（微生物学专业论文）微生物酶法转化dlatc合成l半胱氨酸相关酶系的研究.pdf

查茎垄兰堡主芏堡垒查茎圭壁一 摘要 l 一半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品以及 饲料工业。从土壤筛选获得了一株假单胞菌t s l l 3 8 ，可转化d l a t c 合成l 一半 胱氨酸。本研究从菌株鉴定、产物的鉴别、产酶及酶促反应条件、关键酶的分离 纯化、酶学性质以及转化酶基因的克隆和表达等方面进行了研究，研究结果如下： 从富含d l a t c 的环境中筛选到一株可转化d l - a t c 合成l 半胱氨酸的菌 株t s l l 3 8 ，利用形态学特征、生理生化特征、g + c m 0 1 、1 6 s r d n a 序列同源性 对t s l l 3 8 菌株进行了初步分类鉴定，结果表明该菌株可能属于恶臭假单胞菌能 够利用d l a t c 转化合成l 半胱氨酸的一个亚种。 将酶法转化生成的产物氧化后利用阳离子交换树脂进行了分离纯化，得到 l 胱氨酸结晶。酶促反应后的产物经比旋光度、d t n b 对巯基的特异性反应、r f 值、紫外扫描图谱以及高效液相色谱进行检测后为l 一半胱氨酸。 培养基中d l a t c 的添加对酶活具有诱导作用。在单因素实验的基础上应用 正交实验对种子培养基进行优化，培养1 6 小时后的t s l l 3 8 菌株，细胞浓度和 酶活力分别比优化前提高2 9 9 和2 3 8 ；确定了摇瓶酶源细胞培养的最佳产酶 培养条件为：培养基初始p h 7 0 一p h 7 5 ，培养温度2 8 。c ，摇瓶装液量5 0 m l 5 0 0 m l ， 振荡速率1 4 0 r r n i n ：利用s a s 软件的p l a c k e t t b u r m a n 设计法和二次响应面分析 法对酶源细胞培养的培养基进行优化，得到了各因素的最佳水平值。在优化条件 下经5 l 发酵罐培养实验表明，细胞酶活力提高2 5 4 。 建立了最佳酶促反应条件：完整细胞酶液( 细胞培养液5 倍渡缩) 在4 3 、 p h 8 0 、d l a t c 底物浓度6 9 l 时，进行酶促反应时转化率最高达到5 9 9 ；超 声波破壁后酶液( 5 倍浓缩) 在3 7 、p h 8 0 、d l a t c 底物浓度为6 9 l 时进行 酶促反应时转化率最高达到7 9 1 。 采用去除核酸、凝胶过滤和离子交换等手段分离纯化得到电泳纯的l a t c 水解酶和l s c c 酰胺水解酶，其分子量分别为3 7 5 k d a 和4 2 8 k d a ，两个酶的 最适反应温度均为3 5 ，最适反应p h 值分别为7 5 和8 o ，均为嗜中温性酶， 在p h 6 0 p h 9 0 的范围内有较好的稳定性。k 。值分别为0 6 7 m m o l l 和 0 1 5 m m o l 几，最大反应速度分别为0 3 9 x 1 0 。3 m m o l lc h i n 和0 4 2 x 1 0 - 3 m m o l lm i n ， 并用薄层层析法证明纯化后的l a t c 水解酶可以转化d l a t c 生成l s c c ，纯 化后的l s c c 酰胺水解酶可转化l s c c 生成l 一半胱氨酸。 以p b l u e s c r i p ts k i i 为载体，以大肠杆菌d h 5 a 为受体菌，构建了t s l l 3 8 菌 株的基因组d n a 鸟枪法随机文库，检验证明文库具有较好的完整性和代表性。 然后以大肠杆菌w 3 1 1 0 c y s b 为受体菌重新构建t s l l 3 8 菌株的基因组d n a 的随 机文库，并建立特异性的筛选模型，从文库中筛选到一株可转化l a t c 为l 一 半胱氨酸的重组菌株。对重组质粒p b m 3 2 中的插入片段进行序列测定，并对测 南开大学博士学位论文中英文摘要 序结果进行分析发现，在3 4 7 2 的插入片段中有两个开放阅读框架o r f l 和o r f 2 ， 长度分别为1 1 0 4 b p 和1 3 7 7 b p ，分别编码3 6 7 个和4 5 8 个氨基酸。 针对o r f l 构建两个重组质粒p e t 2 1 a - o r f b 和p b l u e o r f b ；针对o r f 2 构 建两个重组质粒和p b l u e o r f c 和p e t 2 1 a - o r f c 。将重组质粒p e t 2 1 a - o r f b 、 p e t 2 1 a - o r f c 分别转化大肠杆菌b l 2 l ，经诱导后发现重组质粒中的o r f i 和 o r f 2 均能够得到很好地表达；将重组质粒p b l u e o r f b 和p b l u e o r f c 分别转化 大肠杆菌d h 5 c t ，经诱导后发现o r f l 的表达产物可以催化l a t c 合成l s c c ， o r f 2 的表达产物可以催化l s c c 合成l 一半胱氨酸。由此说明o r f l 编码的产 物为l a t c 水解酶，o r f 2 编码的产物为l s c c 酰胺水解酶。在分子水平上证 明了在t s l l 3 8 菌株中，从d l - a t c 酶法转化合成l 一半胱氨酸经s 一代的途径进行。 与日本s h i b a 和o h m a c h i 报道的假单胞菌b s 和o n - 4 a 菌株从d l a t c 酶法转化 合成l i 半胱氨酸n 一代途径关键酶的基因均有明显差异。 关键词：l 半胱氨酸，酶法转化，假单胞菌，l - a t c 水解酶，s 氨甲酰l 一半胱 氨酸酰胺水解酶，d l a t c ，基因克隆，酶纯化 i i 壹至垄兰鲎主兰堡垒查 茎查! ! ! l a b s t r a c t l c y s t e i n ei s a l le l e m e n t a r ys - c o n t a i n i n ga m i n oa c i d , w h i c hb v eb e e rf o u n d u t i l i t ya sm e d i c i n e r a wm a t e r i a l sf o rm e d i c i n e ，f o o da d d i t i v e ，a d d i t i v ef o rc o s m e t i c s a n df o d d e r i no u rl a b as t r a i np s e u d o m o n a ss p t s 1 13 8t h a tc a l lc o n v e r td l - a t ct o l - c y s t e i n e w a ss e l e c t e d t h e i d e n t i f i c a t i o no fs t r a i n ，v e r i f i c a t i o no fp r o d u c t s ， c o n d i t i o n so fe n z y m ep r o d u c i n ga n de n z y m a t i cr e a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n o fc r i t i c a l e n z y m e sa n dc l o n i n ga n de x p r e s s i o no fg e n e sr e l a t e dt od l a r ch y d r o l y s i sw e r e s t u d i e di nd e t a i l 1 1 1 er e s u l t sw e r ea sf o l l o w as t r a i np s e u d o m o n a ss p t s l l 3 8t h a tc a nc o n v e r td l a r ct ol c y s t e i n ew a s s e l e c t e df r o mt h es o i l c o n t a i n i n gh i g h c o n c e n t r a t i o n d l a t c a n a l y z e d t h e p h e n o t y p i e ，g e n o t y p i ca n dp h y l o g e n e t i ci n f o r m a t i o n t oi d e n f i f yt h et a x o n o m ys t a t u s o f t h es t r a i nt s l l 3 8 b yu s i n g p o l y p h a s i ct a x o n o m y , t h es t r a i nt s l l 3 8p r o b a b l yw a sa s u b s p e c i e so f p s e u d o m o n a s p u t i d a , w h i c h c a l lu s ed l a t ca ss u b s t r a t et os y n t h e s i z e l c y s t e i n e n l ee n z y m a t i cp r o d u c bw e r ei s o l a t e db yi o n - e x c h a n g er e s i n ，a n dt h ep r o d u c t c r y s t a l sw e r eo b t a l n e d t h ed e p u r a t e dp r o d u c tw a si d e n f i f i e dt ob el - c y s t e i n eb a s e d o no p t i c a lr o t a t i o n ，d t n br e a c t i o n ，t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y , u l t r a v i o l e ts p e c t r u m s c a n n i n g a n dh p l c s t u d i e s t h eo p t i m i z e dl e v e l so fs e e dm e d i h i l lw e r eo b t a l n e db yo r t h o p o n a lt e s t t h e s h a k ef l a s kc u l t i v a t i o n ss h o w e dt h a te e l lc o n c e n t r a t i o na n de n z y m ea c t i v i t yi n e r e a s e d 2 9 9 a n d2 3 8 r e s p e c t i v e l ya to p t i m i z e dc o n d i t i o n t h eo 白t i m i z e de n z y m ey i e l d c o n d i t i o n sw e r e ：i n i t i a lp h7 0 7 5 2 8 5 0 m l 5 0 0 m ls h a k ef l a s ka n d1 4 0 r r a i n t w ol e v e lf a c t o r i a l sd e s i g n so fp l a c k e t t b u r m a nw e r ec o n s t r u c t e dt os e l e c tc u l t u r e m e d i u mc o m p o n e n t so ft s l l 3 8 ，f o u ri m p o r t a n tc o m p o n e n t s w h i c hw e r eg l u c o s e t o mi i q u i d u r e aa n dd l a t c w e r es c r e e n e d t h eo p t i m i z e dl e v e lo ft h e s ef a c t o r s w a sd e t e r m i n e d b yr e s p o n s e s u r f a c e a n a l y s i s a t i e r f i v eb a t c h e s c u l t i v a t i o n ， p r e d o m i n a n tv a l u ew a sc o n s i s t e n tw i t hm e a nv a l u eo f v e r i f i c a t i o nt e s t 5 lf e n m e n t e r c t d f i v a t i o n ss h o w e dt h a tc e l le n z y m ea c t i v i t yi n c r e a s e d2 5 4 a to p t i m i z e dc o n d i t i o n t h e e n z y m a t i c r e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e i n v e s t i g a t e d w h e n 5f o i d s c o n c e n t r a t i o ni n t a c te e l l sw e r eu s e da se n z y m es o u r c e ，o p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r e w e r e8 0a n d4 3 ，l l e n5f o l d sc o n c e n t r a t i o ns o n i cc r u s h e dc e l l sw e r eu s e da s e n z y m es o u r c e o p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ew e r e8 0a n d3 7 n ec o n v e r s i o nr a t e w a s5 9 9 a n d7 9 ，1 r e s p e c t i v e l yw h e nd l a t cc o n c e n t r a t i o nw a s 6 9 l t h el a t ch y d r o l a s ea n ds - c a r b a r n y l l c y s t e i n ea m i d o h y d r o l a s ew e r ep u r i f i e d a b o u t8 3 9a n d7 7 4f o l db ys a l t i n g o u tm e t h o d ，s e p h a d e xg - 7 5g e lc h r o m a t o g r a p h y ， d e a e c e l l u l o s e5 2i o ne x c h a n g ea n ds e p h a d e xg l o og e lc h r o m a t o g r a p h y , e t c t h e p u r i f i e de n z y e m e sw e r eb o t hd e m o n s t r a t e db vs d s p a g et ob eah o m o g e n e o u s p r o t e i n t h e i rm o l e c u l a rw e i g h tw e r ea b o u t3 7 5 k d aa n d4 2 8 k d ar e s p e c t i v e l y t h e o p t i m u m r e a c t i o nt e m p e r a t u r ew e r eb o t l l3 5 a n dt h eo p t i m u m p h w e r e7 0a n d8 0 r e s p e c t i v e l y t h ek m o f t h et w oe n z y m e sw e r e0 6 7 r e t o o l la n d0 1 5 r n m o l l ，a n dt h e v m “w e r e0 3 9 x 1 0 - 3 m m o l 几m i na n do 4 2 x 1 0 。m m o l l m i nr e s p e c t i v e l y t h es t r a i nt sl13 8g e n o m er a n d o ml i b r a r yw a sc o n s t r u c t e dw h e np b l u e s c r i p t s k w a su s e da sv e c t o ra n dec o l iw a su s e dh o s ts t r a i n a3 5 k bg e n o m i cd n a i i i 南开大学博士学位论文中英文摘要 f r a g m e n tc o n t a i r t i n gt h eg e n e si n v o l v e di n c o n v e r s i o nd l 掣j ct ol c y s t e i n ew a s c l o n e df r o mt h el i b r a r y t h i sr e c o m b i n a n tp l a s m i dd e n o t e dp b m 3 2 t h en u c l e o t i d e s e q u e n c eo f t h ei n s e r td n ar e v e a l e dt h a tt w oo p e nr e a d i n gf l a m e sr o r y s ) w e r e i n v o l v e di nt h el - c y s t e i n es y n t h e s i sf r o md l - a t cu s i n gs - c a r b a m y l - l - c y s t e i n ea sa i n t e r m e d i a t e t h e s eo r f sw e r ed e s i g n a t e do r f la n do r f 2 r e s d e e t i v e l y o r f la n do r f 2w a sl i g a s e dw i t hp e t - 2 1 a ( + ) ，a n dt h e i rg e n ep r o d u c t sw e r e i d e n t i f i e db yo v e r p r o d u c t i o no fp r o t e i n se n c o d e di ne a c ho r fa n db vs d s p a g e d e r i v a t i v ep l a s m i d sp b l u e o i 强ba n dp b l u e o r f cw e r ec o n s t r u c t e db yi n s e r t i n gm e o r f ba n do r f ci n t o p b l u e s e r i p ts k r e s p e c t i v e l y t h ef u n c t i o n so ft h e s eg e n e p r o d u c t sw e r ee x a m i n e du s i n ge x t r a c t s o fec o l ic e l l s c a r r y i n gt h e s ed e r i v a t i v e p l a s m i d s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t0 r f b e n c o d e dl - a t ch v d r o l a s e w h i c hc a t a l y z e s t h ec o n v e r s i o no fl a t ct o s - c a r b a m y l l c y s t e i n e a n do r f ce n c o d e d s - c a r b a m y l l c y s t c i n ea m i d o h y d r o l a s e ， w h i c h c a t a l y z e s t h ec o n v e r s i o no f s - c a r b a m y l l - c y s t e i n et ol c y s t e i n e i tw a ss h o w e dt h a tt h ep a t h w a y o fl s c ca sa i n t e r m e d i a t e si n c o n v e n i n gd l a = r c t o l c y s t e i n e e x i s t e di np s e u d o m o n a ss p t s l l 3 8 w h i c hi sd i s t i n c t l yd i f i e r e n tw i t h l ep a t h w a yo f l - n c ca sai n t e r m e d i a t e si n p s e u d o m o n a s s p b sa n do n - 4 am p o r t e d b vs h i b aa n do h m a c h i k e y w o r d s ：l c y s t e i n e ，e n z y m a t i cc o n v e r s i o n ，p s e u d o m o n a s ，l a t ch y d r o l a s e ， s - c a r b a m y l l - c y s t e i n ea m i d o h y d r o l a s e ，d l a t c ，g e n e c l o n i n g ， p u r i f i c a t i o no f e n z y m e i v 南开失学博士学位论文 文献综述 第一章文献综述 1 1l 半胱氨酸的分子结构 l 半胱氨酸( l c y s t e i n e ) 是组成蛋白质的2 0 种氨基酸中的一种，属于脂肪 族氨基酸。在蛋白质中l 半胱氨酸常以其氧化型的l 一胱氨酸形式存在，由两个 l 半胱氨酸侧链上s h 基氧化成共价的二硫桥( d i s u l f i d eb r i d g e ) 连接而成。l 半胱氨酸的化学名称为l n 氨基一b 巯基丙酸，最早是于1 8 1 0 年从膀胱结石中 以胱氨酸的形式发现】，其结构式与立体结构式见图1 - 1 和图1 - 2 。 g h s 八p 。h n h 2 l - c y s t e i n e 图1 - 1l - 半胱氨酸的结构式 f i g ，1 - 1t h es t r u c t u r eo f l - c y s t e i n e 1 2 l 一半胱氨酸的理化性质1 q 】 名称：l 一半胱氨酸 化学名称： 分子式： 相对分子质量： 图1 - 2l - 半胱氨酸的立体结构 r i g 1 - 2t h et h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f l c y s t e i n e l q 一氨基一b - 巯基丙酸 c 3 i - i t n 0 2 s 1 2 1 1 2 比旋光度： ( 2 0 d ( h 2 0 ) 一1 6 5 ( d 】2 0 d ( 5 m o l lh c i ) = + 6 5 颜色：白色结晶性粉末 呈味性：异臭，味酸 溶解性：易溶于水，微溶于乙醇 熔点：1 7 6 1 7 8 稳定性： 对酸稳定，而在中性及碱性溶液中易被空气氧化为胱氨 酸，微量铁及重金属可促使其氧化 南开大学博士学位论文 文献综述 等电点( p i ) ： 5 0 2 保存方式：l 半胱氨酸盐酸水合物( c 3 h 7 n 0 2 h c l h 2 0 ) 化学反应性：由于l 一半胱氨酸侧链上的巯基( 一s h ) 极性很强，除具 有所有氨基酸能够发生的化学反应外，还有一些特殊的化学反应： ( 1 ) 与卤化烷如碘乙酸、碘乙酰胺、甲基碘等迅速反应生成相应的 稳定烷基衍生物； ( 2 ) 巯基可以与各种金属离子形成稳定程度不等的络合物； ( 3 ) 可与二硫硝基苯甲酸( d i t h i o n i t r o b e n z o i ca c i d ，缩写为d t n b ) 或 称e l l m a n 氏试剂发生硫醇二硫化物交换反应： ( 4 ) 两分子l 半胱氨酸自身氧化成一分子l 一胱氨酸。 1 3l 半胱氨酸的应用 根据构型的不同，半胱氨酸有l 型、d 型和d l 型之分，而在体内具有生理 活性的为l 型的半胱氨酸。l 半胱氨酸是组成蛋白质的成分之一、是一种c l 氨基 酸，它的存在可以保持蛋白质的稳定性，同一条或不同多肽链两个l 一半胱氨酸 残基间以二硫键( s s ) 连接，使蛋白质具有稳定的空间立体结构【2 1 。l 一半 胱氨酸是构成蛋白质的2 0 多种氨基酸中具有活性硫( 巯基) 的氨基酸，它在医 药、食品、饲料、化妆品等行业具有广泛的用途。 1 3 1 在医药中的应用 在医药上1 4 。 ，l - 半胱氨酸盐酸盐具有促使肝功能旺盛的作用，用于治疗放 射性药物中毒、锑中毒、肝炎、血清病；n 一乙酰l 一半胱氨酸是粘液溶解性祛痰 剂，通过其分子中的s h 能使粘液中粘蛋白的一s s 一键断裂，使粘度迅速下降，在 几分钟内，使痰液易于咳出或吸出，改善呼吸状况，适用于肺合并症的治疗及急 慢性支气管炎、支气管哮喘、支气管扩张、肺结核、肺炎、肺气肿等引起的痰液 稠厚、咳痰困难、气管阻塞等。国外进行外科手术后的病人常使用此药，使支气 管浓稠的痰液化稀，防止咳嗽，以免振动伤口。此外，n 乙酰l 一半胱氨酸的3 水溶液( 囤外称为“阿西丁”) 可治疗角膜炎：可作为稳定剂用于氨基酸输液中。 l 半胱氨酸乙酯盐酸盐可用于肝炎、肝硬化病人，增强肝功能、用于白血球减少 症、放射线所造成的损害。l 一半胱氨酸还具有消炎、止痛、抑制细菌和癌细胞生 长等作用。 南开大学博士学位论文 文献综述 近年来人们发现l 半胱氨酸在生物体内具有一些重要的生理功能。文献口。1 报道，由于直接注入动物体内的l 半胱氨酸在动物体内的l 一半胱氨酸脱巯基酶 的作用下，会被分解为氨、硫化氢和丙酮酸，所以一般把l - 半胱氨酸制成复合 体如无机酸和有桃酸的盐类、不同的酰化物等。动物实验证明将。l - 半胱氢酸和 抗坏血酸形成的复合体注入小鼠皮下，l 半胱氨酸会在鼠肝中蓄积。如果将汞盐 注射在鼠的皮下，立即再将l 半胱氨酸和抗坏血酸复合物也从皮下注入，汞离 子会迅速排出体外。即在生物体内l 半胱氨酸和抗坏血酸复合体解离，并与汞 离子形成复合物排出体外。如果在实验中不注入此复合物，则汞离子长时间在体 内残留，很少排出。 在一些使用甲醛的行业，工作人员会吸入甲醛，大量的甲醛的会导致失明和 发生肝硬化，最终导致死亡。另外，饮酒过量人的体内乙醛含量增加，它可与脑 分泌的多巴胺反应。生成有毒物质，有实验证明将甲醛和乙醛注入小鼠的皮下， 同时注入上述l 半胱氨酸的复合物，二者均不在小鼠的肝中积蓄，而是与l 一半 胱氨酸形成复合物通过新陈代谢迅速排出体外。反之如果不用l _ 半胱氨酸和抗 坏血酸复合物处理，甲醛和乙醛则在肝脏中大量的蓄积，造成中毒。由此可以认 为，l 半胱氨酸在生物体内直接攻击一些有害物质，并将其排出体外，对生物体 起到了保护作用。 研究表明，l 半胱氨酸及其复合体在人和动、植物体内是普遍存在的，它可 以增强各组织和细胞对外来有害物质的抵御能力，另外它还可以增加细胞和组织 的活力【6 1 。鉴于l 半胱氨酸及其复合体的功效，已引起人们对它的关注，近年来 研究认为l 半胱氨酸具有以下几种生理功能： 1 、在生物体内l 半胱氨酸对许多有害物质和毒素如甲醛、乙醛、乙醇、氯仿、 四氯化碳、铅、镉、氯化汞、过氧化酯、河豚毒素等具有有效的解毒作用。 2 、用l 一半胱氨酸可以有效地预防和改善放射性物质对机体的伤害： 3 、l 半胱氨酸在皮肤蛋白的角蛋白生成中具有维持巯基( s h ) 酶的活性，并 且可以补充巯基，维持皮肤的正常代谢。还可以用于治疗人的多种皮肤病( 如通 常的痤疮、荨麻疹、中毒疹、湿疹及肝斑等等) ，另外对农药导致的皮肤炎、农 药中毒及病毒性肝炎等也都具有一定的疗效； 4 、当炎症、过敏时，机体内胆碱酯酶等巯基酶的活性降低，补给l 半胱氨酸 南开大学博士学位论文文献综述 可维持巯基酶的活性，改善炎症和过敏的皮肤症状； 5 、由于l 半胱氨酸具有软化和溶解角质的作用，所以对角质肥厚的皮肤病也 有效： 6 、l 半胱氨酸还具有防止生物体衰老的功能。 最近的研究进一步确认了l 半胱氨酸在体内脏器的分布情况，放射自显影显 示：在口服l 半胱氨酸1 、5 、1 2 h 后j 在肝脏中有相当的量的放射能活性分布， 2 4 h 后仍残存活性。其它主要分布在脾、肾中。另外也有报道说人所摄取的l 半胱氨酸其中一部分能迅速且高浓度地积聚在体表面( 包括皮肤、粘膜、消化器 表面等) 。即具有解毒作用的l 半胱氨酸可积聚在异物入侵的关键部位，以便 对侵入生物体的异物( 包括经口摄取、从大气吸入、从皮肤表面接触侵入的异物) 随时进行处理，以强化生物体自身防卫的能力、加强机体防御机构。 根据国内外文献报道 7 】，l 半胱氨酸衍生物在医药上也有着广泛的用途，如 作为镇咳、祛痰、消炎、退烧、止痛药物及抑制细菌和肿瘤的生长等等。因此， 引起国内外医药界极大的关注。近年来，在医药上应用比较多的衍生物有以下几 种： 1 、半胱氨酸甲酯盐酸盐：l 半胱氨酸甲酯盐酸盐是种疗效明显的镇咳、 祛痰药物； 2 、n 一乙酰l 一半胱氨酸1 8 , 9 】：n 乙酰l 半胱氨酸也是一种有效的祛痰剂，此 外3 n 一乙酰- l 半胱氨酸的水溶液可作眼药水( 国外称为“阿西丁”) 治疗角膜 炎，还可以在氨基酸大输液中作为稳定剂； 3 、n 巯乙酰一l 半胱氨酸【l o ：据1 9 7 9 年日本专利报道，n ，巯乙酰l 半胱氨 酸在体外能降低鸡蛋百和粘蛋白的粘度，因此也可以作为一种祛痰剂； 4 、n 一【d - ( 6 一甲氧基一2 一蔡) 丙酰1 一l 一半胱氨酸：1 9 8 1 年欧洲专利报道，n 一【d ( 6 - 甲氧基- 2 萘) 丙酰卜l 半胱氨酸能抑制老鼠组织和器官的红肿及炎症等疾病。使用 剂量为5 0 毫克公斤体重时，抑制率达5 7 ； 5 、n 乙酰s 水杨酰l 一半胱氨酸：1 9 8 3 年欧洲专利报道，由阿斯匹林( 又称 乙酰水杨酸) 和n 一乙酰l - 半胱氨酸合成n 乙酰s 一水杨酰l 半胱氨酸，既具有 阿斯匹林的退烧、消炎、止痛等作用，又具有n 一乙酰l 半胱氨酸的祛痰作用， 而且这两种作用都有所增强； 南开大学博士学位论文 文献综述 6 、s - 噻吩甲基( 或呋喃甲基) 硫代氨甲酰l 半胱氨酸：该化合物由异硫氰 酸酯和l - 半胱氨酸反应制得，1 9 7 4 年日本专利报道该化合物具有抗菌和抗癌的 作用： 7 、s 甲基一l 一半胱氨酸：s 甲基，l 半胱氨酸可作为抗氧化剂抑制蛋白质和肽 的氧化 1 1 , 1 2 1 ，可作为一种必需氨基酸一蛋氨酸的代用品，无毒，目前被应用于食 品添加剂、化妆品添加剂、医药等各个领域中。 其它的l 半胱氨酸衍生物如s ( n ，n 二甲氨乙基硫代氨甲酰) 一l 一半胱氨酸 ( 具有治疗白血球减少症和关节炎治疗的辅助药物) 、s 磷氯苄蒸半胱氮酸( 用 于皮脂分泌过剩症的治疗) 、半胱氨酰肼盐酸盐及n ，n ，s 三甲基半胱氨酸( 可作 为免疫抑制剂) 等，在医药和临床治疗中都有所应用7 1 。 1 3 2 在食品工业中的应用 i 食品增香剂与发色剂 l 半胱氨酸与六碳糖共热进行m a l l a r d 反应可产生牛肉、猪肉的肉香味，用 作调味剂；在玉米食品加工中加入少量l 半胱氨酸可使玉米香味增加1 0 4 0 倍。 在肉食加工中加入l 半胱氨酸其发色效果优于传统的亚硝酸盐，并可防止产生 具有致癌作用的二甲基亚硝胺( d m n a ) ，猪肉香肠用l 半胱氨酸和氯化钙混 合浸渍处理后，发色效果优于亚硝酸盐【1 3 l 。 2 面包添加剂 l 一半胱氨酸的活性基团一巯基( s h ) 具有特殊的闭塞剂作用，可以使面团 形成立体网状结构。一般面团的成熟必须经过3 5 个小时的酵母发酵，才可使面 粉蛋白质中s s 基产生交换反应形成网状结构，还原剂和氧化剂都可以促进面筋 一s - s 一基的交换反应，利用l 。半胱氨酸的还原作用，可以促进面团谷蛋白的形成 及促进发酵和出模，防止老化( 保鲜) 等1 4 1 ，目前，美国、日本等均己采用。 3 油脂抗氧剂和保鲜剂 1 5 , 1 6 用l 一胱氨酸、l 一半胱氨酸及l 缬氨酸与葡萄糖共加热得到褐色物质，具有 供氢性与还原能力，并且能与铝和锌等离子发生螯合作用，从而封锁金属离子对 油脂氧化的触酶活性作用，有效地防止食品中油脂的氧化变质。例如，油脂中加 入o 0 5 胱氨酸在1 8 0o c ；b n 热3 0 分钟后能防止油脂氧化。半胱氨酸的添加可以有 效地防止和降低食品的褐变，保持维生素c 不受破坏。在压榨果汁时添加l 半 南开大学博士学位论文 文献综述 胱氨酸，可防止维生素c 氧化、果胶沉淀，延长果汁的保存期；目本在奶粉中 使用l - 半胱氨酸，防止奶粉变质。 4 防止食品褐变 l 半胱氨酸可抑制褐色物的生成、变黑反应的中间体还原或者l 一半胱氨酸 钝化褐变反应，以性质稳定的l 半胱氨酸作为添加剂可使产品的营养价值保持 稳定【 j ，可使食品的质量、味道、香味在短时间得到改善。另外l 半胱氨酸对 含有硫化物的洋葱、大蒜等也有增强风味的效果。 1 3 3 在化妆品中的应用 人们发现用l 半胱氨酸生产美白化妆品非常理想，对其开发和使用正处在 迅速地发展中。最近的光医学、光生物学的研究表明：在表皮最下层的色素细胞 可产生底层黑色素造成黑色素沉着，使表皮出现黑斑。色素细胞中所含有的具巯 基( s n ) 基团的l 半胱氨酸，可调节黑色素的生成，因为l 半胱氨酸的巯基( 一s h ) 具有还原能力和化学反应活性。 受到阳光照射后皮肤将会变黑，这是由于在日光的紫外线照射下表皮层的 l 半胱氨酸被破坏起不到阻止黑色素生成的作用。另外人的皮肤表面会产生肝 斑，主要是由于肝功能病变，使皮肤的l 一半胱氨酸含量减少，不能阻止黑色素 产生的缘故。研究表明：l 半胱氨酸也有还原黑色素、消除已经沉着的黑色素的 性能。根据这些研究，采取增加表皮最下层部分的l 半胱氨酸含量就可满足人 们的对“美白”的要求。临床研究表明：内服l 半胱氨酸可以增加体内l 一半胱 氨酸的含量。而涂于表皮的l 一半胱氨酸也可以被表皮吸收，增加表皮最下层部 分的l 半胱氨酸含量。由于内服是全身起作用，用量大并会引起副作用。而用 于局部( 如脸部) 美白的外涂，则用量很少。 上述的半胱氨酸均为l 型的半胱氮酸，因为只有l 一半胱氨酸才具有生理活 性。在作为外涂美白化妆品时，使用的l 半胱氨酸有各种形式，如l 一半胱氨酸 盐酸盐、l 半胱氨酸酯盐酸盐、l 半胱氨酸酯有机酸盐等等，都有很好的效果。 尤其是l 半胱氨酸酯二羧酸盐，其美自效果几乎达到百分之百。所以目前l 半 胱氨酸美白化妆品已引起人们的重视和研究开发 1 8 , 1 9 烫发液的第一液以l 半胱氨酸为主要成分，起还原作用，切断人发中胱氨 酸的二硫键，使头发具有可塑性。经人工卷曲赋形、氧化后又恢复到毛发角蛋白 南开大学博士学位论文文献综述 原来的胱氮酸二硫键结构，外形却形成了种种波浪状。以往使用的还原剂以巯基 乙酸占优势，但有恶臭，并损伤发质及操作者的手指。且前高级卷发液多数改用 半胱氨酸，其优点是臭味低不伤发质，卷衄后发质柔润，颇受欢迎【2 们。 1 3 4 在饲料中的应用 2 1 , 2 2 在饲料添加剂方面，据德国莫勒斯公司( m o e l l e rc o ) 统计? 除了赖氨酸、 谷氨酸与蛋氨酸以外，以l 胱氨酸的用量为最大。由于l 胱氨酸的溶解度太小 ( 在室温时每l 升水中只能溶解o 1l g ) ，所以需制备成l 半胱氨酸才能添加到 饲料中予以使用 1 3 a 4 。 综上所述，l 一半胱氨酸在改善机体的生理功能、医疗药物、食品和饮料工业、 化妆品行业、饲料添加剂行业具有广泛而实际的应用价值，对l 半胱氨酸的研 究和制取已经引起人们极大的兴趣和关注。 1 4l 半胱氨酸的测定方法 l - 半胱氨酸的定性和定量测定方法有分光光度法、纸层析法【2 3 、生物测定法 2 4 。5 1 、电化学检测法( 包括停留流动注射动力学测定法【拥、硅钼杂多酸单扫示波 极谱法【2 7 】和银微盘电极溶出伏安法等) 、氨基酸分析仪和高效液相色谱法等 【2 9 1 。 1 4 1 分光光度法( d t n b 法，酸式茚三酮法) 分光光度法是利用l 一半胱氨酸与特定的显色试剂发生反应，通过测定反应溶 液的光吸收来测定l l 半胱氨酸浓度的方法，该方法简单易行、快速准确。准确 c 0 0 h j h 6 - - c x 2 一s - + 0 2 n 1 - , t h 3 半胱氨酸 j e e h 2 一s s 盎# q o o h 舀s s q n 岛 d t n b c o o h n n 。：斗丐_ 孓n 。： 二 ：= c 0 0 i - z 衍生产物硫硝基苯甲酸 图1 3d t n b 和半胱氨酸的反应方程式 f i g1 - 3t h e r e a c t i o ne q u a t i o no f d t n ba n d e y s t e i n e 南开大学博士学位论文文献综述 性较高的有d t n b 法和酸式茚三酮法。 d t n b 法d o ：d t n b ，全称5 ，5 二硫硝基苯甲酸( d i t h i o n i t r o b e n z o i ca c i d ) ， 或称为e l l m a n 氏试剂，可与l 半胱氨酸发生硫醇二硫化物交换反应( 反应如图 1 3 ) 。反应中1 分子的l 半胱氨酸引起1 分子的硫硝基苯甲酸的释放。它在p h 8 0 时，在4 1 2 n m 波长处有强烈的光吸收，因此可利用比色法定量测定s h 基。该 方法比较特异，在没有其它巯基化合物存在条件下，是一种比较简单可行的方法 3 1 1 。它由g e o r g e l e l l m a n t 3 0 1 首先使用，对包括l 半胱氨酸在内的一些巯基化合 物进行了测定，结果良好。 酸式茚三酮法口2 1 ：茚三酮法是测定q 氨基酸的经典方法之一，它是利用d 一 氨基酸与水合茚三酮共热产生紫色化合物来测定氨基酸3 3 1 。酸式茚三酮法对含巯 基的氨基酸- l 半胱氨酸的检测具有特异性高的优点而被广泛应用3 4 1 。 使用该方法对各种组织( 包括脑、肝、血液等) 中的l 一半胱氨酸进行测定， 结果良好，加标回收率均在9 5 以上。 1 4 2 纸层析测定法【3 s 纸层析法几乎可以对所有2 0 种基本氨基酸进行定性和半定量测定，常用展 开剂为不同比例的“正丁醇：乙酸( 或甲酸) ：水”，样品组分简单时可用单向 层析，复杂时可用双向层析。展层结束后喷洒s g l 的茚三酮的丙酮溶液，在5 0 8 0 。c 显色，根据r f 值对l 半胱氨酸定性。将色斑剪下后溶解于乙醇中即可测 定吸光度，根据标准曲线和回归方程可计算l - 半胱氨酸的含量。 1 4 3 生物测定法 生物测定法也是一种定性和半定量测定l 。半胱氨酸的方法。其原理是利用 啤酒片球菌( p e d i o c o c c u sc e r e v i s i a e ) a t c c8 0 8 1 为测试菌株，该菌株不能合成 l 半胱氨酸，只能利用l 型的半胱氨酸，其生长量( 以6 0 0 n t o 的吸光度计) 与 l 半胱氨酸的加入量呈一定的线性关系。该方法准确性较低，只能作为定性和粗 略定量。 1 4 4 电化学检测法 由于l 一半胱氨酸含有活性巯基，具有良好的电化学活性f 3 5 】，目前已建立了 多种电化学检测方法f 2 “2 引。由于电极易老化致使重现性差，而且需要特殊的电 极和电化学检测器，因此限制了该方法在常规检测中的广泛应用。 南开大学博士学位论文 文献综述 1 4 5 氨基酸分析仪和高效液相色谱法 氨基酸分析仪是将氨基酸在色谱柱内分离后进行茚三酮柱后衍生，利用紫外 一可见检测器进行检测【3 7 】。高效液相色谱对氨基酸的测定通常使用一些柱前衍生 试剂如p i t