基因P27基因的表达从而促进细胞增殖4。2.实验仪器、材料、试剂2.1细胞系小鼠黑色素瘤细胞系（B16）2.2主要生化材料、试剂盒细胞培养基：DMEM high glucose，RPMI-1640胎牛血清0.25 胰酶二甲基亚砜（DMSO）其余试剂如：无水乙醇、甲醇、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸盐缓冲液（PBS）等均为国产分析纯。2.3主要仪器设备高压灭菌锅微量移液器电子天平细胞计数板高速台式冷冻离心机二氧化碳细胞培养箱倒置显微镜VORTEX涡旋震荡器、高速冷冻离心机、台式离心机、-80低温冰箱、普通冰箱、超净工作台、紫外分光光度计等2.4主要耗材细胞培养板：6孔培养板、96孔培养板细胞培养皿：35mm Dish，60mm Dish，100mm Dish离心管：1.5ml，15ml3.实验方法3.1 miRNA mimics和miRNA inhibitor获得miR-26b-5p的miRNA mimics和miRNA inhibitor均可由生物公司设计合成。3.2 miR-26b-5p引物设计miR-26b-5p其成熟体序列为：UUCAAGUAAU UCAGGAUAGG UU 3.2.1 反转录之后扩增所需引物设计 反向引物（反转录后PCR所需的引物）：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环，固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3， 在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是miR-26b-5p从后面数八个碱基的反向互补序列，即GAUAGG UU的反向互补：AACCTATC，最后得到的反向引物的序列为 ：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AACCTATC -3，53.2.2定量引物设计 正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG 在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：UUCAAGUAAU UCAGGA，将U变成T，最后的序列为： 5，-ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAAT TCAGGA -3， 统一反向引物（(unified reverse primer，URP)：也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCGU6引物上游引物F1 CTCGCTTCGGCAGCACA下游引物R1 AACGCTTCACGAATTTGCGT53.3分组转染3.3.1 miR-26b-5p mimies/miR-26b-5p inhibitor/miR-26b-5p mimies Negative Control/miR-26b-5p inhibitor Negative Control的配置 在超净工作台 ，将miR-26b-5p mimies/miR-26b-5p mimies Negative Control冻干粉各5nmol用25Oul Rase-freeH2O直接溶解，一20C保存。 在超净工作台，将miR-26b-5p inhibitor/miR-26b-5p inhibitor Negative Control冻干粉各5nmol用25Oul Rase-freeH2O直接溶解，一20C保存。63.3.2 B16小鼠黑色素瘤细胞接种1）取15cm已经铺满B16小鼠黑色素瘤细胞的大皿，胰酶消化后细胞计数，按照每35mm小皿中含1.5105 个B16细胞，每个35mm小皿中加入2ml RPMI一1640完全培养基，用于测转染后细胞周期和细胞凋亡。2）按照96孔板每孔中含3000 个B16细胞，每孔中用排枪加入100ul RPMI一1640完全培养基，用来测细胞生长，都置于37C，5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中进行培养。8-10小时后换无血清RPMI一1640完全培养基进行细胞同步。3.3.3 miR-26b-5p mimies/ miR-26b-5p mimies Negative control/miR-26b-5p inhibitor/ miR-26b-5p inhibitor Negative control的转染1） 取1.2.5.1中已经同步的小皿和96孔板的B16细胞，分别标记miR-26b-5p mimies/ miR-26b-5p mimies Negative control/miR-26b-5p inhibitor/ miR-26b-5p inhibitor Negative control及转染日期2）取4只1.5ml EP管，每只EP管分别加入200ul Opti-MEM低血清培养基与10 ul miR-26b-5p mimies/ miR-26b-5p mimies Negative control/miR-26b-5p inhibitor/ miR-26b-5p inhibitor Negative control混匀后，在简易离心机上离心：另取一只1.5ml EP管加入900ul Opti-MEM低血清培养基和90ul脂质体Lipofaetamine2000混匀，简易离心机上离心3）放置5分钟后将有脂质体Lipofaetamine 2000的EP管中液体混匀，分别加到miR-26b-5p mimies/ miR-26b-5p mimies Negative control/miR-26b-5p inhibitor/ miR-26b-5p inhibitor Negative control 的EP管中，其中每个EP管中加入210 ul 脂质体Lipofaetamine 2000和Opti-MEM低血清培养基混合体系混匀，简易离心机上离心。4）上述3）中混合体系放置20分钟后即可进行转染。用真空泵吸去标记miR-26b-5p mimies/ miR-26b-5p mimies Negative control/miR-26b-5p inhibitor/ miR-26b-5p inhibitor Negative control 的小皿中的培养基，加入800ul RPMI一1640完全培养基，用移液枪吸取3中混合体系慢慢加入35mm小皿中，边加边摇晃，防止局部浓度过高杀死细胞。5）96孔板中转染方法与35mm小皿转染方法相同，miR-26b-5p mimies/ miR-26b-5p mimies Negative control/miR-26b-5p inhibitor/ miR-26b-5p inhibitor Negative control 各10个孔，每孔中20ul 3中的混合液，80ul RPMI一1640完全培养基。6）将培养皿内液体上下左右充分摇匀，放入细胞培养箱中37C，5%CO2，饱和湿度的进行培养。7）8-10小时后在倒置显微镜下观察转染后的细胞，可见细胞中有小空泡，给转染后细胞换液，35mm小皿2ml RPMI-1640完全培养基，96孔板100ul RPMI-1640完全培养基，放入细胞培养箱中37C，5%CO2，饱和湿度的进行培养。3.4 转染miR-26b-5p 48h 后B16细胞进行转染效率检测QPCR检测B16细胞miR-26b-5p转染效率1）设计引物。按引物设计的要求根据genebank中的基因序列，应用NCBI引物设计网站设计引物，并由生物公司合成。miR-26b-5p上游引物（F GGCTTCAAG TAATTCAGGATAGG），下游引物为通用引物。2）将反转录得到的B16细胞miRNA产物各取5L与1.5mlEP管中，用800L Nuclease-Free Water稀释后充分混匀，标号B16细胞，日期，稀释比例。3）取已经混合好的上游引物与下游引物7ml（7个QPCR体系）于1.5EP管中，另加入70L GoTaq qPCR Master Mix 2X（7个QPCR体系）充分混匀，共77L。4）对于B16细胞设置3个重复孔，另外设置两个B16细胞的内参（内参为管家基因，配置方法和3相同），同样是每个内参3个重复孔。对于QPCR加样板中的每个孔，先加入稀释的miRNA 9L，再加入已经混合好的引物和酶混合物11ul，加完所有后封好膜，防止PCR过程中反应体系挥发。整板离心，2000rpm离心3min使壁上的液体充分流到管底。（内参引物为上游U6引物，下游通用引物）5）设置程序，将配好的反应物放入PCR槽中，运行程序。 待反应完全，收集数据并分析