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(蔬菜学专业论文)魔芋离体形态发生机制及其繁殖技术.pdf.pdf 免费下载
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文档简介
i i i 1 li ii i i ii l li i i iiil y 18 12 6 4 5 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学伉论文 灶 如需保密,解密时间剀矽年月弓日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究z _ - 作及取得的研究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料,指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明,并表示了谢意。 研究生张钥拟帆砂多年多月,7 日 潲黼鲐识抵摊名:膨彳、 签名帆秒汐乡年6 月f 7 日签名帆砌年多月夕日 注:请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 目录 f 了录1 缩略词表5 摘要6 a b s t r a c t 9 第一章前言1 3 1 1 概j 苤13 1 2 魔芋种芋生产现状及技术发展趋势1 4 1 2 1 魔芋芋种生产中存在的问题1 5 1 2 1 1 魔芋繁殖系数低,种芋不足。1 5 1 2 1 2 种芋农艺性状一致性差,变异及退化严重1 5 1 2 1 3 芋种生产技术落后,随种芋贮运传播的病害日趋严重1 5 1 2 2 魔芋种芋生产技术发展趋势16 1 2 2 1 以现代生物技术为依托,生产健康的魔芋基础种1 6 1 2 2 2 加强专用型品种选育,整体提升魔芋栽培水平1 7 1 2 2 3 建立适宜的供种体系,规范种芋生产1 7 1 3 魔芋组织培养研究进展1 8 1 3 1 外植体的选取1 9 1 3 2 外源激素与愈伤组织诱导及分化2 0 1 3 3 魔芋组织培养过程中内源激素的变化2 1 1 3 4 魔芋植株再生途径及其组织细胞学研究2 1 1 4 组织培养中遗传稳定性研究2 2 1 4 1 影响体细胞无性系变异频率的因素2 2 1 4 1 1 外植体的类型与生理状态2 3 1 4 1 2 培养基及培养方式2 4 1 4 1 3 离体培养时间及继代次数2 4 1 4 2 体细胞无性系变异的分子遗传学机制2 5 1 4 2 1 点突变2 5 1 4 2 2d n a 重复序列拷贝数的变异2 5 1 4 2 3 转座子活化与d n a 甲基化2 6 1 4 3 体细胞无性系变异的检测方法2 6 1 4 3 1 形态学鉴定2 6 1 4 3 2 细胞学鉴定2 6 1 4 3 3 生化鉴定2 6 1 4 3 4 分子标记鉴定2 7 1 4 4 魔芋离体再生植株遗传稳定性研究2 7 1 5 本研究的目的和内容2 8 第二章材料与方法2 9 2 1 试验材料2 9 2 2 试验材料的处理与接种2 9 2 2 1 试验材料消毒处理2 9 2 2 2 培养基及培养条件2 9 2 3 组织学制片2 9 2 4 内源生长物质的提取及检测3 0 2 5 试管苗与试管球茎的田问移栽3 0 2 6 植物基因组d n a 的提取3 0 2 6 1d n a 提取方法3 0 2 6 2d n a 浓度和质量检测3 0 2 7 数据处理。3 1 第三章离体魔芋适宜外植体和培养基的筛选。3 2 3 1 前言。3 2 3 2 材料与方法3 2 3 2 1 试验材料及处理3 2 3 2 2 培养基及培养条件3 2 3 2 3 愈伤组织诱导、分化及再生植株生根3 2 3 2 4 组织细胞学观察3 3 3 - 3 结果与分析3 3 3 3 1 愈伤组织诱导与增殖3 3 3 3 1 1 外植体类型对愈伤组织诱导的影响3 3 3 3 1 2 不同激素组合( n a a 、b a ) 对愈伤组织诱导的影响3 4 3 3 1 3 愈伤组织类型及其组织细胞学特征。3 5 3 3 1 4 不同类型愈伤组织在不同培养条件下的变化3 7 3 3 2 愈伤组织分化。3 8 3 3 2 1 不同类型愈伤组织分化能力比较3 8 3 3 2 2b a 与n a a 组合对i i i 型愈伤组织分化影响3 8 3 3 2 3k t 、z t 和t d z 对i i i 型愈伤组织分化的影响3 9 3 3 3 再生植株生根培养4 0 3 4 讨论4 l 第四章魔芋离体形态发生的组织细胞学研究。4 4 4 1 前言4 4 4 2 材料与方法4 4 4 2 1 试验材料及处理4 4 4 2 2 培养基、培养条件和培养方法4 5 4 2 3 组织细胞学观察4 5 4 3 结果与分析4 5 2 4 3 1 细胞启动部位与愈伤组织形成4 5 4 3 3 球茎器官发生4 8 4 3 4 体细胞胚发生5 0 4 5 讨论5 2 第五章魔芋离体植株形态建成过程内源物质的变化5 4 5 1 前言5 4 5 2 材料与方法5 5 5 2 1 材料5 5 5 2 2 方法5 5 5 2 2 。l 材料接种与培养方法5 5 5 2 2 2 培养基及培养条件5 5 5 2 2 3 内源生长物质提取及纯化5 5 5 2 2 4 内源生活物质的测定5 6 5 2 2 5 数据处理5 6 5 3 结果与分析。5 8 5 3 1 愈伤组织形成过程内源激素含量的变化5 8 5 3 2 愈伤组织分化培养过程中的两种不同的再生方式5 9 5 3 3 拟球茎和不定芽形成过程中内源激素含量的比较6 0 5 3 4 内源生长物质间平衡水平的变化及其与器官发生的关系6 2 5 4 讨 念6 2 第六章魔芋试管球茎形成条件的研究6 6 6 1 前。言6 6 6 2 材料与方法。6 6 6 2 1 试验材料6 6 6 2 2 培养基和培养条件6 7 6 2 3 愈伤组织诱导和试管球茎的形成6 7 6 2 4 试管球茎的增殖6 7 6 3 结果与分析6 7 6 3 1 愈伤组织诱导及i i i 型愈伤组织的选取6 7 6 3 2 试管球茎的形成6 8 6 3 2 1 激素组合对试管球茎形成的影响6 8 6 3 2 2 蔗糖浓度对试管球茎形成的影响7 0 6 3 2 3 光周期对试管球茎形成的影响7 0 6 3 2 4 培养温度对试管球茎形成的影响7 1 6 3 2 5 培养方法对试管球茎增殖的影响7 1 6 4 讨论7 2 第七章魔芋离体再生植株的遗传稳定性研究7 5 7 1 前言7 5 7 2 材料与方法一7 6 7 2 1 试验材料及处理7 6 7 2 2 愈伤组织诱导与植株再生7 6 7 2 3d n a 抽提及纯化7 6 7 2 4r a p d 和i s s r 分析7 6 7 2 5 再生植株的移栽7 7 7 3 结果与分析7 7 7 3 1 愈伤组织诱导、筛选及植株再生与分类7 7 7 3 2r a p d 和i s s r 引物筛选7 8 7 3 - 3 不同群体间的r a p d 和i s s r 分析7 8 7 3 4 不同群体间差异位点的分布8 0 7 4 讨论8l 第八章魔芋试管球茎和试管苗的生长比较8 4 8 1 前言8 4 8 2 材料与方法8 4 8 2 1 材料8 4 8 2 2 试管苗的移栽8 4 8 2 3 试管球茎的种植8 4 8 3 结果与分析。8 5 8 3 1 试管苗移栽成活率8 5 8 3 2 试管球茎萌发率8 6 8 3 3 试管苗与试管球茎所形成的植株之间几个植物学性状比较8 7 8 4 讨论9 0 第九章总结与讨论9 2 9 1 魔芋愈伤组织类型及其与器官发生能力的关系9 2 9 2 试管球茎与不定芽发生的组织细胞学差异9 4 9 3 试管球茎与不定芽发生生理生化差异9 4 9 4 试管球茎形成条件分析9 6 9 5 魔芋再生植株的遗传稳定性分析。9 7 9 6 魔芋试管球茎的应用前景9 8 参考文献10 0 附录l 用于分析魔芋再生植株4 个群体( g o 、g 2 、g 4 和g 7 ) 的r a p d 和i s s r 引 物序列。1 1 4 附录2 魔芋再生植株4 个群体( g o 、g 2 、g 4 和g 7 ) 的r a p d 扩增带数统计1 1 5 附录3 魔芋再生植株4 个群体( g o 、g 2 、g 4 和g 7 ) 的i s s r 扩增带数统计1 1 7 附录4 博士在读期间已发表和正在整理的文章1 l8 致谢。l l9 4 缩略词表 5 摘要 魔芋( k o n j a c ) 是植物界中迄今发现唯一能大量合成葡苷聚糖( k o n j a c g l u c o m a n n a n ) 的高等植物,属天南星科( a r a c e a e ) 魔芋属( a m r o p h o p h a l l u sb l u m e ) , 为多年生草本植物,广泛分布于我国西南山区,具有悠久的栽培和利用历史。魔芋 葡甘聚糖是魔芋地下球茎主要贮藏物质,为一种高分子量碳水化合物,因具有良好 的胶溶性、凝胶性、增稠性、成膜性及与其它植物胶的优良复配性等优点而在食品、 化工、医药保健、环保等领域具有广泛的应用。因此,魔芋具有极高的市场开发和 利用价值。 魔芋为单叶柄支撑的单叶植物,通常利用球茎着生的根状茎进行无性繁殖,其 繁殖系数极低,且多年沿用无性繁殖造成病原菌的积累、种性的退化,进而导致魔 芋产量下降、品质劣化。由于缺乏稳定的良种繁育体系,种芋的数量和质量已经成 为魔芋生产发展的瓶颈。自上个世纪8 0 年代以来,许多研究者试图利用组织培养技 术生产脱毒试管苗,以繁殖种芋,但试管苗因移栽成活率低且对田间管理技术要求 较高,不能实现周年供应和长距离运输等缺点,无法在实际生产中广泛运用。二十 世纪9 0 年代以来,随着对植物变态器官发育机理认识的不断深入,人们在试管中已 成功诱导出了块茎、球茎、鳞茎等营养繁殖器官,其中马铃薯试管块茎生产体系最 为成熟,已经实现了工厂化生产,但有关魔芋试管球茎的研究国内外尚未见报道。 本研究以花魔芋( 么r i v i e r i ) 和白魔芋( 彳a l b u s ) 为材料,对魔芋试管球茎的形成 及魔芋组织培养繁殖方式开展了系列研究,主要结果如下: 1 幼嫩叶柄是魔芋组织培养较好的外植体,愈伤组织形成率高,状态好。m s + i 0 m g ln a a + 1 0m g lb a 适宜于愈伤组织诱导,而m s + 0 5m g ln a a + 0 5m g lb a 有利于愈伤组织增殖。愈伤组织在继代培养过程中可形成3 种不同的类型,即i :水 渍状,半透明;i i :淡黄色,结构疏松;i i i - 浅红或绿色,呈瘤状或球状,结构致 密。在分化培养基上,i 型愈伤组织不能分化出芽,i i 型可分化出不定芽,而i i i 型 可通过拟球茎再生完整植株。这三种类型愈伤组织在特定的培养条件下可相互转化。 组织学观察显示,三种类型的愈伤组织其组成细胞类型明显不同,其中i i i 型愈伤组 织由保守分裂型细胞组成,其细胞中含有淀粉和葡甘聚糖颗粒,是一种半组织化结 构。中等浓度( 1 0 2 0m g l ) 的细胞分裂素( b a 、k t 、z t 和t d z ) 与低浓度( 0 1 1 0 m g l ) 的n a a 配合均能促使i i i 型愈伤组织再生植株。 2 魔芋离体形态建成以器官发生途径为主,拟球茎和芽发生是主要形式。组织 学观察显示,魔芋叶柄无维管组织形成层,维管束外层薄壁在培养过程首先启动脱 分化,进而形成愈伤组织。魔芋形态建成以器官发生途径为主,在特定培养条件下 也可形成体细胞胚,但频率极低,且绝大部分体胚因高度畸形化而不能形成再生植 6 株。魔芋可通过不定芽器官发生途径或拟球茎器官发生途径形成植株,通过拟球茎 形成的植株不需生根培养就具有完整的根系,而不定芽在发育过程中不能直接生根 且植株生长势弱。不定芽和拟球茎均起源于i i l 型愈伤组织的次表皮细胞,这类细胞 在分化过程中首先形成拟分生组织团。拟分生组织团在分化培养中既可直接形成芽 原基,进而发生不定芽,可形成一种中间的球状体,这种球状体具顶芽分生组织, 叶原基不明显,它可进一步发育成拟球茎,进而形成完整植株。 3 内源g a 3 含量增加伴随着不定芽发生,而j a 含量增加伴随着拟球茎发生, 内源激素平衡是器官发生方式的关键调空因素。魔芋叶柄薄壁细胞在脱分化形成愈 伤组织过程中,其内源激素( 队a 、g a 3 、a b a 和j a ) 含量发生了明显的变化。内 源i a a 含量培养初期缓慢下降,1 0 d 后快速上升,3 0 d 后达到平稳。内源a b a 含量 在培养2 0 d 内呈下降趋势,之后迅速上升。内源g a 3 和j a 含量则在整个愈伤组织 诱导过程中迅速下降。研究发现,三种内源激素( g a 3 、a b a 和j a ) 在形成芽和拟 球茎的愈伤组织中含量变化明显不同。内源g a 3 水平在拟球茎发生过程中变动不大, 而在不定芽发生过程中快速上升,其绝对含量也比前者高:内源a b a 在拟球茎发生 过程中基本维持稳定,而在不定芽发生过程中则迅速下降;内源j a 含量在拟球茎形 成过程中呈明显上升趋势,而在不定芽发生过程中变化不明显。只有内源i a a 无论 是拟球茎还是不定芽形成过程其含量均呈下降趋势。内源g a 3 与a b a 和j a 的平衡 水平在两种不同器官发生途径中呈现出明显的差异,但g a 3 j a 差异最为显著,在 两种器官发生途径中其变化趋势完全相反。上述结果说明,魔芋离体器官发生形式 与内源激素变化及平衡水平相关。 4 魔芋试管球茎( 即拟球茎) 的形成受培养基和培养条件的影响。中等浓度的 b a ( 1 o 2 0m g l ) 与低浓度的n a a ( o 1 0 5m g l ) 配合有利于i i i 型愈伤组织形 成试管球茎,其中以m s + 2 0m g lb a + 0 5m g ln a a 表现最佳。在一定范围内提 高培养基中蔗糖浓度有利于白魔芋试管球茎形成,其中6 ( w v ) 蔗糖效果最好。 而花魔芋试管球茎形成所要求的蔗糖浓度较低( 4 ) 。光周期对试管球茎的发生影 响不明显,而培养温度的影响则较大,2 2 条件下,花魔芋和白魔芋试管球茎形成 率、形成个数和单球茎鲜重均达最大值。试管球茎在培养过程可产生次级小球茎以 进行增殖,但自然增殖率较低,通过损伤主芽方法打破主芽顶端优势,可促使次级 小球茎的发生。 5 选择性培养魔芋愈伤组织有助于降低再生植株遗传变异频率。对魔芋i i i 型愈 伤组织进行选择并于适宜培养基上继代培养,弃除状态发生改变的愈伤组织类型, 获得不同培养时期的4 个再生植株群体g o ( 初代培养产生) 、g 2 ( 继代3 次产生) 、 g 4 ( 继代5 次产生) 和g 7 ( 继代8 次产生) 。经两种分子标记技术( r a p d 和i s s r ) 分析显示,g o 群体变异频率最高( r a p d :1 5 6 :i s s r :1 8 o ) ,g 2 、g 4 和g 7 的变异频率依次下降。四个群体中,g o 再生植株的r a p d 差异位点数最多,而其它 三个群体的植株差异位点数较少。i s s r 技术检测的差异位点数比r a p d 技术检测到 的要高,但在四个群体中分布差异不明显。上述结果表明,通过对i i i 型愈伤组织选 择性培养不会导致变异频率增加,魔芋组织培养中的不稳定性主要发生于基因组中 重复区域,造成植株性状改变的可能性较小。 6 试管球茎是建立魔芋繁殖体系的适宜方式,魔芋试管球茎田间生长优势比试 管苗明显。将魔芋试管球茎和试管苗进行田间种植,结果发现,试管球茎和试管苗 均可用作种芋繁殖。但试管苗只在特定的苗龄期时成活率高,且受移栽时温度影响。 试管球茎需要一段时间低温贮藏以完成生理休眠,其植株生长势强,成活率高,体 积大的试管球茎( 重量大于0 5 9 ) 优势更明显。与试管苗相比,由试管球茎产生的 球茎体积大、重量高,更适宜于商品种芋的生产。 关键词:魔芋,器官发生,试管球茎,繁殖 8 a b s t r a c t u pt on o w , k o n j a ci st h eo n l yh i g h e rp l a n to fv e g e t a b l ek i n g d o mt h a tl a r g e l y s y n t h e s i z e sk o n j a cg l u c o m a n n a n ,a ni m p o r t a n t l yi n d u s t r i a lm a t e r i a l k o n j a ci sp e r e n n i a l h e r b a c e o u s s p e c i e sb e l o n g i n gt oa m o r p h o p h a l l u sb l u m e ( a r a c e a e ) a n dw i d e l y d i s t r i b u t e dt h r o u g h o u tt h em o t m t a i n o u sa r e a si ns o u t h w e s tc h i n aw i t hal o n gh i s t o r yo f c u l t i v a t i o na n du t i l i z a t i o n k o n j a cg l u c o m a n n a n ,ah i g h m o l e c u l a r - w e i g h tc a r b o h y d r a t e , i sm a i ns t o r a g es u b s t a n c ei n k o n j a cc o r m d u et oi t se x c e l l e n tp h y s i c o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ,s u c ha sg l u ed i s s o l v i n g ,g e l l i n g ,t h i c k e n i n g ,f i l mf o r m i n ga n dm i x i n gw i t h o t h e rp l a n tg l u e s ,k o n j a cg l u c o m a n n a nh a sh i g hv a l u e sa n di su s e dw i d e l yi nt h ef o o d , c h e m i s t r y , m e d i c i n ea n dh e a l t hp r o t e c t i n g ,a n de n v i r o n m e n tp r o t e c t i o n k o n j a ci sao n e l e a fp l a n tw i t has i n g l ep e t i o l ea n dc o n v e n t i o n a l l yp r o p a g a t e d t h r o u g hr h i z o m e sp r o d u c e db yt h em a i nc o r m sw i t hal o wp r o p a g a t i o nc o e f f i c i e n t 。i n a d d i t i o n , c o n t i n u o u sa s e x u a lr e p r o d u c t i o na c c u m u l a t e sp a t h o g e n si nc o r m st h a tc a u s e s c h a r a c t e rd e g e n e r a t i o na n dh e n c ead r a m a t i cl o s si ny i e l da n dd e g r a d a t i o ni nq u a l i t y d u e t ol a c ko fs t a b l es e e d - c o r mp r o p a g a t i o ns y s t e m ,t h eq u a n t i t ya n dq u a l i t yo fs e e dc o r m h a v eb e e nb o t t l e n e c k sh a m p e r i n gd e v e l o p m e n to fk o n j a cc u l t i v a t i o ni n al a r g es c a l e s i n c e19 8 0 s ,m a n yr e s e a r c h e r sh a v ep a i da r e n t i o nt od e v e l o p m e n to f p l a n tt i s s u ec u l t u r e s y s t e mf o rk o n j a cp r o p a g a t i o nv i au s i n gi nv i t r op l a n t s h o w e v e r ,i nv i t r op l a n t sh a d m a n yd i s a d v a n t a g e s ,s u c ha sl o ws u r v i v a lr a t ea f t e rt r a n s p l a n t a t i o n ,r e q u i r i n ge x t e n s i v e c a r eo ff i e l d m a n a g e m e n ta n di n c a p a b i l i t y o f b e i n gs u p p l i e dy e a r - a r o u n d a n d l o n g d i s t a n c ed e l i v e r s i n c e19 9 0 s ,p e o p l eh a v ea p p r o a c h e dg r a d u a l l yt h em e c h a n i s m so f p l a n ts t o r a g eo r g a nf o r m a t i o n ,a n di n d u c e dm a n ya s e x u a l l yp r o p a g a t e do r g a n si nv i t r o , s u c ha st u b e r , c o r m ,b u l b l e t , e t c a m o n gt h e m ,t h ep r o d u c t i o ns y s t e mo f p o t a t os e e dt u b e r i sm o s tm a t u r ea n dh a sb e e ni n d u s t r i a l i z e d b u tl i t t l ei n f o r m a t i o ni sa v a i l a b l eo nk o n j a c c o r mp r o d u c t i o ni n v i t r o u s i n gk o n j a c 似r i v i v e r ia n da a l b u s ) a se x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s ,w ec a r r i e do u tas e to fr e s e a r c h e so ni nv i t r oc o r mf o r m a t i o na n dp r o p a g a t i o n m e t h o d s t h er e s u l t sa sf o l l o w i n g s : 1 y o n gp e t i o l ew a so p t i m u me x p l a n tf o rk o n j a ct i s s u ec u l t u r ed u et oh i g h 行e q u e n c y o fd e s i r a b l ec a l l u si n d u c t i o n m s + 1 0m g ln a a + 1 0m g lb aw a so p t i m u mf o r c a l l u si n d u c t i o na n dm s + 0 5m g ln a a + 0 5m g lb af o rc a l l u sp r o l i f e r a t i o na n d g r o w t h d u r i n g c a l l u ss u b c u l t u r e ,t h r e e t y p e so fc a l l i w e r ei d e n t i f i e d :i w a t e r e d t r a n s l u c e n t ;i i y e l l o w i s h ,l o o s ei ns t r u c t u r e ;i i i p i n ko rg r e e n i s h ,n o d u l a ro rg l o b u l a r , c o m p a c ti nt e x t u r e o nd i f f e r e n t i a t i o nm e d i u m ,e x c e p tf o rt y p eic a l l u s t y p ei ia n di i ia r e 9 c a p a b l eo fd i f f e r e n t i a t i n gb u d s c u l t u r eo ft y p ei i ic a l l u sc o u l dp r o d u c ec o m p l e t ep l a n t l e t s v i ac o r m 1 i k es 眦t l ep a t h w a y i ns p e c i f i cc u l t u r ec o n d i t i o n s ,t h et y p e so fc a l l ic o u l d c h a n g em u t u a l l y h i s t o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ss h o w e d t h a td i f f e r e n tt y p e so fc a l l ic o m p o s e d o fd i f f e r e n tt y p e so fc e l l s ,o fw h i c ht y p ei i ic a l l u sw a ss e m i - 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