（物理化学专业论文）人camp依赖型蛋白激酶β抑制剂的克隆、表达纯化和性质结构分析.pdf

复旦大学硕士论文 人p d 的克隆、表达纯化和性质结构研究 摘要 c a m p 依赖型蛋白激酶( p k a ) 在许多激素和神经递质的信号传递过程中起着 十分重要的作用。人c a m p 依赖型蛋白激酶1 3 抑制剂( 人p k l0 ) 能抑制p k a 催化亚基的活性。 通过大规模人类c d n a 测序，我们从胎脑c d n a 文库中克隆了人p k ip 基 因。生物信息学分析表明该基因的c d n a 具有1 0 5 7 个碱基，编码具有7 8 个氨 基酸的蛋白，具有两个保守的氨基酸序列：即抑制p k a 催化亚基活性的底物类 似物位点区和富含亮氨酸及疏水氨基酸的出核信号( n e s ) 区。蛋白产物的分子 量为8 4 6 8 2d a ，等电点为4 6 9 。将人p k ib 的编码框亚克隆到表达载体p e t l 5 中，在e c o i lb l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 菌株中获得了高表达。表达产物经过热处理、 硫酸铵沉淀和d e a es e p h a r o s e f a s t f l o w 柱层析，得到了高纯度的人p k l l 3 蛋白 质( s d s p a g e 电泳显示单一条带) 。电喷雾质谱确定了纯化后的蛋白质的分 子量为8 4 6 8 0d a ，说明该蛋白质是人p k i b 。活性分析表明该蛋白质对p k a 的 比活性是6 0 1 0 4u n i t m g ，抑制常数k i 值是0 1 7 3n m 。 我们还对人p k id 进行了结构和功能分析。傅立叶红外光谱、拉曼光谱和圆 二色谱分析结果表明在人p k l0 中含有大量的无规卷曲结构、少量的n 螺旋和b 折叠。这和前人对该类蛋白质的研究结果一致：维持最少的规则的二级结构可以 使该类蛋白质忍受高温和低p h 。c d 热稳定性研究表明人p k i b 在高温时去折 叠变性，而在低温时又重新折叠，这可能是该类蛋白质的热稳定机制。利用 1 s n h 4 c i 取代1 4 n h 4 c i 的m 9 培养基，我们高表达和纯化了1 5 n 标记的人p k i b 。 电喷雾质谱确定了纯化后的蛋白质的分子量为8 5 7 2 0d a ，说明该蛋白质得到均 标记( 标记率达到9 9 以上) 。”n 一1 hh s q c 二维核磁共振谱表明人p k i p 的主链n 上= 的质子主要集中在75 8 5p p m 范围以内，同样说明该蛋白质的 规则的二级结构较少。目前，对1 5 n 一1 hh s q c t c o s y 谱和1 5 n - 1 h h s q c n o e s y 等一系列二维谱的分析归属正在进行中。 关键词：人p k i # ；电喷雾质谱：傅立叶红外光谱：拉曼光谱：圆二色谱；异核标记 二维核磁共振谱。 复旦大学硕士论文 人p k i p 的克隆、表达纯化和性质结构研究 a b s t r a c t s i g n a l i n gt h r o u 曲c a m p d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ( p k a ) i sac o m m o np a t h w a yf o rm a n y c e l l u l a rp r o c e s s e s t h e1 3f o r mo fh u m a nc a m p d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ei n h i b i t o r ( h u m a np k l l 3 ) i so n eo f t h ep r o t e i n s t h a t i n h i b i t t h ec a t a l y t i cs u b u n i to f p k a f r o mah u m a nf e t a lb r a i ne d n al i b r a r y ，w ei s o l a t e do n ec d n a c l o n ee n c o d i n gh u m a n p k l l 3 ， w h i c hc o n t a i n e d1 0 5 7b p t h ep u t a t i v ep r o t e i nc o n t a i n e d7 8a m i n oa c i d s ，a n dt h er e s i d u e sf o rt h e p s e u d o s u b s t r a t es i t e ( r r n a ) a n dn u c l e a re x p o r cs i g n a l ( l x l x l x x l x h y ) a r e c o n s e r v e di nt h e p r o t e i n t h em o l e c u l a rw e i g h ti s8 4 6 8 2d a , a n dp ii s4 ，6 9 ，t h eh u m a np k i 3g e n ew a ss u b c l o n e d i n t ot h e p l a s m i d v e c t o r p e t l 5 a f t e rp c r a m p l i f i c a t i o n t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n i s o v e r e x p r e s s e di n t h eec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s ，a n dt h e np u r i f i e db yh e a tt r e a t m e n t ，a m m o n i u m s u l f a t ep r e c i p i t a t i o na n dd e a ei o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i f i e dp r o t e i ns h o w e da s i n g l e b a n di nt h es d s p a g e t h ee x p e r i m e n t a l m o l e c u l a rm a s s ( 8 4 6 8 0d a ) o b t a i n e db y e l e c t r o s p r a ym a s ss p e c t r u mi s i nc o m p l e t ea c c o r d a n c ew i t ht h et h e o r e t i c a lm a s so ft h eh u m a n p k i 3 ( 8 4 6 82d a ) a s s a yo fp k ia c t i v i t yd e m o n s t r a t e dt h a tp u r i f i e dp g a pi n h i b i t st h ec a t a l y t i c s u b u n i t 。f c a m p d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ( c a p k ) w i t hs p e c i f i ca c t i v i t yo f 6 o 1 0 4u n i t m ga n d k iv a l u eo f 0 1 7 3n m t h e nw es t u d i e dt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no f p k i 3 f o u r i e rt r a n s f o r m e di n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( f t i r ) r a m a ns p e c t r o s c o p ya n dc i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) e x p e r i m e n t si m p l i e d t h a th u m a np k i l 3 c o n t a i n e ds m a l la m o u n t so f - h e l i xa n dbs t r u c t u r e s ，b u tl a r g ea m o u n t so fr a n d o mc o i l a n dt u r n s t r u c t u r e s ，w h i c hm a ye x p l a i ni t sh i g ht h e r m o s t a b i l i t y t h ed e t a i l so fi t sc o n f o r m a t i o n a lc h a n g e s i nr e s d o n s ct oh e a tw e r es t u d i e db yc de x p e r i m e n t s ，w h i c hr e v e a l e dt h a tt h ep r o t e i nu n f o l d e da t h i g ht e m p e r a t u r ea n dr e f o l d e dw h e nd e c r e a s e dt o r o o mt e m p e r a t u r e h u m a np k i 3s h o u l db e i a b e l e df o rn m rs t u d i e s b ys u b s t i t u t i n g ”n h 4 c if o r1 4 n h 4 c l i nt h em i n i m a lm e d i u m ，t h e u n i f o r m l y ”n 1 a b e l e dp r o t e i nw a se x p r e s s e da n dp u r i f i e d t h ee x p e r i m e n t a lm o l e c u l a rm a s s ( 8 5 7 20d a ) o b t a i n e db ye l e c t r n s p r a ym a s s s p e c t r u ms h o w e d t h a tt h ep r o t e i ni su n i f o r m l yl a b e l e d a b o v e9 9 t h ed i s p e r s i o ns e e ni nt h e1 5 n ，1hh s q c i n d i c a t e dt h ep r e s e n c eo fal a r g ea m o u n t o fr a n d o mc o i ls t r u c t u r e ，w h i c hw a sc o m p a t i b l ew i t hp a s td a t ao b t a i n e df r o mc d a n df t i r a n d t h ea s s i g n m e n to fas e r i e so f n m rs p e c t r a i su n d e r g o i n gd o w k e y w o r d s ：h u m a n p k 【b ：m s ；f t i r ；r a m a l ls p e c t r o s c o p y ；c d ：h e t e r o n u c l e a ri s o t o p e ：n m r 4 复旦大学硕士论文人p b 的克隆、表达纯化和性质结构研究 第一部分前言 生物体的生长发育主要受到遗传信息及环境变化的调节和控制。遗传信息 决定了生物体生长发育的基本模式，而其实现则受控于环境因素的刺激。环境因 素包含了生物体的外界环境和体内环境两个方面。随着人类基因组计划和很多模 式生物基凶组测序工作的突破，我们对遗传密码的转录和翻译有了非常深刻的了 解。而环境刺激如何控制着基因表达、细胞增殖、分化和凋亡这一问题，是目前 生物学所面临的巨大挑战。细胞信号转导( s i g n a l t r a n s d u c t i o n ) 所研究的主要内 容，就是细胞感受、转导环境刺激的分子途径及其在生物个体发育过程中如何调 节基因表达和代谢生理反应。细胞信号转导的研究目标，就是要描绘出信息在生 物体内传递的完整的网络图。这就需要我们发现更多的参与细胞信号转导的生物 大分子，并研究其所属的信号途径。细胞信号转导方面的研究进展，为我们最终 破译基因组这部天书提供了可能。 对细胞信号转导的研究发现，在这一过程中，蛋白的可逆磷酸化是生物体 传递信息的基本方式。可逆磷酸化的过程是由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化得以实 现的。本文将就蛋白激酶和蛋白磷酸酶的结构与功能展开详细的探讨，先简单地 回顾一下细胞信号转导的一些基本观点和概念。 1 细胞信号转导 生物体足一个有序的系统。生物体的新陈代谢过程是一个有序的过程，不 但有物质与能量的变化，还有信息流的变化。细胞的增殖、分化和凋亡，是对体 内体外环境信息的应对。这一过程是经由细胞信号转导网络得以实现的。细胞体 内外的信息，以信号的方式刺激细胞，通过细胞信号转导网络，达到调控生物体 新陈代谢、细胞增殖、分化或凋亡的目的 p i t c h e re ta 1 ，1 9 9 8 】。可以说，正是因 为有了信号转导网络，生物体才能不断地适应变化着的体内外环境 p a u le ta 1 ， 1 9 9 7 ；s c h i n d l e r e ta l ，1 9 9 5 ；s t a r ke ta 1 ，1 9 9 8 。 细胞信号可以大致分为以下几类 孙大业等，2 0 0 0 ： 1 生物大分子的结构信号。蛋白质、多糖和核酸等生物大分子具有复杂的三 维空间结构，这种信号包含在构成它们的亚基的顺序信息之中。以生物大 复旦大学硕士论文 人p d 的克隆、表达纯化和性质结构研究 分子结构为基础的分子识别在细胞中具有独特的功能。 2 物理信号。电、光、磁场等物理因素可以在生物体内器官、组织、细胞之 间或其内起信号分子的作用。最常见的例子就是神经细胞通过传播膜电位 这种物理信号来完成信号传递的过程。 3 化学信号。生物体内有许多化学物质，它们既不是能源物质，也不是结构 成分，其主要功能就是传递信息。这类化学信号又可以分为细胞问通讯的 信号分子和细胞内通讯的信号分子两类。细胞间通讯的信号分子又被称为 第一信使，而细胞内通讯的信号分子则被称为第二信使。 化学信号是最复杂的一类信号分子，它们能够引起细胞内的级联反应，主 要是通过一系列蛋白的可逆磷酸化过程，逐级放大信号，最终达到调控细胞生命 活动的目的( 图1 1 ) 。 图1 - 1 细胞信号转导主要途径模式图 孙大业等，2 0 0 0 棱 第一信使，即负责细胞间通讯的化学信号分子，主要包括了内分泌激素、神 经递质、局部化学介导因子以及气体信号分子四大类。第一信使可以通过与细胞 膜上的受体结合并将其激活，直接、或由第二信使介导、或由g 蛋白介导激活 细胞内的信号转导途径，最终达到调控目的蛋白活性或目的基因表达的目的 m o r g a n 1 9 9 7 ；o s u g a e ta 1 ，2 0 0 0 。一些脂溶性的第一信使也可以透过细胞膜， 直接作用于胞内的受体蛋白，达到调控的目的。 6 复旦大学硕士论文 人p l ( i p 的克隆、表达纯化和性质结构研究 由图l - 1 可以看到，化学信号在细胞内的转导是通过一系列蛋白可逆磷 酸化的过程得以实现的。而这一过程是由细胞内的蛋白激酶和蛋白磷酸酶所催化 的。因此对细胞内众多蛋白激酶和磷酸酶的结构与功能研究，是细胞信号转导研 究课题中的重要组成部分。以下，我们将对蛋白激酶的研究作一些回顾。 蛋白的磷酸化和脱磷酸化 蛋白磷酸化反应是指蛋白激酶催化的把a t p 或g t py 位上的磷酸基团转移 到蛋白底物氮基酸残基上的过程。而蛋白磷酸酶则催化这一反应的逆反应。 蛋白的可逆磷酸化在细胞信号转导中占有重要地位。这主要表现在： 1 这种调控方式具有专一应答的特点； 2 酶促反应具有逐级放大信号的优点； 3 此种方式几乎涉及了所有的生理现象； 4 蛋白磷酸化与脱磷酸化可以维持信号的持续性。 先来了解蛋白激酶的研究进展。 3 蛋白激酶分类、结构功能和调节 如前所述，蛋白激酶催化将a t p 或g t py 位上的磷酸基团转移到相应蛋白 底物上的反应。已知的哺乳动物细胞中的蛋白激酶有3 0 0 多种，随着人类基因组 计划的完成，预计人类基因编码了约1 0 0 0 个蛋白激酶基因。一些在模式生物中 得到的数据也为我们提供了一些借鉴。以线虫( c e l e g a n s ) 为例，通过全面分析线 虫基因所编码的蛋白，发现含有蛋白激酶结构域的占到了总数的2 6 p l o w r n a n e ta 1 ，1 9 9 9 1 ，构成了一个数目庞大的蛋白激酶家族。 虽然蛋白激酶种类很多，但它们在结构上有很大的相似性，特别是其催化部 分。图1 2 是根据蛋白激酶在结构上的相似性，用进化树的形式来表示各类蛋 白激酶之间的关系以及它们在进化中的位置。 7 复旦大学硕士论文 人p b 的克隆、表达纯化和性质结构研究 懿氨酸 蛋内激酶 p d c e g f r s r c c d e 7 图1 2 各类蛋白激酶及其在进化中的关系 孙大业等，2 0 0 0 3 3 1 蛋白激酶的分类 目前还没有统一的蛋白激酶分类方法，比较通行的分类方法有以下两种： 1 按照底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基为标准，蛋白激酶可以分为丝 苏氨酸蛋白激酶，酪氨酸蛋白激酶和双特异性蛋白激酶三大类； 2 按照蛋白激酶活性是否受调节为标准，蛋白激酶可以分为信使依赖 型和非信使依赖型两类。 在表1 1 中，我们综合了以上两种分类标准，列举了一些常见的蛋白激酶。 需要指出的是，许多被列入非信使依赖型的蛋白激酶，鉴于其重要的生理作用， 其活性理论上也应该受到严格的调控，也许只是因为我们对其调控方式知之甚 少，才暂时归入非信使依赖型蛋白激酶的行列。至于双特异性蛋白激酶，由于其 数量较少，没有列入表中，将在以后部分中以文字的形式加以讨论。 8 复旦大学硕士论文人p p 的克隆、表达纯化和性质结构研究 表1 - 1 常见蛋白激酶的归类 名称 活性调节物 p k ac a m p p k gc g m p 信使依赖型丝苏血红素依赖型蛋白激酶 血红素 丝 氨酸蛋白激酶c a 2 + c a m 依赖型蛋白激酶c a 2 + ，钙调素 苏 氨 p k cc a 2 + ，磷脂 酸 蛋 双链r n a 依赖型蛋白激酶 d s r n a 白 激 酪蛋白激酶 酶 非信使依赖型丝组蛋白激酶 苏氨酸蛋白激酶糖原合成酶激酶 视紫红质蛋白激酶 酪e g f 受体，胰岛素受体，p d g f 氨 受体酪氨酸激酶 各种细胞因子 酸 受体等等 蛋 白 激 上游酪氨酸蛋白 酶 非受体酪氨酸激酶 s r c ，z a p 7 0 ，j a k ，a b l 等等 激酶 3 2 蛋白激酶的结构和功能 所有的丝苏氨酸激酶和酪氨酸激酶的氨基酸序列中都含有一段比较保守的 催化结构域，由2 5 0 3 0 0 个氨基酸残基组成 h a n k s ，h u n t e r ，1 9 9 5 。这种催化结 构域有3 方面功能：1 ) a t p 或g t p 的结合和定向，有二价阳离子( m 9 2 + 或m n 2 + ) 参与形成这一复合体；2 ) 底物蛋白质或肽的结合和定向：3 ) 催化a t p 或其它核 苷三磷酸的v 磷酸基团转移到受体丝苏氨酸或酪氨酸的羟基上，虽然催化结构域 在每一个激酶氨基酸序列中的位置并不固定，但在大部分单亚基的激酶中，它位 于肽链的羧基端，而氨基端往往作为调节区域 e d e l m a n e ta 1 ，1 9 8 7 。在多亚基激 酶中，催化结构域覆盖整个激酶氨基酸序列的现象也很普遍。 复旦大学硕士论文 人p k l p 的克隆、表达纯化和性质结构研究 通过对已有的蛋白激酶进行序列比较以及对切去部分n 端或c 端后的蛋白 激酶的酶活性分析发现，在催化结构域中，有1 2 个亚结构域( 亚结构域i x i ， 其中亚结构域v i 包含v i a 和v i b ) 的氨基酸序列是十分保守的，包含不变或接 近不变的氨基酸残基，它们被一些低保守的氨基酸残基分隔开。这些高保守的结 构域在激酶活性方面起重要作用。h a n k s 和h u n t e r 对3 7 0 种蛋白激酶的氨基酸 序列进行比较，将保守性在9 5 以上的氨基酸残基作为不变或接近不变的氨基 酸，结合对依赖c a m p 的蛋白激酶仪催化亚基( p k a c a ) 的晶体结构( 图1 3 ) z h e n ge ta l ，1 9 9 3 的分析，发现激酶催化结构域折叠成大、小两叶( 1 0 b e ) 状 结构，小叶包含亚结构域i i v ，与核苷三磷酸的锚定和定向有关，大叶包含 v i a i ，与底物的结合和磷酸基团的转移有关，亚结构域v 则可能是两部分的 联接。 图i 3 c a m p 依赖型蛋白激酶0 c 催化亚基( p k a c a ) 的晶体结构 ( n b c i 编号：e c 2 7 1 3 7 ) p k a ，即受第二信使c a m p 调控的蛋白激酶。随着c a m p 作为第二信使作用 的逐步阐明，一种活性受到c a m p 调控的丝苏氨酸蛋白激酶逐步为人们所认 识。p i c a 是最早被发现受第二信使调控的蛋白激酶。迄今为止，p k a 是成员最 1 0 复旦大学硕士论文 人p k i p 的克隆、表达纯化和性质结构研究 少也是最简单的一类蛋白激酶，对其在生物化学方面的研究也最透彻。p k a 是 由两个催化亚基和两个调控亚基所组成的四聚体。其中调控亚基的分子量为 4 8k d ，催化亚基的分子量为4 0k d 。共发现了3 种催化亚基的同工酶，分别命 名为a ，p 和7 。p k a 分布在细胞质与细胞膜上，其所催化的蛋白底物含有由 l r r a s * g l 组成的保守序列。当各种含氮激素作为第一信使与它所作用的细胞 ( 靶细胞) 膜中的特异受体结合时，这个结合触发并结合在生成的g s 蛋白一g t p 上。受g s g t p 活化的腺苷酸环化酶再去催化a t p 生成c a m p 。作为第二信使 的c a m p 经系列的相关反应一级联放大，即先激活细胞内的蛋白激酶，再进一步 诱发各种功能单位产生相应的反应，c a m p 起着信息的传递和放大作用( 如图 1 - 4 ) 【沈同，生物化学】。 就目前的研究进展来看，p i c a 介导了由c a m p 作为第二信使所引起的绝大 部分细胞生理反应 t a y l o re ta 1 ，1 9 9 0 细胞外液 图1 - 4 激素通过c a m p 起作用示意图 3 3 蛋白质激酶的调节 其中无活性的p k a 全酶是一个四聚体，由两个催化亚基( c ) 和两个调节亚基( r ) 组成在体内激素水平上升或其它一些信号传递因子作用下，腺苷酸环化酶通过 偶联于其上的特异受体而被活化，从而导致细胞内c a m p 浓度上升，此时两个 c a m p 分子结合到p k a 的r 亚基上，从而释放出两个具有磷酸化激酶活性的c 一 霉 复旦大学硕士论文人p b 的克隆、表达纯化和性质结构研究 基。c 亚基进而催化缅胞内系列靶蛋白中的丝氨酸或苏氨酸的磷酸化，将其镦 活或者钝化，从而引起特定的生理效应。 c a m p 依赖型蛋白激酶抑制剂( p k i ) 是细胞内除r 亚基外另一种对p k a 的c 亚基活性润控的物质，与r 亚基不同的是，p k l 对c 亚基的抑制作用不能被c a m p 解除( 图l - 5 ) 。p k i 是一一类耐热、耐酸的小分子蛋白质，它包含两个保守的氨基 酸序列，即与抑制c 亚基活性有关的底物类似物位点及富含亮氨酸及疏水氨基 酸的出核信号( n e s ) ( 图1 6 ) 。 图1 - 5 片断p k i ( 5 2 4 ) 与p k a 催化亚基结合结构域的三维图 ( z h e n g e ta 1 ，1 9 9 3 ) ，图中红色部分表示片断p k i ，紫色部分 表示p k a 催化亚基 z 复旦大学硕士论文人p b 的克隆、表达纯化和性质结构研究 ab 图1 - 6p k io 的两个保守序列区的三维图( h a u e re ta i ，1 9 9 9 ) ( a ) 抑制c 亚基活性有关的底物类似物位点区( b ) 出核信号区 红、黄色部分表示疏水氨基酸 复旦大学硕士论文 人p p 的克隆、表达纯化和性质结构研究 第二部分：人c a 仲一依赖型蛋白激酶1 3 抑制剂 ( 人p k ib ) 的克隆、表达纯化和性质分析 引言 c a m p 依赖型蛋白激酶( p k a ) 在许多激素和神经递质的信号传递过程中起着十 分重要的作用。无活性的p k a 全酶是一个四聚体，由两个催化亚基( c ) 和两个调节 亚基( r ) 组成在体内激素水平上升或其它一些信号传递因子作用下，腺苷酸环化 酶通过偶联于其上的特异受体而被活化，导致细胞内c a m p 浓度上升，此时两个 c a m p 分子结合到p k a 的r 亚基上，从而释放出两个具有磷酸化激酶活性的c 亚基。 c 亚基进而催化细胞内一系列靶蛋白中的丝氨酸或苏氨酸的磷酸化，将其激活或 者钝化，由此引起特定的生理效应。r 亚基除了抑制c 亚基的活性外，还通过与细 胞内的激酶锚定蛋白相互作用，将c 亚基附着在亚细胞结构的特定部位。 t a y l o r e ta 1 ，1 9 9 0 ，k u m a re ta 1 ，1 9 9 7 c a m p 依赖型蛋白激酶抑制剂( p k i ) 是细胞内除r 亚基外另一种对p k a 的c 亚 基活性调控的物质，与r 亚基不同的是，p k j 对c 亚基的抑制作用不能被c a m p 解 除。p k i 是一类耐热、耐酸的小分子蛋白质，它包含两个保守的氨基酸序列，即 与抑制c 亚基活性有关的底物类似物位点及富含亮氨酸及疏水氨基酸的出核信 号( n e s ) 。p k i 除了作为c 亚基的一类竞争性抑制剂，具有很强的亲和性和抑制 效应外，还与游离c 亚基在细胞内的定位有关。p k i 能自由地进入细胞核与c 亚 基形成c - - p k z 复合物，在其出核信号( n e s ) 的作用下，将c 亚基从细胞核转运 到细胞质中。 h a u e re ta 1 ，1 9 9 9 ，w e ne ta 1 ，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ， 在小鼠和其它动物中，已克隆到三种类型的p k i 基因：p k ia 、p k l l 3 和 p k jv 。在小鼠中，p k i 和p k ib 在氨基酸序列上有4 0 同源性，p k y 和p k i n 、p k ib 氨基酸序列的同源性分别为3 5 和3 0 。p k id 基因在心脏、骨骼肌 和脊髓皮质等组织中高表达，p k l0 主要在睾丸组织中高表达，p k iy 在许多组 织中均有表达，尤其是在心脏，骨骼肌和睾丸中有较高表达。 c o l l i n s e ta 1 ，1 9 9 7 在人体中很早就克隆到两种类型的p k i 基因：p k iq 和p k iy 。人的p k i d 是o l s e n 等人于1 9 9 1 年首先克隆成功的 0 1 s e n e ta 1 ，1 9 9 1 ，其编码的蛋白质与 复旦大学硕士论文 人p d 的克隆、表达纯化和性质结构研究 兔子和小鼠的p k iq 氮基酸序列同源性分别为1 0 0 和9 7 。人类p k iy 基因的 全鹾c d n a 由s a i t o t 和c o l l i n s s p 分别于1 9 9 9 年9 月登录到g e n b a n k 中( 登 录号分别为a b 0 1 9 5 1 7 和a f l 8 2 0 3 2 ) ，其编码蛋白质与小鼠p k iy 氨基酸序列有 9 0 同源性。通过查寻u n i g e n e 可知，人的p k i 基因定位于8 号染色体d 8 s 5 2 6 和d 8 s 2 7 5 位标之间，人p k iv 基因定位于2 0 号染色体d 2 0 s 9 6 和d 2 0 s 1 1 9 位标 之间。 最近，复旦大学遗传工程国家重点实验室从自己构建的人胎脑c d n a 文库中， 运用高效差减杂交和大规模测序的方法，克隆到一批新基因，其中有一条全新的 人p k i 基因，它与人的p k iq 和p k iy 基因的氨基酸同源性分别为3 0 和2 3 ， 而与小鼠的p k ib 基因氨基酸同源性为7 4 ，推测是一条人的p k ib 基因。 m a o e ta 1 ，19 9 9 ，z h e n ge ta 1 ，2 0 0 0 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 菌株和质粒 除非特别说明，所有试剂都是分析纯。菌株e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 、表 达质粒p s a ( 上面克隆有人p k ib 基因的质粒) 由复旦大学遗传所实验室保存。 c a m p 一依赖型蛋白质激酶催化亚基、k e m p t i d e ( l r r w s l g ) 购自s i g m a 公司。w h a t m a n e t 3 1 滤纸购自w h a t m a n 公司。各种层析介质均购自a m e r s h a m p h a r m a c i ab i o t e c h 公司。异丙基硫代半乳糖苷( i p t g ) 购自r o c h e 公司。 1 1 2 主要仪器 n e o c o o l 冷冻真空干燥箱，只本y a i a t o 公司产品 e p p e n d o r f5 4 1 5 c 台式高速离心机，德国e p p e n b o r f 公司产品 h e t t i c he b a l 2 r 台式高速冷冻离心机，德国h e t t i c h 公司产品 h i t a c h ih i m a cc r 2 1 型高速冷冻离心机，日本h i t a c h i 公司产品 m i l l i qa c a d e m i c 超纯水仪，美国m i l l i p o r e 公司产品 s c s 一2 4 型温控摇床，上海市离心机械研究所产品 s d j 一超净工作台，上海淀山湖净化设备厂产品 s h 一6 5 0 型微波炉，上海申华微波炉厂产品 复旦大学硕士论文 人p p 的克隆、表达纯化和性质结构研究 3 0 0 型电子天平，美国d e v e n 仪器公司产品 1 1 3 常用试剂配置 0 5m o l le d t a ( p h8 0 ) 溶液：取新领的e d t a ，用干烤过的烧杯和药匙称 取1 4 6 1g ，溶于8 0m 1m i l l i q 的水中，完全溶解后用干烤过的量筒定容 至1 0 0m l 。 2m o l ln a a c ( p h5 o ) ：在干烤过的试剂瓶中秤取n a a c 3 h ：05 4 2 2 g ， 加m i l l i q 水1 5 0m l 溶解，以冰醋酸调节至p h5 0 ，于干烤过的量筒中定 容至2 0 0f f 【1 ，高压灭菌。 1m o l lt r i s h c i ( p h8 0 ) ：于干烤过的试剂瓶中秤取t r i s2 4 2 2g ，加 1 6 0m lm i l l i q 水溶解，加浓盐酸调至p h8 0 ，于干烤过的量简中定容至 2 0 0m l ，高压灭菌。 l b 培养基：蛋白胨1 0g 、酵母粉5g 、n a c l 1 0g ，加8 0 0m ld d h ：0 搅拌至 充分溶解，加5 mn a o h 调p h 值至7 o ，定容至1l ，分装成每瓶1 0 0m l 灭 菌。 l i 固体培养基：l b 培养基分装成每瓶2 0 0m l ，加入3g 琼脂粉后灭菌。 1 0 0m g m l 氨苄青霉素：o 5g 瓶装氨苄青霉素注入5 l 灭菌水充分溶解， 分装于1 5m l 离心管中。 3 0 丙烯酰胺凝胶贮存液：将2 9g 丙烯酰胺和1gn ，n 一亚甲双丙烯酰胺 溶于总体积为6 0m 1 的水中。加热至3 7 溶解，补加水至终体积i 0 0m l ， 用n a l g e n e 滤器( o 4 5 “m 孔径) 过滤除菌，查证该溶液p h 值应不大于 7 0 ，置棕色瓶中保存于室温。 1 5m o l i 。t r i s ( p h8 8 ) ：称取t r i s 碱1 8 1 6g ，加5 0m ld d h z 0 充分溶 解，加浓盐酸调节p h 至8 0 ，加水定容至i 0 0m l ，灭菌。 1m o i lt r js ( p h6 8 ) ：8 0m l 水中溶解1 2 1 lgr r i s 碱，加入浓盐酸调 p h 至6 8 ，加水定容至i 0 0m l ，灭菌。 染色液：乙醇：冰乙酸：灭菌水= 9 ：2 ：9 + 0 2 5 考马斯亮兰 脱色液i ：乙醇：冰乙酸：灭菌水：2 5 ：8 ：6 5 ( 脱色用) 脱色液i i ：乙醇：冰乙酸：灭菌水= l o ：1 5 ：7 5 ( 保存用) 复旦大学硕士论文 人p b 的克隆、表达纯化和性质结构研究 5 t r i s 一甘氨酸电泳缓冲液：1 5 1gt r i s 碱，9 4g 甘氨酸，5 0m l1 0 ( w v ) s d s 溶于9 0 0m l 水中，定容至1l 1 0 过硫酸铵：1g 过硫酸铵溶解于终量为1 0m l 的水中，4 保存。 1 2 方法 1 2 1 序列分析核酸和蛋白质的序列分析采用g e n e r u n n e r 工具软件。使用 n c b i 的b l a s t 2 0h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 进行数据库同源分析。 使用c l u s t a l w 程序( h t t p ：c r i c k g e n e s ，n i g a c j p h o m 0 1 0 9 y c l u s t a l w e s h t m l ) 进行氨基酸序列的同源比对分析。 1 2 2 保守结构域分析把氨基酸序列输入到n c b i 的保守结构域数据库 ( c o n s e r v e dd o m a i nd a t a b a s e ，h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v s t r u c t u r e c d d w r p s b c g i ) 进行保守结构域分析，三维结构由c n 3 d 4 1 ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v s t r u c t u r e c n 3 d c n 3 d w i n s h t m l ) 软件打开。 1 2 3 表达载体的构建以人p k ib 的d n a 作为模板，设计引物为： 5 一c c c c a t a t g a t g a g g a c a g a t t c a t c a a a a a t g 3 ( n d e l ) 茅口5 一c a t g g a t c c t c a t t t t t c t c a t t t t g a g g c 一3 ( f i n d i i i ) ，p c r 扩增人p k ib 基因，p c r 产物经纯化后 用n d ei 和h i n d i i i g 叹酶切，克隆于p e t l 5 表达载体中，测序表明克隆的片段正确 无误。具体操作方法见参考文献。 奥斯伯等人，1 9 9 9 】 1 2 4 人p k ib 的表达p e t l 5 一h u m a n p k ib 转化到叵c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 菌株，接种新鲜平皿上的单克隆转化菌株到1 0 0m l 合成介质培养基中【每升培 养基中含m 9 盐，1 0g 葡萄糖，0 5m g 维生素b 1 ( t h i a m i n e ) ，lm g 生物素( d - - b o t i n ) ，1m g 叶酸( f o l i ca c i d ) ，1m g 维生素b 6 ( p y r i d o x a l ) ，0 1m g 核黄素( r i b o f l a v i n ) ，1m l 的2m o l l 的m g s 0 4 ，3 7 。c 培养过夜。 以0 1 的接种量转自6lm 9 培养基中，3 7 培养到o d 。o o 为0 6 - - 1 0 之间，加入 1 1m 。 l 的i p t g ，3 0 中培养l o 小时。5 0 0 0r m i n 离心l o 分钟收集菌 体，于- - 2 0 保存待用。 s a m b r o o k e ta 1 ，1 9 8 9 】 1 2 5 人p k i1 3 的纯化蛋白的纯化参考j a m e st h o m a s 等人 t h o m a s e t a 1 ， 1 9 9 1 1 的方法，收集的菌体用l o 倍体积的1 0 m m o l l t r i s h c i ( p h 2 8 0 ) ，1m m o l l 复旦大学硕士论文 人p b 的克隆、表达纯化和性质结构研究 e d t a ( p h = 8 0 ) 溶液悬浮，超声波定时脉冲处理，1 5 0 0 0r p m x1 5m i n 离心收集上 清，加入2m o l ln a c i 到终浓度为0 2m o l l ，加入3m o l l n a a c 至终浓度0 1 m o l l ，8 5 水浴3 0 分钟，1 5 0 0 0r p m 1 5m i n 离心收集上清，7 0 ( n h 。) ：s o 。 沉淀，用1 0m m o l lt r i s h c l ( d h - 8 0 ) 透析，然后用1m o l l 的冰醋酸调节 p h 到5 0 ，等待半小时后，5 0 0 0r p m 1 0m i n 离心去除沉淀，收集上清进行d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 柱层析，用5 - 6 0 0r 【i m 的n a a c ( d h = 5 o ) 梯度洗脱，人p k i b 的洗脱峰在4 0 0 5 0 0m m 的梯度下洗脱，分管富集所需的p k i 峰，用s d s - 聚丙 烯酰胺凝胶电泳法测定各组分的纯度 l a e n l r n l ie ta 1 ，1 9 7 0 】，用l o w r y 法测定蛋 白质的浓度 l o l v r ye l a l ，1 9 5 1 1 。 1 2 6 质谱测定人p k ib 分子量纯化后的人p k ib 用p es c i e x 型电喷雾质谱测 定分子量，其质量精度是0 1 ua t 。人p k ib 样品溶解在水中，浓度为5 6 4 m g m l ，进样量为3 0 u1 。 1 2 7 人p k ip 活性测定如w h i t e h o u s e 和w a l s h 所述 w a l s he t a l ，1 9 9 1 】，通 过抑制c a m p 一依赖型蛋白质激酶的催化亚基就可以分析纯化后的p k i 的活性。即 在5 0u l 的管子中，加入0 5 单位纯化的催化亚基，2 5 i i l m 的t r i s h c l ( p h 7 4 ) ， 5 f f i m 的乙酸镁，5t i 】m 的d t t ( 二硫苏糖醇) ，2 0 um 的k e m p t i d e 和0 1i i 】m 【y “p 】 a t p ( 2 0 0c p m p m 0 1 ) 和不同浓度的人p k ib 。反应在3 0 中进行1 0 分钟，然后 等分成2 5ul 进入w h a t m a ne t 3 1 ，滤纸用7 5 州的磷酸冲洗三次，然后用闪烁 仪来检测其反射性。 以上的数据经o r i g i n6 0 数据处理软件处理作图。 复旦大学硕士论文 人p k i p 的克隆、表达纯化和性质结构研究 2 实验结果与讨论 2 id n a 序列克隆和生物信息学分析 大规模克隆得到了一条全长c d n a ，该序列有1 0 5 7b p ，通过g e n e r u n n e r 工 具软件读框分析，发现该基因编码7 8 个氨基酸残基的蛋白质；进一步分析发现 该蛋白理论等电点为4 6 9 ，理论分子量为8 4 6 8 0d a 。读框分析结果如图21 所示： 1 6 l g g g g g t t a t t t t t a g c a a t c t g g c t c a c a e t g a g g g c t t c c t g c t c t a t t c a g c a a a t g t 。 ￥ g c a a a t g g a t g c t g c a g g a c c g t a a c a g t a g a c a t t g a t g a a g a t g t t g c t 黻a g g a c a mrt 1 2 1 g a t t c a t c a a a a 赣g a