（放射医学专业论文）单细胞凝胶电泳作为辐射生物剂量计的研究.pdf

英文缩略词表 中文摘要一 a b s t r a c t 刖吞 目录 材料与方法 一7 9 l l 1 实验材料一一一1 l 1 1 主要试剂 1 2 主要仪器 1 3p b s 的配置 1 4 中和液的配置 1 5 中性裂解液( 1 y s a t e ) 一 1 6 中性电泳液一一 1 7 碱性裂解液一 1 8 碱性电泳液 1 9 琼脂糖凝胶 1 1 1 1 1 1 一1 2 1 1o e b 染色液一 1 1 1t r i s h c l 1 1 2n a o h 溶液 1 1 3 r p m i1 6 4 0 培养液 2 实验方法 1 2 1 2 1 2 一13 13 2 1d n a 损伤的辐射剂量效应关系一1 4 2 1 1 血样采集与照射一1 4 2 1 2 淋巴细胞分离 2 1 3 中性单细胞凝胶电泳一 2 1 4 彗星图像分析 2 1 5 统计学处理 2 1 6 结果 2 1 7 讨论 2 2 辐射诱导的d n a 双链断裂时效性研究 2 2 1 血样采集与分组 2 2 2 照射条件 2 2 3 淋巴细胞分离 1 5 一1 5 1 6 一1 7 2 2 4 中性睢细胞凝胶电泳实验一 一2 一 1 7 一1 7 2 2 5 彗星图像分析及统计学分析 2 2 6 结果一 2 2 7 讨论 2 3 放射工作人员d n a 损伤评价 2 3 1 观察对象 2 3 2 试验对象信息采集 2 3 3 分组一 2 3 4 方法 1 7 2 3 5 实验结果 2 3 6 讨论 1 9 1 9 1 9 2 0 2 l 1 2 2 2 4 2 4 碱性s c g e 用于辐射损伤快速剂量估算的时效和量效关系研究2 4 2 4 1 取血及照射 2 4 2 照射条件 2 4 3 淋巴细胞分离 2 4 4 碱性单细胞凝胶电泳 2 4 一2 5 2 5 2 4 5 彗星图像分析一一 2 4 6 结果一 2 4 7 讨论一 结论 论文参考文献 附录一一 综述 致谢一 独创性声明一 学位论文版权使用授权书 2 5 2 5 2 5 2 7 2 9 一3 0 3 3 5 0 一一5 6 5 7 3 一 5 7 英文缩略词表 缩略词英文名称 s c g e s i n 四ec e l lg e le l e c t r o p h o r o s i s e b e t l l i d i u mb m m i d e e d l a e t i l y l e n ed i 锄i n et e t 船c e t i ca c i d d m s o d i m e t h y ls u l p h o x i d e s d ss o d i u md o d e c v ls u l 矗l t e p b s p h o s p h a t eb u 妇衙s 0 1 u t i o n t n s t r i s h y d r o x y m e t h y l 锄i n 0m e t h a n e c a s p c o m e ta s s a ys o 胁a r ep r o j e c t t r i t o n x 】0 0 4 中文名称 单细胞凝胶电泳 溴化乙锭 乙二铵四乙酸 二甲基亚砜 十二烷基黄酸钠 磷酸盐缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 彗星试验软件项目 中文摘要 单细胞凝胶电泳( s i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，s c g e ) ，又称彗星试验 ( c o m e ta s s a y ) ，是近年来由o s t l i n g 等建立，经s i n g h 等心1 改进的用于检测有核细 胞d n a 损伤的技术，可在单个细胞水平上检测d n a 损伤和修复。有研究文献报道口 5 1 ， 对于放射性工作人员d n a 损伤的评价，s c g e 的结果与染色体畸变、微核试验的结果 基本一致，而s c g e 的敏感性更高，速度更快。本研究的目的是采用中性单细胞凝胶 电泳技术：检测d n a 辐射损伤的剂量一效应关系，从而拟合剂量一效应曲线；检 测辐射诱导的d n a 双链断裂时效性研究，拟合修复曲线；放射工作人员的d n a 损伤 情况，探讨不同工种、工龄、吸烟、性别等对d n a 损伤的影响，探讨中性s c g e 作为放 射工作人员健康查体的指标；探讨碱性s c g e 用于辐射损伤快速剂量估算的可行 性。 随着辐射分子生物学研究的不断深入，越来越多的电离辐射研究转向d n a 的损 伤和修复。d n a 链断裂特别是双链断裂的检测方法是研究辐射损伤的一个关键技术。 单细胞凝胶电泳，是2 0 世纪8 0 年代建立起来的检测d n a 损伤和修复的敏感技术3 。 方法：用中性单细胞凝胶电泳技术检测辐射诱导的d n a 双链断裂，c a s p 软件 分析彗星图像，主要观察彗星尾部d n a ( t d n a ) 、尾矩( t m ) 和o l i v e 尾矩( 0 t m ) 等 指标，s p s s1 6 o 软件拟合剂量一效应曲线。对离体外周血淋巴细胞不同剂量照射 后即刻、3 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 的中性单细胞凝胶电泳实验，拟合不同剂量的修复曲 线方程，进而拟合双链断裂时效性的平面模型。研究对象分为对照组和放射组； 又按照工种，将放射组分为放射诊断组、介入组和骨科组；按照工龄的不同，分为 1 0 、1 0 和2 0 3 6 年组。用中性单细胞凝胶电泳对对照组和各放射组进行检测。 应用碱性单细胞凝胶电泳技术( s c g e ) ，采用人外周血离体照射方式，检测受y 射 线照射的外周血细胞d n a 损伤修复的时间效应和剂量效应关系。 试验结果彗星试验各指标均呈显著剂量一效应关系，以o t m 指标的拟合优度最 佳。各个剂量的修复曲线呈较好的线性关系，拟合曲面的光滑度较好。放射组 与对照组d n a 损伤的差异有显著性，放射组的尾部d n a 百分含量( t d n a ) ，尾矩( t m ) ， 0 1 i v e 尾矩( o t m ) 明显高于对照组，不同工种，工龄间均差异有显著性；介入组高 于放射诊断组，放射诊断组高于骨科组。离体实验结果发现，照射后即刻人外周 血细胞尾矩t m 值随剂量增加而增加，照射组与未照射组之间差异非常显著p o 0 5 ) 结论：中性单细胞凝胶电泳技术结合c a s p 软件的应用，可以得出很好的剂量 一效应曲线，有望成为新一代辐射生物剂量计。不同剂量下的损伤修复呈线性关 系，修复曲面模型可供辐射原发损伤估算时参考。长期小剂量电离辐射能引起放 射工作人员d n a 损伤，随着工龄的增加d n a 损伤程度加重。试验结果表明，碱性单 细胞凝胶电泳是一种快速、灵敏检测d n a 损伤的有效方法，具有良好的剂量一效应关 系；但修复较快，可测时间范围有限。 本研究创新之处在于，中性单细胞凝胶电泳技术的应用，中性s c g e 检测d n a 的 双链断裂，而d n a 双链断裂较单链断裂更加稳定，更适合做为检测的对象。 关键词单细胞凝胶电泳d n a 损伤辐射生物剂量学放射工作人员 a b s t r a c t s i n 西ec e l lg e le l e c t m p h o r e s i s ( s c g e ) ，o rc o m e ta s s a ye s t a b l i s h e db yo s t l i n g ， m o d i f i e db ys i n g h ，i su s e dt od e t e c td n a d 锄a g e so fk a r ) ，0 c y t e ，w h i c hc a nd e t e c td n a d a m a g e si ne u k 邺t i ci i l d i v i d l l a lc e l l s s o m ep a p e r sr e p o r t e dt l l a tc o m p a r e dt oc 1 1 1 o s o m e a b e r r a 【t i o na n dl i l i c r o n u c l e i t e 鸭c 0 n c e m i n gr a d i a t i o n w o r k e f s d n ad 锄a g e s e s t i m a t i o i l m eo u t c o m eo fs c g ei sh o m o l o g o u s c 吣r e s e a r c ha i m e da t ：oe x p l o r ea n e w ，s i l l l p l e 锄dq u i c kr a d i a t i o nb i o d o s i m 鼬w i l i c h c a i lb e a p p l i e d t oe s t i m a t e b i o l o 酉c a ld o s ei nc a s eo f r a d i a t i o na c c i d e n t ， a i l da c q u i r cd o s e - e f i 谴c i 】r s e ；e x p l o r e d t i i i l ee 疏c t i v 觚e s so fd n a r 印a i ra r e ri m d i a t i o i l 锄dd e s 嘶b e dc l l r v e sa n dp l a n eo f d n a r e p a i r ，t h e ni m p r o v e dt h ea c c u r a c yo fe s t i m a t i o no fr a d i a t i o nb i o d o s i m e t 哆m e r r a d i a t i o na c c i d e n t ，a i l d a c q u i r er 印a i rc u 】r v e ；t oi n v e s t i g a t em es t a t u so fd n a d a m a g e so fr a d i a t i o nw o f k e r s ，a n dd i s c u s st h er e l a t i o n s h i pb e 觚e e i lm ed i 脓e n tt y p e so f w o r ko rw o r kt i m ea 薹1 dt h el e v e lo fd n ad 锄a g e ，a l l de x p l o r et h ef e a s i b i l i t yo fn e u t r a l s i n 舀ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i ss e r v i n ga sai n d e xo fr a l d i a t i o n w o r k e r s p h y r s i c a l e x 锄i n a t i o n ( d t 0e x p l o r et h ef e a s i b i l i t yo fu s i n ga l k a l i n es i n 百ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s t or a p i de s t i m a t et h ed o s eo fr a d i a t i o nd a m a g e 、斩mt h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i 0 1 0 9 yo fr a d i a t i o n ，m o r e 觚dm o r er e s e a r c ho f i r r a d i a t i o nc a m et o w a r dd a nd a m a g e sa n dr 印a i _ r s t h e ( 1 e t e c t i o nm 甜l o do fd n as t r a n d b r e a k s ，e s p e c i a l l y d o u b l es t a n db r e a k si sa嘶t i c a l t e c l l n i q u e s i n 西e c e l l g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( s c g e ) e s t a b l i s h e di nt h ee i 出t i e si sas e n s i t i v em e t h o du s dt od e t e c t d n a d 锄a g e sa 1 1 dr e p a i r s t h ec o n t e n t so fo l l rr e s e a r c h ：d n ad o u b l e s t r a n db r e a kw e r ed e t e c t e du s i n g n e u t r a ls i n 酉ec e l l g e le l e c t r o p h o r e s i s ( s c g e ) ，a n da u t h ei n d e x e so fc o m e ta s s a y i n c l u d i n gt d n a ，t ma n d0 t mw e r ea n a l y z e db yc a s p ( c o m e ta s s a ys o f t w a r e p r i d j e c t ) t h ec u eo fd o s e e ：f i e c tw a sf i t t e du s i n gs p s sl6 0s o 胁a r e ；d e t e c t e dd n a d o u b l e - s t r a n db r e a ka i l dr 印a i ri nl 舯p h o c ”e so fh u m a nu s i n gn e u t r a ls i n 西ec e l lg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( s c g e ) a r e rd i h b r e n td o s e o fr a d i a t i o ni n3 h ，2 4 h ，4 8 h ，7 2 ha n d e s t i m a t e dc u r v e sa 1 1 dp l a n eo fd n ar e p a i r ；t h eo b j e c t sw e r ed i v i d e di n t oc o n t r o l g r o u pa n dr a d i a t i o ng r o u p ，a n dt h el a t t e rw a sd i v i d e di n t od o c t o r sa tr a d i a t i o nd e p a m e n t g r o u p ，c a r d i o l o 西s t sg r o u pa n do r t h o p a e d i cs u r g e o n s 舯u pa c c o r d i n gt o 帅e so fw o r k ， a i l d 1 0g r o u p ，1 0 g r o u pa n d2 啦3 6y e a r so l e 黟o u pa c c o r d i n gt ow o r kt i m e 1 1 1 en e u t r a l s i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s ( s c g e ) w a su s e dt od e t e c tt l l ed n ad 锄a g eo fc o n t r 0 1 g r o u pa n de a c hr a d i a t i o ng r o u p u s i n ga l k l i n es i n 舀ec e ug e le l e c t r 叩o r e s i st od e t e c t d n a d a m a g eo fp e r i p h e r a ll y m p h o c y t e ，i r r a d i a t e db yt h eo fh u m a np e r i p h e r a lb l o o d 7 t h et e s to u t c o m ei n d i c a t e d s t a t i s t i c a l l ys i 凹i f i c a l l td o s e - e f e c tr e l a t i o n s h i p sw e r e o b s e e di na nt h ei n d e x e so fc o m e ta s s a y ，o t mw a ss u p e r i o rt oo t h e ri n d e x t h e 仉l r v e so fd n a r 印a i ri nv i t r i do fh u m a nl y i n p h o c ”e sp r e s e l l t e di l i c em o d e la n d t h er e p a i r o fr a d i a t i o n p l a l l ep r e s e n t e dg o o ds m o o t l l i l e s s t h ep a r 锄e t e r so fd n ad 锄a g ei i l r a d i a t i o n 蓼o u pa r es i 盟i f i c a n td i 侬鹏n t 舶mc o n 仃o lg r o u p ，f o re x 锄1 p l e ，m et d n a ， t m ，c t mw e r ei n u c hl l i 曲e rt l l 趾t h o s eo fc o l l t r o lg r o 印s i 班f i c a n td i 仃e 鼢c ew 嬲 f o u n d a m o n gd i 岱嬲l tt y p e s o fw o r k0 rd i f f 醯e i l tw o r kt i m c 孤dm ei n v a s i v e c a r d i o l o 西s t sg r o u pi sh i 曲e rm a nd o c t o r sa tr a d i a t i o nd 印a n m e n tg r o u pa 1 1 dm el 砒e r h i g h e rt h 觚o r t h o p a e d i cs u r g e o n s 黟o u p m eo u t c o m eo ft e s ti l l 们i n d i c a t e dm a t m e r ew a sr e m 破a _ b l ed i 丘确l c eb e t e 髓m ec o n t r o lg r o u pa n dt h er a d i a t i o ng r o u p q 1 3 o n a 2 e d t a 2 h 2 0 1 m m n a o ho 3m m 1 9 琼脂糖凝胶由于是微凝胶，故用染色体培养基试剂盒小瓶，每瓶装o 0 3 7 5 9 琼脂糖，铺胶时加双蒸水5 m 1 ，加热即可。 1 2 1 1 0e b 染色液配制使用o 7 m l 离心管加2 0p 咖le b 溶液，稀释l o 倍，注意， 需要在染色前新鲜配制。 1 1 1t r i s h c l ( 1 m o l 几)8 0 0 m l 蒸馏水溶解1 2 1 1 9t r i s 碱，以浓盐酸调p h 值至 所需值，加水定容至l l ，分装后1 0 3 4 1 0 5 p a 高压灭菌。 1 1 24 mn a o h 溶液称4 克n a o h 于无i 埘a s e 玻璃瓶中，加入1 0 0 m l 双蒸水 1 1 3r p m i1 6 4 0 培养液 成分m g l 四水硝酸钙 1 0 0 l 一羟脯氨酸 2 0 谷胱甘肽( 还原型) 1 氯化钾 4 0 0 l 一异亮氨酸 5 0 苯酚红 5 无水硫酸镁 4 8 8 4 l 一亮氨酸 5 0 d 一生物素 0 2 氯化钠 6 0 0 0 l 一盐酸赖氨酸 4 0 泛酸钙 0 2 5 无水磷酸氢二钠 8 0 0 l 一甲硫氨酸 1 5 氯化胆碱 3 l 一盐酸精氨酸 2 0 0 卜苯丙氨酸 1 5 叶酸 l l 一门冬酰胺 5 0 l 一脯氨酸 2 0 肌醇 3 5 l 一门冬氨酸 2 0 l 一丝氨酸 3 0 烟酰胺 1 l 一胱氨酸盐酸盐 6 5 1 5 l 一苏氨酸 2 0 对氨基苯甲酸 1 i 。一谷氨酸 2 0 l 一色氨酸 5 维生素b 6 1 l 一谷氨酰胺 、 3 0 0 l 一酪氨酸 2 0 维生素b 2 0 2 甘氨酸 l o l 一缬氨酸 2 0 维生素b 1 1 l 一盐酸组氨酸 1 5 无水葡萄糖 2 0 0 0 维生素b 1 2 o 0 0 5 p h 值7 5 8 1 0 ( 力日n a h c 0 b ) 7 2 0 7 8 0 ( 不力日n a h c 0 。) 干燥减量的质量分数( ) 5 0 渗透压( m o s m k g h 。o )2 6 5 2 9 3 ( 加n a h c 0 3 ) 2 2 5 2 4 9 ( 不办口n a h c o 。) 细菌内毒素( e u m 1 ) l 1 0 5 个m l 。继续维持4 8 h ，细胞 数量应1 1 0 5 个m l ( 细胞生长试验) 2 、试验方法 2 1d n a 损伤的辐射剂量效应关系 2 1 1 血样采集与照射选志愿者两名，成年健康男、女各l ，无吸烟及酗酒史， 无射线及工业毒物接触史。每名志愿者抽取外周血2m l ，肝素抗凝，每个血样再分 成7 份，每份o 2 5m l ，分别标记为对照组、o 5 、1 、2 、3 、4 和5g y 照射组。c s l 3 7 y 射线照射，吸收剂量率o 8 4 51g y m i n ，对照组不予照射。 2 1 2 淋巴细胞分离血样沿离心管壁轻轻加在等体积淋巴细胞分离液面上，4 0 0 0 r m i n 离心2m i n ，离心后吸取中间层淋巴细胞，置于5m l 离心管中，加p b s 至2m 1 ， 2 0 0 0r m i n 离心4m i n ，弃上清。如此重复洗涤2 次，再将淋巴细胞悬于p b s ，调整 细胞密度为2 1 0 4 m l ，置4 冰箱备用。 2 1 3 中性单细胞凝胶电泳参照b a n a t h 等 2 ，7 】的方法，采用自制电泳玻片和两层 铺胶法： 铺胶：取1 0 0 灿币常熔点琼脂糖凝胶均匀铺于自制微电泳槽内，置4 冰箱固 化，3 5 灿淋巴细胞悬液与6 5 此低熔点琼脂糖凝胶混匀后均匀铺于第1 层凝胶上面， 置于4 冰箱固化； 裂解和电泳：胶板置于新鲜配制的中性裂解液，4 冰箱中裂解1 5h ；用双蒸 水漂洗去掉多余的盐分，于4 电泳液中静置2 0m i n ，然后在3 0v ，1 m n a 电泳条件 下电泳2 岫i n ； 染色和观察：溴化乙锭( e b ) 染色，双蒸水漂洗，荧光显微镜下观察彗星，用 n i k o n 相机随机摄取彗星图像，每个剂量点拍摄5 0 个彗星图像。 2 1 4 彗星图像分析彗星图像采用波兰弗罗茨瓦夫( u l l i v e r s i t yo f w r o c l a w ) 大学提 供的c a s p 系统自动分析，分析结果用s p s s1 6 o 统计软件直接读取。选取彗星尾 部d n a ( t d n a ) 、尾矩( 1 m ) 和o l i v e 尾矩( o t m ) 作为分析指标。 2 1 5 统计学处理用s p s s1 6 o 统计软件对上述指标进行单因素方差分析和组间 两两对比，并进行曲线拟合。 2 1 6 结果 2 1 6 1 离体人淋巴细胞照后致d n a 双链断裂：人外周血淋巴细胞经0 5g yy 射线外照射，诱导d n a 双链断裂。d n a 经过解旋，在电场的作用下，d n a 断片在 电泳液中离开核区域向阳极迁移，形成特征性的彗星状拖尾。由于实验结果发现分 别来自男、女志愿者的彗星各项指标差异无统计学意义，故将两人的数据合并后进 行统计学分析。d n a 双链断裂的各项指标见表1 。由表l 可见，随照射剂量的增大， 彗星的尾部d n a 、尾矩和0 l i v e 尾矩逐渐增加，呈显著的剂量效应关系。 2 1 6 2 表l 、离体人淋巴细胞y 射线外照射后d n a 双链断裂的各项指标( 石s ) 剂量效应曲线拟合：c a s p 软件分析得到的各项指标( t d n a 、t m 、0 t m ) 与 受照剂量经s p s s1 6 0 进行曲线拟合后，得到的曲线方程如下，其中y 为实测值， d 为辐射剂量( g y ) ： t d n a ： y ) n a = l1 9 9 4 6 + 9 6 8 8 9 d ( r = 0 8 7 1 ，p o 0 1 ) y 而n a = 1 3 2 6 0 5 + 1 2 3 1 8 9 d + o 5 7 3 8 d 2 ( r _ = o 8 7 0 ，p o 0 1 ) t m ： y ，i m = 1 1 8 8 5 + 1 2 0 5 6 3 d ( r = o 8 5 0 ，p o 0 1 ) y h = 3 4 4 5 6 + 2 5 8 7 4 d + 2 4 3 6 7 ( 形= o 8 8 0 ，p 0 0 1 ) o 田m ： y 仃i m = 2 2 3 5 8 + 5 4 9 3 6 d ( r = o 8 5 5 ，p o 0 1 ) ，y r 0 删= 3 1 4 3 6 + 1 7 5 6 9 d + 1 0 0 1 0 d z ( r _ = o 8 9 5 ，p o 0 1 ) 2 1 7 讨论 有报道认为：用单细胞凝胶电泳( s c g e ) 技术分析离体和整体照射诱导淋巴细胞 d n a 双链断裂的各项指标差异无统计学意义，可以用离体血照射来反映整体照射 所致的d n a 损伤。 s c g e 技术观察细胞d n a 损伤的剂量效应关系：在s c g e 方法刚刚建立时就被 证实了其检测指标具有剂量。效应关系。后来，随着研究不断深入，在中国仓鼠卵巢 细胞【1 7 1 、肿瘤细胞【1 8 ，1 9 1 和生殖细胞【2 0 】中均发现显著的剂量效应关系。 s i n 曲等【2 l 】用0 o 2 5g yx 线照射离体人淋巴细胞，结果发现d n a 迁移长度与 辐射剂量均呈直线模式，p o 0 5 ，r 分别为o 7 7 和o 5 l ，但其研究所用的辐射剂量 范围较小。s c g e 法观察淋巴细胞d n a 损伤的影响因素较多，包括吸烟习惯、感 染、空气污染及饮食习惯等，但是这些因素引起的d n a 损伤绝大多数是以d n a 碱 基损伤和丢失以及d n a 单链断裂的形式出现 2 2 】，而双链断裂相对较少见，说明d n a 双链断裂较单链断裂更具有辐射损伤特异性【2 3 1 。研究表明，d n a 双链损伤的错配 修复是构成不同品质电离辐射诱发的以稳定性畸变为特征的关键因素。电离辐射所 致的d n a 损伤导致各种类型的突变，像大片段缺失和重排等较大的改变可能是由 于d n a 双链断裂引起的。一般认为，d n a 双链断裂是可用体细胞和生殖细胞突变 来证明的细胞核临界损伤最恰当的指标。目前绝大多数s c g e 研究均是通过在显微 镜下目测彗星长度或尾长分析剂量效应关系，其不足之处是在较大剂量时曲线平台 的出现【2 4 】。在一定的辐射剂量范围内，随着照射剂量的增大，d n a 双链断裂点越 多，d n a 片段越小，尾长越长。如果辐射剂量超过此剂量范围，即使剂量增大， d n a 片段不再减小，只是表现为片段增多，电泳后，尾长不再增加，因而长度指 标( 如t l 或c l ) 的剂量效应曲线出现平台。而且目测彗星尾长或彗星全长，主观因 素较多，人为误差较大。而矩类指标( 尾矩，o l i v e 尾矩) 较长度指标更灵敏和准确， 即使剂量较大时也不会出现平台【2 5 】，符合辐射生物剂量学指标应具备的条件。本研 究用c a s p 软件自动分析实验所得的彗星图像，使实验结果更加客观准确，避免了 人为误差。而且着重观察了t m 和o t m 两个比较灵敏的指标，并和其他指标进行 对比分析，更加提高了s c g e 技术作为辐射生物剂量计的准确性和灵敏度。本研究 采用中性s c g e 技术，检测o 5g yc s l 37 射线照射后的淋巴细胞d n a 双链断裂 ( d s b ) ，从彗星分布图可见，随照射剂量增大，受损细胞增加，损伤程度加重， 呈现明显剂量效应关系。综合考虑所得曲线的形态、方程的简易程度和拟合优度判 定系数r ，筛选符合要求的曲线方程。最佳方程在t d n a 符合y = a + b d 模式， 而t m 和o t m 得到的方程符合y _ a + b d + c d 2 模式。在所有曲线中，彗星o t m 的 拟合优度最高，说明这个指标在实验选择的剂量范围内，最能灵敏、准确地反映照 射后的d n a 损伤程度。 综上所述，本研究建立并改良了中性s c g e 方法，用来检测辐射诱导的离体人 淋巴细胞d n a 损伤，可以作为辐射生物剂量学的一个生物终点。另外，该技术在 照后的最佳取血时间和是否适合更宽泛的检测剂量范围尚需深入研究，并且进一步 通过人群调查研究校正年龄、性别和吸烟等因素对s c g e 各项指标的影响。相信随 着研究的不断深入，s c g e 技术有望成为新一代辐射生物剂量计，在核辐射事故患 者的早期分类诊断中发挥重要作用。 2 2 辐射诱导的d n a 双链断裂时效性研究 2 2 1 血样采集与分组志愿者选择：成年健康男性一名，无吸烟及酗酒史，无射 线接触史，无工业毒物接触史。取血及分组：抽取外周血1 2 m l ，肝素抗凝，将血样 分成3 5 份，每份o 3 m l ，分成7 组，对照组和1 、2 、3 、4 、5 、6 g y 实验组，每组 分照射后o 、3 、2 4 、4 8 、7 2 h 检测样本5 份。0 h 和3 h 样本分装到p c r 薄管中，2 4 、 4 8 、7 2 h 样本分装到有5 m l 染色体培养基的青霉素小瓶内，照后3 7 恒温培养。 2 2 2 照射条件c s l 3 7y 射线照射，吸收剂量率：o 8 4 5 1 g y m i n 。实验组照射剂量 分别为1 、2 、3 、4 、5 、6 g v ，对照组置于相同环境，但不予照射。 2 2 3 淋巴细胞分离血样沿离心管壁轻轻加在等体积淋巴细胞分离液面上，4 0 0 0 r m i n 离心2m i n ，离心后吸取中间层淋巴细胞，置于5 m l 离心管中，加p b s 至2m l ， 2 0 0 0r m i n 离心4m i n ，弃上清。如此重复洗涤2 次，再将淋巴细胞悬于p b s ，调整 细胞密度为2 1 0 2 i m l ，置4 冰箱备用。 2 2 4 中性单细胞凝胶电泳实验参考b a n a t h 等的方法，自制电泳玻片槽和改进 铺胶方法。电泳参数根据电泳槽的实际尺寸调整到3 0 v ，厘米电压约合1 2 v ，电流 约1 0 m a 。 2 2 5 彗星图像分析及统计学分析彗星图像采用波兰弗罗茨瓦夫( w 硒c l a w ) 大学 提供的c a s p 系统自动分析，分析结果输出取( h d n a ) 、尾部d n a ( t d n a ) 、 彗星尾长( t l ) 、彗星全长( c l ) 、尾矩( t m ) 和o l i v e 尾矩( o t m ) 共6 个分析指标。所 有指标0 1 i v e 尾矩( o t m ) 最能灵敏、准确地反映双链d n a 损伤程度，同时在用各个 彗星分析指标进行各种曲线拟合时，彗星o t m 的拟合优度最高，所以采取了对o l i v e 尾矩( o t m ) 进行单因素方差分析。 2 2 6 结果 2 2 6 1 不同剂量照射后不同时相点的残存d n a 损伤 表1 分析了离体外周血经”7 c sy 射线1 6 g y 照射后不同时相点的残存d n a 的o l i v e 尾矩。每个样本随即拍取6 0 张细胞电泳荧光图像用c a s p 软件分析，照后 3 h 可见d n a 发生明显修复，随照后时间的推移，d n a 损伤的修复增加，残余损伤 逐渐减少，至照后7 2 h ，彗星各项指标与对照组比较仍存在统计学差异。 表21 3 7 c 8y 射线1 弼y 照射人血后不同时相点的残存d n a 的o t m ( x s ) 幸：除对照组不同时相的o t m 值未见统计学差异之外，其余各组进行组间两两对比，均为氏o 0 1 。 2 2 6 2 不同时相点检测d n a 的剂量效应曲线 采用m a t l a b 7 8 中的c f b d o l 工具拟合不同时相的剂量效应结果来看，三次方程达 到了较好的效果，除照后7 2 h 的曲线优度接近0 9 9 外，其余各时相点的剂量效应曲 线优度均高于o 9 9 ，即符合科学计算应用的要求，所以不同时相的剂量效应曲线可 以用y a 刑= a x 3 + b x 2 + c x + d ( y o 例为0 t m 的实测值，x 为受照射剂量) 来表示，其 中a 、b 、c 、d 随时间改变而改变。 照射后的剂量效应方程：y a t m = 0 5 7 8 9 x 3 6 9 6 8 x 2 + 3 3 3 7 x + 1 6 1 5 ( r 2 = 0 9 9 7 9 ) 照射后3 h 剂量效应方程：y o t m = o 3 3 9 7 x 3 4 3 6 4 x 2 + 2 5 4 x + 1 4 3 ( r 2 = o 9 9 3 9 ) 照射后2 4 h 剂量效应方程：y 硎= o 4 9 0 8 x 3 4 6 1 4 x 2 + 1 9 1 6 x + 1 4 8 9 ( = o 9 9 8 ) 照射后4 8 h 剂量效应方程：y c r r m = o 2 6 4 7 x 3 2 2 5 7 x 2 + 1 0 9 5 x + 1 7 6 ( r 2 = o 9 9 9 9 ) 照射后7 2 h 剂量效应方程：y 洲= o 0 0 2 2 2 2 x 3 o 3 0 4 x 2 + 5 8 1 8 x + 1 1 5 6 ( = o 9 7 7 7 ) 2 2 6 3 不同剂量照射后d n a 损伤修复曲线 在拟合单个剂量下的辐射诱导d n a 双链断裂在7 2 h 内的修复曲线时，二次方 程y 洲：i l l x 2 恤+ k ( 方程中y 洲为指标o t m 的实测值，x 为照后时间h ，m 、n 、 k 随剂量改变而改变) 可达到较好效果，曲线的优度均接近或大于o 9 9 。 1 g y 的7 2 小时内修复曲线方程：y 洲= o 0 0 2 1 1 9 x 2 0 4 2 5 9 x + 2 5 7 3 ( r 2 = o 9 5 3 7 ) 2 g y 的7 2 小时内修复曲线方程：y 叽m = o 0 0 6 4 1 8 x 2 0 9 1 8 x 斗4 4 1 ( r 2 = 0 9 8 4 7 ) 3 g y 的7 2 小时内修复曲线方程：y a t m = 0 0 0 7 6 1 5 x 2 1 0 1 9 x + 5 2 2 9 ( r 2 = o 9 9 1 4 ) 4 g y 的7 2 小时内修复曲线方程：y o t m = 0 0 0 6 7 5 9 x 2 o 9 9 4 6 x + 5 6 9 5 ( r 2 = 0 9 8 7 9 ) 5 g y 的7 2 小时内修复曲线方程：y a 刑= o 0 0 6 0 7 7 x z 1 0 6 9 x + 6 7 6 2 ( = 0 9 8 9 6 ) 6 g y 的7 2 小时内修复曲线方程：y o t m = 0 o 0 0 1 7 8 5 x 2 一o 6 5 8 7 x + 7 3 3 l ( r 2 = o 9 9 2 8 ) 2 2 7 讨论 近年来科学家对电离辐射引起的细胞致死的分子机制同益重视，随着辐射分子 生物学研究的不断深入，越来越多的研究将转向d n a 的损伤和修复。d n a 链断裂 特别是双链断裂的检测方法是研究辐射损伤的一个关键技术。 从照后不同时相点的d n a d s b 修复曲线方程模型来看，人离体照射淋巴细胞 体外修复曲线方程模型与动物体内修复曲线方程模型相同，均以对数方程为最佳。 从修复速度来看( 以o t m 为例分析) ，照后3 h 的残存d n a 损伤约占照后o h 的4 4 6 ，然后随时问的推移，修复速度减慢，人离体血和动物体内实验结果基本一致。 以上均说明，本次实验用离体人淋巴细胞照射，观察其修复过程，并拟合修复曲线， 可以基本反映体内d n a d s b 的修复水平与速度。 g a r a i v i r h o v a c 【2 7 】等用s c g e 方法观察了一次辐射事故( 吸收剂量：0 2 2 1 s v ) 后，受照患者不同时间点( 1 d 、1 w 、2 w 、2 m 、8 m 和l y ) 的淋巴细胞d n a 修复情 况，发现照后一年内患者淋巴细胞彗星尾长和尾矩随时间的延长而下降，但仍大于 正常对照者( p 2 0 支日为标准) 不吸烟组 吸烟组 2 3 3 4 职业组按工种分组 骨科组 2 0 放射诊断组 介入组 2 3 3 5 职业组按工龄分组 2 0 支日为标准) 不吸烟组 吸烟组 2 3 4 方法 2 3 4 1 淋巴细胞分离密度梯度离心法分离人外周血：血样沿离心管壁轻 轻加在2 倍体积淋巴细胞分离液面上，4 0 0 0r m i n 离心2m i n ，离心后吸取中间层淋 巴细胞，置于5m l 离心管中，加p b s 至3m l ，2 0 0 0r m i n 离心4m i i l ，弃上清。如 此重复洗涤2 3 次，再将淋巴细胞悬于p b s ，调整细胞密度为2 4 1 0 4 m 1 ，置4 冰箱备用。 2 3 4 2 中性单细胞凝胶电泳参照b a n a t h 等【2 ，7 】的方法，采用自制电泳玻片 和两层铺胶法： 铺胶：取l o o 曲正常熔点琼脂糖凝胶均匀铺于自制微电泳槽内，置4 冰箱固 化，3 5 止淋巴细胞悬液与6 5 此低熔点琼脂糖凝胶混匀后均匀铺于第l 层凝胶上面， 置于4 冰箱固化； 裂解和电泳：胶板置于新鲜配制的中性裂解液，4 冰箱中裂解1 5h ；用双蒸 水漂洗去掉多余的盐分，于4 电泳液中静置2 0m i n ，然后在3 0v ，1 0 m a 电泳条件 下电泳2 0 m i n ； 染色和观察：溴化乙锭( e b ) 染色，双蒸水漂洗，荧光显微镜下观察彗星，用 n i k o n 相机随机摄取彗星图像，每个剂量点拍摄5 0 个彗星图像。 小结 电泳玻片为我实验室自制，用宽约2 3 m m ，长约2 5 锄的细玻璃条用胶水粘于 载玻片，围成两个孔槽，使用方便，同时第一层琼脂糖为正常熔点，与载玻片结合 紧密，不易脱胶。 2 3 4 3 彗星图像分析和统计学分析彗星图像采用波兰弗罗茨瓦夫 ( u n i v e r s i t yo fw 硒c l a w ) 大学提供的c a s p 系统自动分析，分析结果用s p s s1 6 o 统计软件直接读取。选取彗星尾部d n a ( t d n a ) 、尾矩( t m ) 和o l i v e 尾矩( o t m ) 作为分析指标。 2 3 4 4 统计学处理用s p s s1